This project was partially funded by a FAST (Faculty and Student Team) Award to TPP and JMC from EURECA (Center for Enhancing Undergraduate Research Experiences and Creative Activities) at Sam Houston State University.

Alle Tierversuche wurden unter Genehmigung von IACUC Protokolle durchgeführt, nummeriert 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 und 14-04-17-1018-3-01. 1. Animal Collection, Handhabung und Ethical Pflege <ol><li> Sammeln Sie Gambusia affinis aus dem Feld Website (Bestimmungsführer bei http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) mit einem kleinen Kescher und Platz in 19 L Eimer mit. Verwenden Sie visuelle Inspektion Arten zu identifizieren. </li><li> Rest Fisch für 1 bis 2 d in einem Eimer mit Teichwasser. Danach übertragen Fisch in 76 oder 189 Tanks L Aquarium gefüllt mit Halbteichwasser / Halbleitungswasser bei 25 ° C, belüftet mit einer sprudelnden airstone. Mit einem kleinen Kescher, wenn der Fisch Handhabung als minimal, um ihre Haut microbiome stören. HINWEIS: Fischdichte sollte nicht höher sein als 20 Fische / 38 l Aquarienwasser. Die Fische werden für mindestens 5 d vor dem Experiment in das Aquarium akklimatisiert. </li><li> Feed-Fisch auf einer täglichen Gabe mit 5 mg Flockenfutter pro Fisch. Hold Fisch mit einem 12 h Licht / 12 h Dunkel-Zyklus. </li></ol> 2. Initial Antibiotika Exposition für alle Experimente <ol><li> Zeichnen Sie alle Fische aus jedem Experiment aus dem gleichen Aquarium, legen Sie in zwei getrennte Gruppen (behandelt: ausgesetzt Antibiotikum &amp; Kontrolle: unbelichtet) in 19 L Eimer. Frühere Daten zeigt gesammelt, dass die Fische in der gleichen Aquarium haben Haut microbiomes homogenisiert, die wenig Variation in der Gemeinschaft Zusammensetzung haben. 12 </li><li> Bei Versuchen, halten Fisch in 2 l künstlichen Teichwasser (APW; 0,33 g / l CaCl 2, 0,33 g / l MgSO 4, 0,19 g / l NaHCO 3) , die im Autoklaven vor dem Gebrauch sterilisiert wird. </li><li> Bereiten Sie die Rifampicin Antibiotika-Stammlösung durch Zugabe von 50 mg / ml in Dimethylsulfoxid (DMSO). Rifampicin ist ein repräsentatives Breitspektrum-Antibiotikum, das für die Fische nicht toxisch ist. Bei Menschen und Mäusen, es verteilt sich gut in den Geweben. </li><li> Von der Rifampicin Lager verwalten eine endgültigeKonzentration von 25 ug / ml in 2 l APW für antibiotische Exposition der 3 Tage Fischgruppe behandelt. Beachten Sie, dass nach 3 d, kultivierbaren Haut Bakterienzahlen, die der vorbehandelten Fischhaut ähnlich zurückzukehren. </li><li> Parallel dazu halten eine Gruppe von unbehandelten Fischen in APW und geben eine äquivalente Menge von DMSO (0,5 ml pro Liter APW) in die Wassersäule als Kontrollgruppe zu handeln. </li><li> Wie Versuche sollen Wirkungen eines Antibiotikums veränderten microbiome auf Fisch Phänotypen zu messen, um Effekte direkt aus dem Antibiotikum selbst zu vermeiden, nach der dreitägigen Antibiotika-Exposition (oder Kontrolle) Zeit, Transfer Fisch in einen Eimer mit 2 l frisch APW. <ol><li> Verwenden Sie eine 10 h Ruhezeit so das Antibiotikum durch die Körper der Fische entfernt wird. Basis dieser Eliminationszeit auf Experimente, in denen Fische für drei Tage auf 25 ug / ml Antibiotikum ausgesetzt waren. Euthanize die Fische durch das Rückenmark von Schlacht gefolgt schnippeln, homogenisieren dann den ganzen Körper eine Gewebemühle verwendet wird.