Dieses Projekt wurde teilweise durch einen Zuschuss für National Institutes of Health NIAID (für AJB und LGA, R01 AI076246) unterstützt. Die Salmonella-Mutante Sammlung wurde teilweise von der National Institutes of Health Zuschüsse (für MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 und R01 AI039557-11 AI075093-01), teilweise von der National Institutes of Health Zuschüsse (für HAP, R21 unterstützt AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Wir danken Steffen Prowollik für Replikaplattierung und Bestätigung der Mutanten in der Sammlung.

1. Murine Makrophagen RAW264.7 Zellkultur <ol><li> Wachsen niedrige Durchgang Nummer murine Makrophagen, RAW264.7 (ATCC ® Nummer, TIB-71) in einem T-75 Zellkulturflasche abgelassen Filterkappe in Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) , 0,5% NaHCO 3 und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren 100x (NEAA) bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Sobald Zellen erreichen eine 60-80% Konfluenz in den Kolben, mit einem Zellschaber, um Zellen zu ernten, und zählen Sie die Zellen in einer Hämazytometer und berechnen die Zellkonzentration. </li><li> Die Zellen und die Zellkonzentration verdünnt in 2,5 x 10 5 / ml in frischem DMEM-Zellkulturmedium. Mehrkanalpipetten verwenden, um 200 ul DMEM-Zellkulturmedium, enthaltend 5 × 10 4 Zellen in jeder Vertiefung der 96-Well-Zellkulturplatten zu plattieren. </li><li> Platte vier Vertiefungen jeder Salmonella Stamm. Drei getrennte Platten für einen Satz gesetztvon Fresszellen Invasion Assay, und markieren Sie diese mit &quot;Verein&quot;, &quot;Invasion&quot; und &quot;Replikation&quot; auf. </li><li> Platzieren der Platten in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C auf, damit die Makrophagen-Zellen auf den Boden der Vertiefungen anzubringen. </li></ol> 2. Herstellung von Salmonellen Wildtyp-und Mutanten <ol><li> Am selben Tag der Aufstellung des Makrophagen RAW264.7 Zellen, nehmen einzelne Kolonien von Wildtyp (WT) Salmonella enterica Serotyp Typhimurium 14028s, DinvA Mutante DphoP Mutante und die gewünschten Test-Mutantenstämme, und Kultur sie in Luria Bertani-( LB) Brühe mit Antibiotika und gegebenenfalls ergänzt. Verwenden jedes Satzes der Phagozyten Invasionsassays zu testen bis 10 Mutantenstämme (DinvA mutierten und mutierten DphoP sind Invasion und intrazelluläre Replikation defekt, beziehungsweise). </li><li> Wachsen die Bakterien für 14 Stunden bei 37 ° C mit sHAKING bei 220 rpm in LB-Medium je 5 ml in 14 ml lose verschlossen Polypropylen in einer Röhre mit rundem Boden. LB-Medium enthält geeigneten Antibiotika, in unserem Fall sind die meisten der Mutanten-Stämme resistent gegen Kanamycin, 50 ug / ml </li><li> Am nächsten Tag, Subkultur jeder der EIN-Kulturen von Salmonella-Stämmen in Klar 5 ml LB-Brühe in einem Verhältnis von 1:50 für weitere 4 h unter Schütteln bei 220 UpM. </li><li> Lesen OD 600-Werte jedes Bakterienkultur auf einem Spektrophotometer, und jede Lese sollte 0,6 bis 1,2 reichen, um Salmonellen Pathogenität Insel-1-Typ-III-Sekretionssystem (SPI-1 TTSS) Genexpression für die Invasion zu optimieren. </li><li> Verwenden der Formel von 1 OD 600 = 7,5 x 10 8 CFU / ml, um die Bakterienkonzentration zu schätzen, dann verdünnte Bakterien in einer Konzentration von 5 x 10 6 KBE / ml in frischem DMEM-Zellkulturmedium. </li></ol> 3. Invasion Assay in 96-Well-Kulturplatte <ol><li> Entfernen Sie die drei 96-Loch-cell Kulturplatten aus dem CO 2-Inkubator und waschen jeweils auch einmal mit 200 ul 1x PBS-Puffer. </li><li> Nach dem Waschen und vollständige Entfernung von PBS, 200 ul Bakterien in DMEM-Medium (siehe oben) in jedes Well. Dies führt zu 1 x 10 6 Salmonella-Zellen in jede Vertiefung und Multiplizität der Infektion (MOI) von 20: 1 beträgt. </li><li> Zentrifugieren der Platten bei 1000 × g in einem verschlossenen Träger für 10 min, dann ersetzen Platten (Zeit Null) in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 30 min. Für jeden Stamm, richtet mindestens vier zwei Vertiefungen. </li><li> Nach 30 Minuten, entfernen Sie Platten aus