</li><li> Bestimmen Sie Antibiotikum Anwesenheit von 50 &amp; mgr; l dieser Suspension nach 0,2 &amp; mgr; m-Filterung in der Mitte einer Agar-Petrischale platzieren. Machen Sie ein Loch für diese Suspension durch ein auf dem Kopf nach unten drücken sterilen 200 ul Pipettenspitze in den Agar, die einen kleinen Stecker entfernt. </li><li> Verwenden Sie Agarplatten mit 20 ml gemessenes Volumen von Nähragar und gleichmäßig verteilt ein Wattestäbchen mit einem Indikatororganismus, Bacillus subtilis, die Rifampicin empfindlich ist. Beziehen Sie die B. subtilis aus einem Nähragar bei 25 ° CO / N inkubiert und das Wattestäbchen mit einer Kolonie zu erhalten. bei 25 ° C eine Hemmzone nach Inkubation über Nacht Beobachtung zeigt das Vorhandensein von Antibiotika in den Fischgeweben. </li></ol></li></ol> 3. Microbiome Extraction <ol><li> Extrahieren einer Haut microbiome Probe aus der äußeren Schleimhaut Epidermis durch den Fisch in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen mit 2 ml sterilem PBST (137 mM Na gefüllt PlazierenCl, 10 mM Phosphat, 0,1% Tween-20, pH 7,4) Lösung und Vortexen bei einer Einstellung von 10 für 1 min mit 10 s Pausieren Inkrementen. Waschmittel und Salz im Puffer fördert eine gleichmäßige Dispersion von Bakterien in der Lösung. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit 0,85% Kochsalzlösung gefunden, aber senkte Bakterienzahlen mit reinem Wasser. </li><li> Bringen Sie den Fisch aus dem konischen Rohr zu einer Erholung Eimer. Die Letalität der Haut Extraktion ist in der Regel weniger als 10%. Entweder, analysieren die Bakteriensuspension in dem Rohr unmittelbar nach Extraktion oder die Bakterien durch einen 2 min Spin in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 15.000 × g und bei -80 ° C für eine spätere Analyse pelletieren. HINWEIS: Alle Kultur und biochemische Analysen sind unmittelbar; DNA oder Proteinextraktion aus gefrorenen Proben sein. </li><li> Um eine gut microbiome Probe zu erhalten, legen Sie zuerst die Fische in eine sterile Petrischale. Euthanize die Fische durch den zervikalen Rückenmark direkt hinter dem Kopf mit chirurgische Scheren Trennen, gefolgt von SchlachtUnd dann sterilisieren extern den Körper mit 70% Ethanol wischt. </li><li> den gesamten Darm nach der Sektion, zu entfernen, nachdem der Speiseröhre und vor dem After durch Schneiden. </li><li> Schneiden Sie den Darm in kleine Abschnitte 1 bis 2 mm in der Länge und legen Sie alle Abschnitte in zwei ml PBST-Lösung in einem konischen Rohr. Nach Vortexen für 1 min, entfernen Überstand in ein anderes sauberes Röhrchen (Vorsicht, um nicht die Darmabschnitte aufstellen). HINWEIS: Der Überstand enthält extrahiert Darmbakterien, die entweder für Hautproben erwähnt durch die bisherigen Verfahren für die direkte Analysen oder pelletiert werden. </li></ol> 4. Infektion Modellvorbereitung und Bad eines spezifischen Pathogen <ol><li> Erhalten infektiösen Stamm von Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) und halten Sie die Kultur bei -80 ° C gelagert. Der Stamm 93-146 in dieser Studie verwendet wurden, isoliert von einem infizierten Wels, wurde von Mark Lawrence, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University erhalten. </li><li> streak E. ictaluri Lager auf ein selektives &amp; Differential Medien genannt E. ictaluri Medien (EIM) Agar 19 zur Kultur der Bakterien und bei 27 ° C für 2 d inkubiert. </li><li> Übertragen einer rein isolierten Kolonie aus der Kultur und impfen einen 150-ml-Kolben, die 40 ml Nährbrühe (NB; 5 g / l Pepton, 4 g / l Fleischextrakt). Danach wird der Kolben in einem Schüttler bei 150 Umdrehungen pro Minute eingestellt für 2 d bei 27 ° C. </li><li> Nach der Inkubation wird eine Probe der Kultur in PBST zu einem Spektrometer Lesen von OD 0,2 bei 650 nm verdünnt für gewünschte Infektionsdosisvolumina E. ictaluri Kultur zu kalibrieren. </li><li> Als nächstes Transfer beide behandelt (nach 3 d der Antibiotika-Exposition) und unbehandelten Fischgruppen in einzelne Plastikbecher, die 130 ml frischem künstlichen Teichwasser oder APW für ca. 10 h für Arzneimittel-Clearance von Fischgewebe. </li><li> Dann aus beiden Gruppen, Transfer wieder jeden Fisch in 8-Unzen-Plastikbecher, die 130 ml sauber APW. </li&gt; <li> Geben Sie jedem Fisch eine tödliche Dosis enthält 2,8 x 10 6 KBE / ml E. ictaluri Kultur in die APW (Bad Infektionsmodell) und halten in einem 27 ° C Inkubator für 24 Stunden. </li><li> Nach dem E. ictaluri Bad, übertragen die Fische einzeln in neue Becher mit 130 ml APW. </li><li> Nach Wasseraustausch, Rekordfischsterblichkeit über die Dauer von einer Woche. Die Fische werden nicht über diesen Zeitraum zugeführt. Im Gegensatz zu Wels, zeigen Gambusia keine äußeren Anzeichen einer Infektion, daher ist es wichtig , die Letalität als experimentelle Endpunkt zu verwenden. </li></ol> 5. polymikrobiellen Herausforderung mit Exkremente &amp; Boden <ol><li> Exkremente Behandlung <ol><li> Erhalten Sie frische menschliche Fäkalien von einem gesunden Freiwilligen unterworfen, die Antibiotika in den letzten zwei Wochen mit sterilen Handschuhen und einer sterilen 50 ml konischen Röhrchen nicht erhalten hat. </li><li> Nach dem Sammeln, sammeln Fäkalien in einem sterilen Beutel aus Kunststoff und übertragen dann in ein steriles 15 ml conical Rohr. Erstellen Sie eine Stammkonzentration von Kot in PBST zu geben, um eine Stammlösung von 500 suspendiert - 800 mg / mL. Diese dicke Mischung ist am besten eine 1 ml oder mehr Kunststoff-Pipettenspitze zu übertragen verwenden, die an der Unterseite mit einer sterilen Schere geschnitten wurde, so dass die Öffnung größer ist. </li><li> Nach anfänglichen Antibiotika-Exposition von behandelten und unbehandelten Fischgruppen steuern, getrennt in einzelne Plastikbecher Fäkalsuspension bei Endkonzentrationen von entweder 15 mg / ml oder 10 mg / ml in APW mit einem Gesamtvolumen von 130 ml enthält. Halten cups in einem Inkubator bei 25 ° C. </li><li> Nehmen Sie die Fischsterblichkeit während fäkale Belastung durch genaue Beobachtung über 2 d. </li></ol></li><li> Bodenbehandlung <ol><li> Sammeln Sie 1 bis 2 kg reichen organischen Krume (sollte die höchste Dichte und Vielfalt der Mikroben enthalten) ca. 7-15 cm nach unten in der Tiefe und in einen sauberen Plastikbehälter. Beachten Sie, dass der Boden sollte innerhalb von zwei Tagen nach der Gewinnung verwendet werden. </li><li> schrecklichctly nach der anfänglichen Belichtungsperiode, trennen die beiden Gruppen von Antibiotikum behandelten und unbehandelten Fisch in einzelne Plastikbecher 18,2 g Boden in 130 ml APW enthält. Mischen Sie den Boden im Wasser gut mit der Hand vor dem Hinzufügen des Fisches. Die meisten der Teilchen nicht suspendieren und am Boden des Bechers zu bleiben. </li><li> Expose Fisch für eine Dauer von 3 d bei 25 ° C und jede Sterblichkeit aufzuzeichnen. </li></ol></li></ol> 6. osmotischer Stress Herausforderung <ol><li> Nach der Behandlung durch eine 10 h Ruhezeit gefolgt, wie oben beschrieben, individualisieren Fisch in einzelne Tassen, enthaltend NaCl bei 17,5 mg / ml (300 mM) in 150 ml APW. Das ist die Hälfte des typischen Salinität des Meerwassers, die nicht vollständig tödlich (&lt;50%) zu steuern Fisch ist, sondern stark belastend und erfordert wirksame osmoregulation. </li><li> Beachten Sie für die Fischsterblichkeit über eine Dauer von 36 Stunden. </li></ol> 7. Nitrat Toxizität Herausforderung <ol><li> Rest Fisch für eine 10-h-Zeitraum nach einer Antibiotika-Exposure, und dann trennen Fisch in einzelne Schalen einer Natriumnitratkonzentration von entweder 10 mg / ml (118 mM) oder 17,5 mg / ml (206 mM) in 130 ml APW enthält. </li><li> Die Bilanz für die Mortalität über 4 d für niedrige Dosis und 1 d für hohe Dosis. </li></ol> 8. Wachstumsanalyse von Fisch Individualisierte oder gruppierte <ol><li> Complete 3 d Antibiotika Exposition oder Kontrollperiode als Gruppen in Eimern. </li><li> Für einzelne, füllen 8-Unzen Styroporbecher mit 150 ml APW jeder Transfer eines einzelnen Fisches in die Tasse und Rekord für die Erstprüfung Gesamtkörpergewicht. <ol><li> Wiederholen Sie dies für alle Arten von Fisch in den beiden behandelten und unbehandelten Gruppen. Verwenden Sie weiße Styroporbecher, anstatt klare Plastikbecher, weil Fische nicht essen, wenn sie in den klaren