dem Inkubator und dreimal mit 200 ul 1x PBS auf unassociated Bakterien zu entfernen. </li><li> Nach dem Waschen, speichern Sie die Platte mit &quot;Verein&quot; für die weitere Behandlung gekennzeichnet. Fügen Sie 200 ul DMEM-Medium mit 100 ug / ml Gentamicin in jede Vertiefung der mit &quot;Invasion&quot; und &quot;Replikation&quot; markiert Platten, um to töten die extrazelluläre Salmonellen. Bringen Sie die Platten bis 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für eine zusätzliche Stunde. </li><li> Zu retten und von jedem infizierten Belastung für die Aufzeichnung von Makrophagen-Zellzahl, behandeln den Rest der Brunnen auf dem &quot;Verein&quot; Platte mit 200 ul 1x PBS mit 1% Triton X-100 für 10 min. Die Triton-Lösung Makrophagenzellen lysieren und damit verbundenen Salmonellen. </li><li> Ernte Salmonellen aus jeder Vertiefung und legen Sie sie in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Führen Sie drei 10-fach serielle Verdünnungen mit 900μl 1x PBS auf den geernteten Proben aus jeder Vertiefung wird Wirbel zwischen jeder Verdünnung durchgeführt. </li><li> Platte der dritten Verdünnung, 10 -3, entweder auf LB (WT) oder LB-Kan (Mutanten)-Platten. Beschriften Sie die Platten mit entsprechenden Salmonella Stamm Name, Verdünnungszahl, Zeitpunkt und Datum. </li><li> Nach Vortexen des dritten Verdünnungsröhrchen, verzichten 10 ul Probe auf der Oberfläche des Agars und Wiederholen funserer Zeit für insgesamt 5 Tropfen. Achten Sie darauf, den Raum der fünf 10 ul Tropfen gleichmäßig auf die Petrischale Platten 7. </li><li> Nach den Tropfen in den Agar einweichen, drehen die Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Gönnen Brunnen für die Zählung von Makrophagen mit 150 ul 1xPBS mit 0,25% Trypsin-EDTA für 10 min gespeichert. </li><li> Nach Trypsinierung, Ort Makrophagen in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und behandeln sie mit 50 ul FBS zu Trypsin / EDTA-Lösung zu neutralisieren, färben die Zellen mit 0,4% Trypanblau und Gäste sie unter Anwendung Hämazytometer. </li><li> Wenn die eine Stunde Inkubation abgelaufen ist, entfernen Sie die &quot;Invasion&quot; und &quot;Replikation&quot; Platten aus dem CO 2-Inkubator, und waschen jedes sowie &quot;Step 3.4&quot;. </li><li> Speichern Sie die &quot;Invasion&quot; Platte für die weitere Behandlung als &quot;Schritt 3,6-3,12&quot;. </li><li> Gib 200 ul DMEM-Medium mit 10 ug / ml Gentamicindie &quot;Replikation&quot; Platte Abstand von extrazellulären Salmonellen in dem Medium zu erhalten. Bringen Sie die Platte auf 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für eine zusätzliche 22,5 Stunden. </li><li> Am nächsten Tag nehmen Sie die &quot;Replikation&quot; Platte von 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator, und waschen jedes sowie &quot;Step 3.4&quot; und behandeln sie als &quot;Schritt 3,6-3,12&quot;. </li><li> Schließlich entfernen Sie die Agar-Platten nach der Inkubation über Nacht im 37 ° C Inkubator und Gäste die Anzahl der Bakterienkolonien. </li><li> Eine gute Verteilung Kolonie sollte zwischen 10 und 100 Kolonien, enthält jede Stelle etwa 2 bis 20 Kolonien, wäre es schwer zu punkten, wenn es mehr als 20 Kolonien auf einem Fleck. Wenn die Zählung zu niedrig oder zu hoch ist, Ausstrich der Probe mit 10-fach höhere oder niedrigere Verdünnungen nach Bedarf. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Berechnen Sie die KBE (Koloniebildung Einheiten pro ml) jeder Platte auf der Basis der BeschichtungVolumen und Verdünnungsfaktor. </li><li> Ermitteln Sie die Anzahl der Salmonellen pro Makrophagen durch die Makrophagen aufgenommen Zellzahl von jedem Stamm. </li><li> Berechnen Sie die geometrischen Mittel der KBE pro Makrophagen aus mindestens drei unabhängigen Experimenten für die Zellverband, Invasion oder Replikation bzw. normalisieren und weiter nach WT für den relativen Wert. </li><li> Analysieren Sie die Daten für die Assoziation, Invasion und Replikation von Student-t-test bzw. indem jeder Stamm WT, und bestimmen Sie die statistische Signifikanz von p-Wert. </li></ol>

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	<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics.">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li><li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein.">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li><li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells.">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li><li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Salmonella+survive+against+the+odds.">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. 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J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium.">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li><li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves.">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li><li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Die Gentamicin-Schutztest wird häufig eingesetzt, um das Eindringen und die Vermehrung von intrazellulären bakteriellen Krankheitserregern im Wirtszelle zu untersuchen, und es ist insbesondere ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung biologischer Pathogene wie Salmonellen, deren Einfall ist die Voraussetzung für die Festlegung Schritt 1 Infektion. Die Standard-Gentamicin-Schutztest bei Salmonella-Forschung wird in 24-Well-Kulturschale 5 implementiert. Obwohl die Verwendung ...

Nontyphoidal Salmonellen sind wichtige Ursachen von Darmerkrankungen in allen Wirbeltieren. Salmonellose beim Menschen ist unter den Top bakterielle lebensmittelbedingten Erkrankungen ein. Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen von Salmonella mit ihrer tierischen Wirte unterstützen wird hauptsächlich durch die Untersuchung von Salmonella enterica-Serotyp typhimurium (STM) in der Gewebekultur und Tiermodellen der Infektion erreicht. Einblicke in STM-Wirt-Interaktionen wird uns helfen, zu verstehen, wie Salmonellen überleben und wachsen in Wirtszellen. Die erste Herausforderung bei der Untersuchung dieser Wechselwirkungen ist, so viele teilnehmende Faktoren wie möglich von beiden Wirt und Pathogen zu identifizieren, aber diese Bemühungen sind weitgehend durch den erheblichen Schwierigkeiten im Umgang mit zwei unabhängigen komplexen biologischen Systemen gleichzeitig, dh, Host-und Salmonella behindert, unter physiologischen Bedingungen. Zusätzlich ist die große repertOire von Salmonella und Wirtsgene möglicherweise Faktoren in Wirt-Interaktionen beteiligt Codierung erfordern Hochdurchsatz-biologische Plattform, um diese Herausforderung zu bewältigen. Eine modifizierte, standardisierte Test mit Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Makrophagen, die mit Hochdurchsatzkapazität Phänotyp wurde entwickelt, um eine große Gruppe von Genen wahrscheinlich Beteiligung an Salmonellen -host Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Gentamicin-Schutz-Assay wurde im Jahr 1973 2 entwickelt, wurde aber zunächst gründlich von Elsinghorst 1994 3,4 beschrieben. Es wurde nun ein Standard-Werkzeug für die Untersuchung viele intrazelluläre bakterielle Erreger ex vivo, einschließlich Salmonellen 5,6 geworden. Verinnerlicht Bakterien zu vermeiden, die von einigen Antibiotika, wie Gentamicin, die nicht eukaryotischen Zellen eindringen kann 3 getötet. Durch Ausnutzung dieses Phänomens, misst die Gentamicin-Schutz-Assay, das Überleben und das Wachstum von intrazellulären bacterial Krankheitserreger. Drei Ereignisse, die während der Infektion, das heißt zusammen mit eukaryotischen Zellen, Invasion und Replikation