Tassen. </li></ol></li><li> Fische füttern täglich mit der Standard-Diät von zwei Pellets pro Fisch. Die Pellets wurden eher als Flocken verwendet, weil Pellets geringe Varianz in einzelnen Masse haben (3,53 ± 0,42 mg jeder oder 8% Abweichung), Resul-g in Fisch ähnliche Mengen an Nahrung zu erhalten. Überwachen Sie Verbrauch durch visuelle Aufzeichnung uneaten Pellets. Verbrauchsraten lagen typischerweise über 80%. </li><li> Am Ende jeder Woche über 4 Wochen, bestimmen Fisch Gewicht. Bereiten Sie eine neue Tasse mit frischem APW, auf ein Gleichgewicht, und dann das Gewicht aufgezeichnet. Dann gießen Sie einen Fisch in einem Kescher aus dem ursprünglichen Tasse und Transfer in den neuen Becher, der dann wieder gewogen wird. Die Fische werden nicht Stress zu vermeiden behandelt. </li><li> Für Gruppen, Platz 2 L von APW in einen 19 L Eimer und tarieren. Halten Sie Fisch zusammen in beiden Gruppen, wenn sie in neue APW Eimer übertragen dann Gesamtgruppe Gewicht aufgezeichnet. Nehmen Sie Fischgruppe Gewicht jede Woche über einen Monat Zeitraum von auf einen neuen Eimer zu übertragen. </li></ol> 9. Gut Transitzeit <ol><li> Verwenden Fluorescein-markierten 70 kDa anionischen Dextran. Dextran nicht wesentlich abgebaut und ist zu groß für die Darmschicht absorbiert werden, so werden Durchgang messen Gangszeit durch den Darm.Beschriftete Dextran wurde in Fischfutter eingearbeitet. </li><li> In einem sterilen 1,7 ml-Röhrchen, fügen Sie 360 ​​ul sterilem VE-Wasser und 52 mg Gelatine (13% ige Lösung), und legen Sie den Schlauch auf 60 ° C Wärmeblock, bis die Gelatine schmilzt und vollständig gelöst ist. <ol><li> Grind Goldfischfutter Flocken zu einem feinen Pulver mit einem Mörser und Stößel, und fügen Sie 40 mg dieses Pulvers auf das Rohr, zusammen mit 20 &amp; mgr; l von Fischöl. Nach dem Mischen hinzufügen 1,6 mg FITC-Dextran. </li></ol></li><li> Dispense die heiße flüssige Mischung in 20 &amp; mgr; l auf dem Labortisch auf Parafilm fällt, und lassen Sie sie schnell abgekühlt und verfestigt. Tropfen können für bis zu 4 d gespeichert werden, bevor sie zu hart für Fisch zu essen. Shop fällt im Kühlschrank durch die Parafilm auf die Hälfte einer Petrischale platziert, die dann auf sterilem Wasser in einem verschlossenen Plastikbehälter schwimmt, der die Tropfen befeuchtete hält. </li><li> Kurz vor Fütterung, fällt Quartal in Abschnitte mit einer Rasierklinge. Akklimatisieren die Fische an die StyroSchaumbecher einzeln für 2 Tage ohne Fütterung (Hinweis: Es werden nur unbelichteten Kontrolle Fisch verwendet wurden). Legen Sie vier Viertel des Lebensmittels in die Tasse mit dem Fisch, und beobachten Sie die Fische für 30 Minuten, wie viele Stücke der Nahrung, die sie je essen. </li><li> Um die Überwachungsperiode beginnen, übertragen die Fische einzeln in Becher mit 80 ml APW einen Kescher mit. Jede 2 h vorsichtig schwenken die APW mit der Hand, und dann nehmen Sie eine 1 ml Probe und Speicher in einem markierten 1,7 ml-Röhrchen bei 4 ° C. Proben für 36 Stunden. </li><li> Record Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzspektrophotometer, aller Proben zur gleichen Zeit nach Abschluß des Assays. Legen Sie die gesamte 1 ml Probe in eine Küvette, und notieren Sie die Fluoreszenz unter Verwendung einer Anregung bei 495 nm und Emission bei 520 nm gemessen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Einige Herausforderungen erfordern eine Ruhezeit in einem sauberen APW nach einer Antibiotika-Behandlung für das Medikament in Fischgewebe aufgebraucht werden. Wenn die Ruhezeit übersprungen wird, dann können die Ergebnisse antibiotische Anwesenheit vermengen, insbesondere wenn der Assay Exposition gegenüber Bakterien beinhaltet. Um Effekte aus einer veränderten microbiome Zusammensetzung ohne große Änderungen in der Gesamtzahl von Mikroben auf dem Host, Vorversuche Überwachung microbiome Zusammensetzung (16S Pr...

Es wurde festgestellt, dass Antibiotika können die menschliche microbiome stören zu dysbiosis führt, eine mikrobielle Gemeinschaft Ungleichgewicht bedeutet. Die kompositorische Veränderung der Mikrobiota nach einer Antibiotika - Behandlungen wurde die Vielfalt der Gemeinschaft gezeigt zu senken, wichtige Mitglieder zu reduzieren und Gemeinschaft Stoffwechsel verändern, vor allem im Darm 1, 2. Antibiotic Störung des Darms microbiome kann Kolonisationsresistenz auf Clostridium difficile 3, 4 und 5 Salmonella verringern. Zusätzlich hat die Unterbrechung der Mikrobioten zur Entwicklung vieler Syndromen und Krankheiten bei Menschen in Verbindung gebracht worden (zB Antibiotika-assoziierter Enterokolitis, entzündliche Darmerkrankungen, Stoffwechselstörungen, etc.). Antibiotika sind ebenfalls weit verbreitet in der Landwirtschaft als Wachstumsförderer umgesetzt inVieh und Geflügel Produktion 6. Die Verwendung dieser leistungsfähigen Tools ist nicht ohne Nebeneffekte, die im raschen Anstieg der Antibiotikaresistenz offensichtlich ist, sowie die Auswirkungen eines gestörten microbiome hat mit seinem bewohnter Gastgeber. Viele Studien haben gezeigt, dass Breitspektrum-Antibiotikum Nutzung hat langfristige Folgen für die Struktur und Funktion der Mikrobiota, aber die Nebenwirkungen von einem antibiotika gestört microbiome Auswirkungen auf Host-Physiologie sind nur Spekulationen, die noch unterstützt werden. Das Zusammenspiel zwischen Gastgeber, Mikrobiota und Antibiotika ist bei weitem nicht in prägnanter Weise verstanden zu werden. Daher ist ein einfaches und besser lenkbar Modell vorteilhaft Licht auf die hochkomplexen Säugersystem zu vergießen. Schleimhäuten beim Menschen, einschließlich Darm, Hafen die höchste Dichte und Vielfalt von Mikroben, und auch die intimsten Mikrobe-Wirt-Interaktionen. Die Schleimhaut Haut microbiome Fisch Angebote sehrere Vorteile als Modellsystem. Die Teleostei (Knochenfische) ist eine der frühesten Abstammungslinien innerhalb der Vertebrata Bedeutung zu divergieren , dass teleosts sowohl angeboren haben und erworbene Immunsystem , die eine Beziehung mit symbiotischer Bakterien-Gemeinschaften 7 zusammen entwickelt haben. Fischhaut teilt viele Eigenschaften mit Typ - 1 - Schleimhautoberflächen von Säugetieren, wie physiologische Funktionen, Immunität Komponenten und die Anordnung von Schleim-produzierenden Zellen 8. Die äußere Lage der Fischhaut Schleimhautoberfläche bietet eine microbiome leicht experimentell manipulieren und Probe. Die westliche mosquito, Gambusia affinis (G. affinis), ist ein Modell , Fisch, 9 Paarung und Toxikologie in der Vergangenheit verwendet wurde , für das Studium, 10, 11. In Anbetracht der geringen Größe, Bevölkerung Hülle und Fülle in der Wildnis als eine invasive Spezies, m<html> inimal Pflegekosten und hardy Natur, haben wir G. affinis als Schleimhaut microbiome Modell entwickelt. Ferner teilen Gambusia die Physiologie