können für die intrazelluläre bakterielle Pathogene auf der Basis des Zeitintervalls zwischen der Infektion, Gentamicin-Behandlung und eine weitere Inkubation (1) ausgewertet werden. Eukaryotische Zelllinien eine physiologische Umgebung, die weniger komplex als relevanten Tiermodellen für Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien ist. Die Gentamicin-Schutz-Assay ist eine geeignete Plattform, um STM-Wirt-Interaktionen zu studieren, aber die Standard-Assay in einer 24-Well-Kulturschale hat eine geringe Durchsatzkapazität. Computergestützte Analyse in vivo Datensätze identifiziert 149 Salmonella-Genprodukte, die voraussichtlich mit rund 300 Gast Genprodukte (unveröffentlichte Daten) zu interagieren. Die Standard-Gentamicin-Schutztest hat nicht die Fähigkeit, diese Anzahl von Mutanten effizient Phänotyp. In additIonen, die Gentamicin-Schutz-Assay kann theoretisch die Invasion auch nur eines einzigen Bakterium erkennen. Wegen dieser inhärenten Empfindlichkeit sind die Rohdaten anfällig für technische Abweichungen, wenn zu verschiedenen Zeitpunkten wiederholt. Die internen Kontrollen und die relative Darstellung der Daten nach der Normalisierung sind für sinnvolle Interpretation der Ergebnisse. Angesichts dieser Überlegungen wurde eine modifizierte, standardisierte Gentamicin Protection Assay entwickelt, um Testkapazität erhöhen und die Präzision. Das folgende Protokoll ist eine detaillierte und illustrierte, um die geänderte Gentamicin-Schutz-Assay unter Verwendung von 96-Well-Kulturschalen und die murine Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 durchzuführen. Im Vergleich zur Standard-Protokoll in 24-Well-Kulturschalen hat die modifizierte Protokoll die folgenden Vorteile: 1) unter Verwendung von 96-Well-Kulturschalen können bis zu 10 verschiedene Mutantenstämme phänotypisiert werden einschließlich der internen positiven und negativen Kontrollen mit ausreichender statistischer Power;2) Die Varianz der Ergebnisse wird deutlich reduziert, da die Mutantenstämme sind in der gleichen Kulturschale und zur gleichen Zeit getestet; 3) Die Verwendung von Mehrkanalpipetten erhöht den Durchsatz und reduziert Ermüdungserscheinungen. Schließlich Vergleich zu 24-Well-Kulturschalen wurden Bedenken von weniger Wirtszellen pro Well in 96-Well-Kulturschale durch Protokolloptimierung und Standardisierung gerichtet. Zusammenfassend ist die modifizierte, standardisierte Test zur in-vitro-Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen erhöht die Präzision und erreicht Hochdurchsatzleistung bei gleichzeitiger Reduzierung Ermüdung des Bedieners.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11965</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:173px;">HyClone</td>
			<td style="width:173px;">SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">T-75 cell culture flask vented filter cap</td>
			<td style="width:173px;">Nest Biotechnology</td>
			<td style="width:173px;">708003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">100X Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">96-well cell culture plate</td>
			<td style="width:173px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:173px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:173px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:173px;">3002-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">PBS pH7.4 (1x)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Kanamycin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">K0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