der Geburt mit viviparous Säugetiere junge leben, die in Fischarten ungewöhnlich ist. Wir haben die umfangreichste Studie zum Zeitpunkt der Fisch normalen Mikrobiota Haut mit 16S Profilierung mit Gambusia 12. Weitere Arbeiten zeigten , drei negative Auswirkungen auf die Host folgende Störung der Haut und der Darmflora mit einem Breitspektrum - Antibiotikum 13. Fünf verschiedene Effekte wurden in der Fisch folgenden Antibiotika Exposition untersucht. Die meisten etablierten Host Nutzen der microbiome ist wettbewerbsfähig Ausschluss von Krankheitserregern. Der Fisch Erreger Edwardsiella ictaluri ist bekannt , 14 Ausbrüche von magensaftresistenten Septikämie in kommerziellen Wels Farmen zu verursachen. E. ictaluri hat auch Zebrabärbling zu letal infizieren gezeigtclass = &quot;xref&quot;&gt; 15, 16 und 17 Gambusia. Eine Herausforderung mit diesem Erreger aus der Wassersäule kann als Maß der Ausgrenzung dienen. Als Vergleich zu Anfälligkeit für einen einzelnen Erreger, Überleben während der Exposition gegenüber einer hohen Dichte von gemischten Organismen wurde ebenfalls durchgeführt. Exkremente und organisch-reichen Boden wurden als häufig angetroffene Quellen mikrobieller Gemeinschaften eingesetzt. Eine andere etablierte Rolle der bakteriellen Darm Gemeinschaft durchführt, ist Nährstoffverarbeitung und Energieertrag, wodurch die Gesamtnahrungsaufnahme für den Wirt zu beeinflussen. Als grobe Messung der Ernährung wurde Fischkörpergewicht im Vergleich vor und nach einem Monat eine Standard-Diät gefüttert. Antibiotika-behandelten Fische als ein durchschnittliches Gewicht verloren, während die Steuerung Fisch im Durchschnitt Gewicht im Laufe des Monats gewonnen. Der Mechanismus für diesen Mangel an Gewichtszunahme ist unklar. Ein möglicher Faktor ist Transitzeit der Nahrung im Darm. Ein GI Motility-Methode wurde von Zebrabärbling (Adam Rich, SUNY Brockpo, persönliche Mitteilung) angepasst Laufzeit zu bestimmen. Es wurde noch nicht bestimmt worden, wenn Antibiotika-behandelten Fische eine veränderte Laufzeit haben. Eine gemeinsame Herausforderung von allen Organismen in der Natur erlebt, vor allem Fisch, ist osmotischer Stress. Gambusia wurden schnell anpassen angezeigt , wenn akut in hohen Konzentrationen von Salinität 18 betont. Überraschenderweise Fisch mit einem Antibiotikum veränderten microbiome zeigte gesenkt Überleben zu einem hohen Salzstress. Der Mechanismus für diesen neuartigen Phänotyp wird untersucht. Eine weitere häufige Belastung auf Wassertiere, insbesondere in Aquarien, ist toxisch Formen von Stickstoff (Ammoniak, Nitrat und Nitrit). Überleben gegen Nitrat war nicht signifikant verschieden zwischen Antibiotika-behandelten und Kontrollfische. Die Methoden in diesem Manuskript präsentiert mit Gambusia oder ähnlichen Fischmodellorganismen wie Zebra verwendet werdenFisch und Medaka, Phänotypen in der Fisch folgenden experimentellen Manipulation zu messen.