Salmonella-Arten sind Zoonoseerreger und führenden Ursachen von lebensmittelbedingten Krankheiten bei Mensch und Vieh 1. Das Verständnis der Mechanismen Salmonellen -host Interaktionen zugrunde liegen, sind wichtig, um die molekularen Pathogenese der Salmonellen-Infektion aufzuklären. Die Gentamicin-Schutztest auf Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen Phänotyp angepasst, damit Hochdurchsatz-Screening, um die Rollen der Deletionsmutanten von Salmonella enterica Serotyp Typhimurium in Wirt-Interaktionen mit RAW 264.7 Makrophagen Maus definieren. Unter diesem Protokoll, die Varianz bei Messungen, verglichen mit dem Standardprotokoll erheblich reduziert, da Wildtyp-und Mutantenstämmen mehrere in der gleichen Kulturschale und gleichzeitig getestet werden. Die Verwendung von Mehrkanalpipetten erhöht den Durchsatz und erhöht die Präzision. Darüber hinaus betrifft die Verwendung weniger ho bezogenenST-Zellen pro Well in 96-Well-Kulturschale angesprochen. Hier wurde das Protokoll des modifizierten in vitro-Assay mit Salmonella Invasion Fresszellen erfolgreich eingesetzt, um 38 Einzel Salmonellen Deletionsmutanten für Verein, Invasion und intrazellulären Replikationsphenotyp. Die in vitro-Phänotypen vorgestellt, von denen einige später bestätigt Phänotypen in vivo in einem Tiermodell zu haben. So wird die modifizierte, standardisierte Test mit Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Makrophagen, die mit Hochdurchsatzleistung konnte im weiteren Sinne verwendet, um Bakterien-Wirt-Interaktionen zu untersuchen Phänotyp.

Siehe repräsentative Ergebnisse (Figur 2), nachdem die Daten auf der Basis des modifizierten phagozytischen Zellinvasionstest aufgetragen. Die Daten sind fünf verschiedene Stämme, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutierten A, B und Mutanten Δ InvG bekannt für die Invasion defekt zu sein, und ΔphoP bekannt für die Replikation 8 defekt zu sein, werden als positive Kontrollen verwendet werden, um die experimentelle Gültigkeit zu überprüfen . In der Tat, in der modifiziert...

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Eine Hochdurchsatz-Assay in vitro Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen mit hoher Durchsatzleistung entwickelt. Die Methode wurde eingesetzt, um Salmonellen Gen-Knockout-Mutanten-Stämme für ihre Verstrickungen in der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten.

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.5K Aufrufe.  Texas A&M University.  Eine Hochdurchsatz-Assay in vitro Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen mit hoher Durchsatzleistung entwickelt. Die Methode wurde eingesetzt, um Salmonellen Gen-Knockout-Mutanten-Stämme für ihre Verstrickungen in der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten. 

Serie: High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus. However, there are two species, six subspecies, and over 2,500 different Salmonella serovars, and not all are equal in their significance to public health. For example, finding S. enterica subspecies IIIa Arizona on a table egg layer farm is insignificant compared to the isolation of S. enterica subspecies I serovar Enteritidis, the leading cause of salmonellosis linked to the consumption of table eggs. Serovars are identified based on antigenic differences in lipopolysaccharide (LPS)(O antigen) and flagellin (H1 and H2 antigens). These antigenic differences are the outward appearance of the diversity of genes and gene alleles associated with this phenotype.
We have developed an allelotyping, multiplex PCR that keys on genetic differences between four major S. enterica subspecies I serovars found in poultry and associated with significant human disease in the US. The PCR primer pairs were targeted to key genes or sequences unique to a specific Salmonella serovar and designed to produce an amplicon with size specific for that gene or allele. Salmonella serovar is assigned to an isolate based on the combination of PCR test results for specific LPS and flagellin gene alleles. The multiplex PCRs described in this article are specific for the detection of S. enterica subspecies I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium.
Here we demonstrate how to use the multiplex PCRs to identify serovar for a Salmonella isolate.

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

We describe a multiplex PCR for the rapid detection of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium. Specific Salmonella serovars can be identified by targeting a multiplex PCR to genes and sequences unique to the O-antigen biosynthesis cluster and flagellin of a given serovar. Serovar is assigned then to a Salmonella isolate based on the appearance of specific, size amplicons (PCR product) corresponding to the target allele.

Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

Ein Protokoll zum Infect<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Mit<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...