<table><tbody><tr><td>Rifampicin</td><td>Calbiochem</td><td>557303-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Nitrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets</td><td>Calbiochem</td><td>6500-OP</td><td>tablets dissolve in water to make PBS</td></tr></tbody></table>

examination of host phenotypes in gambusia affinis following antibiotic treatment

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Ein Gesamtschemadiagramm des experimentellen Systems verwendet , um Fischaufnahmeeffekte aus antibiotischen Belichtungs 13 ist in 1A dargestellt und beinhaltet die Technik zum Extrahieren der Haut (1B) und gut (1C) microbiomes vom Fisch studieren. Drei Tage wurde als Antibiotikum Einwirkungszeit ausgewählt, weil früheren Daten, die zeigt, während die gesamte Haut kultivierbaren Zahl zu Beginn der Behandlung fä...

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Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Diese Studie umfasst Methoden, um Auswirkungen auf ein Modell Fisch-Host folgende Veränderung der Haut und Darm microbiome Gemeinden Zusammensetzung durch ein Antibiotikum zu offenbaren.

Die Prüfung der Host-Phänotypen in<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Nach der Behandlung mit Antibiotika

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

examination-host-phenotypes-gambusia-affinis-following-antibiotic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

7.6K Aufrufe.  Sam Houston State University.  Diese Studie umfasst Methoden, um Auswirkungen auf ein Modell Fisch-Host folgende Veränderung der Haut und Darm microbiome Gemeinden Zusammensetzung durch ein Antibiotikum zu offenbaren. 

Serie: Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Optimierung von GF Zebrafischmodellen: Erzeugung, Pflege und mikrobielle Studien

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

Autor im Rampenlicht: Etablierung keimfreier Zebrafische für Mikrobiota-Wirt-Beziehungsstudien

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Entwicklungsbiologie

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory bowel disease, asthma and arthritis. Thus, understanding the mechanisms underlying microbiota-immune system crosstalk is of crucial importance. Antibiotic administration, while aiding pathogen clearance, also induces drastic changes in the size and composition of intestinal bacterial communities which can have an impact on human health. Antibiotic treatment in mice recapitulates the impact and long-term changes in human microbiota from antibiotic treated patients, and enables investigation of the mechanistic links between changes in microbial communities and immune cell function. While several methods for antibiotic treatment of mice have been described, some of them induce severe dehydration and weight-loss complicating the interpretation of the data. Here, we provide two protocols for oral antibiotic administration which can be used for long-term treatment of mice without inducing major weight-loss. These protocols make use of a combination of antibiotics that target both Gram-positive and Gram-negative bacteria and can be provided either ad libitum in the drinking water or by oral gavage. Moreover, we describe a method for the quantification of microbial density in fecal samples by qPCR which can be used to validate the efficacy of the antibiotic treatment. The combination of these approaches provides a reliable methodology for the manipulation of the intestinal microbiota and the study of the effects of antibiotic treatment in mice.

Here we provide detailed protocols for the oral administration of antibiotics to mice, collection of fecal samples, DNA extraction and quantification of fecal bacteria by qPCR.

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Mit dem Protozoon Paramecium Caudatum als Vehikel für lebensmittelbedingte Infektionen im Zebrafisch-Larven

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail treatment. This Gram-negative bacterium causes gonorrhea exclusively in humans. During infection, it is able to form aggregates and/or biofilms. The minimum inhibitory concentration (MIC) test is used for to determine susceptibility to antibiotics and to define appropriate treatment. However, the mechanism of the eradication in vivo and its relationship to laboratory results are not known. A method that examines how GC aggregation affects antibiotic susceptibility and shows the relationship between aggregate size and antibiotic susceptibility was developed. When GC aggregate, they are more resistant to antibiotic killing, with bacteria in the center surviving ceftriaxone treatment better than those in the periphery. The data indicate that N. gonorrhoeae aggregation can reduce its susceptibility to ceftriaxone, which is not reflected using the standard agar plate-based MIC methods. The method used in this study will allow researchers to test bacterial susceptibility under clinically relevant conditions.

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

A simple ATP-measuring assay and live/dead staining method were used to quantify and visualize Neisseria gonorrhoeae survival after treatment with ceftriaxone. This protocol can be extended to examine the antimicrobial effects of any antibiotic and can be used to define the minimal inhibitory concentration of antibiotics in bacterial biofilms.

Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus Sporen zur Analyse von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Einzelkopien-Genexpression zur Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Antibiotikaresistenzforschung mit einem Efflux-defizienten Bakterienstamm und einem Single-Copy-Genexpressionssystem

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Die Prüfung der Host-Phänotypen in

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Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

Mit dem Protozoon Paramecium Caudatum als Vehikel für lebensmittelbedingte Infektionen im Zebrafisch-Larven

Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung

Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus Sporen zur Analyse von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen

Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems