This project was partially funded by a FAST (Faculty and Student Team) Award to TPP and JMC from EURECA (Center for Enhancing Undergraduate Research Experiences and Creative Activities) at Sam Houston State University.

Alle Tierversuche wurden unter Genehmigung von IACUC Protokolle durchgeführt, nummeriert 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 und 14-04-17-1018-3-01. 1. Animal Collection, Handhabung und Ethical Pflege <ol><li> Sammeln Sie Gambusia affinis aus dem Feld Website (Bestimmungsführer bei http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) mit einem kleinen Kescher und Platz in 19 L Eimer mit. Verwenden Sie visuelle Inspektion Arten zu identifizieren. </li><li> Rest Fisch für 1 bis 2 d in einem Eimer mit Teichwasser. Danach übertragen Fisch in 76 oder 189 Tanks L Aquarium gefüllt mit Halbteichwasser / Halbleitungswasser bei 25 ° C, belüftet mit einer sprudelnden airstone. Mit einem kleinen Kescher, wenn der Fisch Handhabung als minimal, um ihre Haut microbiome stören. HINWEIS: Fischdichte sollte nicht höher sein als 20 Fische / 38 l Aquarienwasser. Die Fische werden für mindestens 5 d vor dem Experiment in das Aquarium akklimatisiert. </li><li> Feed-Fisch auf einer täglichen Gabe mit 5 mg Flockenfutter pro Fisch. Hold Fisch mit einem 12 h Licht / 12 h Dunkel-Zyklus. </li></ol> 2. Initial Antibiotika Exposition für alle Experimente <ol><li> Zeichnen Sie alle Fische aus jedem Experiment aus dem gleichen Aquarium, legen Sie in zwei getrennte Gruppen (behandelt: ausgesetzt Antibiotikum &amp; Kontrolle: unbelichtet) in 19 L Eimer. Frühere Daten zeigt gesammelt, dass die Fische in der gleichen Aquarium haben Haut microbiomes homogenisiert, die wenig Variation in der Gemeinschaft Zusammensetzung haben. 12 </li><li> Bei Versuchen, halten Fisch in 2 l künstlichen Teichwasser (APW; 0,33 g / l CaCl 2, 0,33 g / l MgSO 4, 0,19 g / l NaHCO 3) , die im Autoklaven vor dem Gebrauch sterilisiert wird. </li><li> Bereiten Sie die Rifampicin Antibiotika-Stammlösung durch Zugabe von 50 mg / ml in Dimethylsulfoxid (DMSO). Rifampicin ist ein repräsentatives Breitspektrum-Antibiotikum, das für die Fische nicht toxisch ist. Bei Menschen und Mäusen, es verteilt sich gut in den Geweben. </li><li> Von der Rifampicin Lager verwalten eine endgültigeKonzentration von 25 ug / ml in 2 l APW für antibiotische Exposition der 3 Tage Fischgruppe behandelt. Beachten Sie, dass nach 3 d, kultivierbaren Haut Bakterienzahlen, die der vorbehandelten Fischhaut ähnlich zurückzukehren. </li><li> Parallel dazu halten eine Gruppe von unbehandelten Fischen in APW und geben eine äquivalente Menge von DMSO (0,5 ml pro Liter APW) in die Wassersäule als Kontrollgruppe zu handeln. </li><li> Wie Versuche sollen Wirkungen eines Antibiotikums veränderten microbiome auf Fisch Phänotypen zu messen, um Effekte direkt aus dem Antibiotikum selbst zu vermeiden, nach der dreitägigen Antibiotika-Exposition (oder Kontrolle) Zeit, Transfer Fisch in einen Eimer mit 2 l frisch APW. <ol><li> Verwenden Sie eine 10 h Ruhezeit so das Antibiotikum durch die Körper der Fische entfernt wird. Basis dieser Eliminationszeit auf Experimente, in denen Fische für drei Tage auf 25 ug / ml Antibiotikum ausgesetzt waren. Euthanize die Fische durch das Rückenmark von Schlacht gefolgt schnippeln, homogenisieren dann den ganzen Körper eine Gewebemühle verwendet wird.</li><li> Bestimmen Sie Antibiotikum Anwesenheit von 50 &amp; mgr; l dieser Suspension nach 0,2 &amp; mgr; m-Filterung in der Mitte einer Agar-Petrischale platzieren. Machen Sie ein Loch für diese Suspension durch ein auf dem Kopf nach unten drücken sterilen 200 ul Pipettenspitze in den Agar, die einen kleinen Stecker entfernt. </li><li> Verwenden Sie Agarplatten mit 20 ml gemessenes Volumen von Nähragar und gleichmäßig verteilt ein Wattestäbchen mit einem Indikatororganismus, Bacillus subtilis, die Rifampicin empfindlich ist. Beziehen Sie die B. subtilis aus einem Nähragar bei 25 ° CO / N inkubiert und das Wattestäbchen mit einer Kolonie zu erhalten. bei 25 ° C eine Hemmzone nach Inkubation über Nacht Beobachtung zeigt das Vorhandensein von Antibiotika in den Fischgeweben. </li></ol></li></ol> 3. Microbiome Extraction <ol><li> Extrahieren einer Haut microbiome Probe aus der äußeren Schleimhaut Epidermis durch den Fisch in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen mit 2 ml sterilem PBST (137 mM Na gefüllt PlazierenCl, 10 mM Phosphat, 0,1% Tween-20, pH 7,4) Lösung und Vortexen bei einer Einstellung von 10 für 1 min mit 10 s Pausieren Inkrementen. Waschmittel und Salz im Puffer fördert eine gleichmäßige Dispersion von Bakterien in der Lösung. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit 0,85% Kochsalzlösung gefunden, aber senkte Bakterienzahlen mit reinem Wasser. </li><li> Bringen Sie den Fisch aus dem konischen Rohr zu einer Erholung Eimer. Die Letalität der Haut Extraktion ist in der Regel weniger als 10%. Entweder, analysieren die Bakteriensuspension in dem Rohr unmittelbar nach Extraktion oder die Bakterien durch einen 2 min Spin in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 15.000 × g und bei -80 ° C für eine spätere Analyse pelletieren. HINWEIS: Alle Kultur und biochemische Analysen sind unmittelbar; DNA oder Proteinextraktion aus gefrorenen Proben sein. </li><li> Um eine gut microbiome Probe zu erhalten, legen Sie zuerst die Fische in eine sterile Petrischale. Euthanize die Fische durch den zervikalen Rückenmark direkt hinter dem Kopf mit chirurgische Scheren Trennen, gefolgt von SchlachtUnd dann sterilisieren extern den Körper mit 70% Ethanol wischt. </li><li> den gesamten Darm nach der Sektion, zu entfernen, nachdem der Speiseröhre und vor dem After durch Schneiden. </li><li> Schneiden Sie den Darm in kleine Abschnitte 1 bis 2 mm in der Länge und legen Sie alle Abschnitte in zwei ml PBST-Lösung in einem konischen Rohr. Nach Vortexen für 1 min, entfernen Überstand in ein anderes sauberes Röhrchen (Vorsicht, um nicht die Darmabschnitte aufstellen). HINWEIS: Der Überstand enthält extrahiert Darmbakterien, die entweder für Hautproben erwähnt durch die bisherigen Verfahren für die direkte Analysen oder pelletiert werden. </li></ol> 4. Infektion Modellvorbereitung und Bad eines spezifischen Pathogen <ol><li> Erhalten infektiösen Stamm von Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) und halten Sie die Kultur bei -80 ° C gelagert. Der Stamm 93-146 in dieser Studie verwendet wurden, isoliert von einem infizierten Wels, wurde von Mark Lawrence, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University erhalten. </li><li> streak E. ictaluri Lager auf ein selektives &amp; Differential Medien genannt E. ictaluri Medien (EIM) Agar 19 zur Kultur der Bakterien und bei 27 ° C für 2 d inkubiert. </li><li> Übertragen einer rein isolierten Kolonie aus der Kultur und impfen einen 150-ml-Kolben, die 40 ml Nährbrühe (NB; 5 g / l Pepton, 4 g / l Fleischextrakt). Danach wird der Kolben in einem Schüttler bei 150 Umdrehungen pro Minute eingestellt für 2 d bei 27 ° C. </li><li> Nach der Inkubation wird eine Probe der Kultur in PBST zu einem Spektrometer Lesen von OD 0,2 bei 650 nm verdünnt für gewünschte Infektionsdosisvolumina E. ictaluri Kultur zu kalibrieren. </li><li> Als nächstes Transfer beide behandelt (nach 3 d der Antibiotika-Exposition) und unbehandelten Fischgruppen in einzelne Plastikbecher, die 130 ml frischem künstlichen Teichwasser oder APW für ca. 10 h für Arzneimittel-Clearance von Fischgewebe. </li><li> Dann aus beiden Gruppen, Transfer wieder jeden Fisch in 8-Unzen-Plastikbecher, die 130 ml sauber APW. </li&gt; <li> Geben Sie jedem Fisch eine tödliche Dosis enthält 2,8 x 10 6 KBE / ml E. ictaluri Kultur in die APW (Bad Infektionsmodell) und halten in einem 27 ° C Inkubator für 24 Stunden. </li><li> Nach dem E. ictaluri Bad, übertragen die Fische einzeln in neue Becher mit 130 ml APW. </li><li> Nach Wasseraustausch, Rekordfischsterblichkeit über die Dauer von einer Woche. Die Fische werden nicht über diesen Zeitraum zugeführt. Im Gegensatz zu Wels, zeigen Gambusia keine äußeren Anzeichen einer Infektion, daher ist es wichtig , die Letalität als experimentelle Endpunkt zu verwenden. </li></ol> 5. polymikrobiellen Herausforderung mit Exkremente &amp; Boden <ol><li> Exkremente Behandlung <ol><li> Erhalten Sie frische menschliche Fäkalien von einem gesunden Freiwilligen unterworfen, die Antibiotika in den letzten zwei Wochen mit sterilen Handschuhen und einer sterilen 50 ml konischen Röhrchen nicht erhalten hat. </li><li> Nach dem Sammeln, sammeln Fäkalien in einem sterilen Beutel aus Kunststoff und übertragen dann in ein steriles 15 ml conical Rohr. Erstellen Sie eine Stammkonzentration von Kot in PBST zu geben, um eine Stammlösung von 500 suspendiert - 800 mg / mL. Diese dicke Mischung ist am besten eine 1 ml oder mehr Kunststoff-Pipettenspitze zu übertragen verwenden, die an der Unterseite mit einer sterilen Schere geschnitten wurde, so dass die Öffnung größer ist. </li><li> Nach anfänglichen Antibiotika-Exposition von behandelten und unbehandelten Fischgruppen steuern, getrennt in einzelne Plastikbecher Fäkalsuspension bei Endkonzentrationen von entweder 15 mg / ml oder 10 mg / ml in APW mit einem Gesamtvolumen von 130 ml enthält. Halten cups in einem Inkubator bei 25 ° C. </li><li> Nehmen Sie die Fischsterblichkeit während fäkale Belastung durch genaue Beobachtung über 2 d. </li></ol></li><li> Bodenbehandlung <ol><li> Sammeln Sie 1 bis 2 kg reichen organischen Krume (sollte die höchste Dichte und Vielfalt der Mikroben enthalten) ca. 7-15 cm nach unten in der Tiefe und in einen sauberen Plastikbehälter. Beachten Sie, dass der Boden sollte innerhalb von zwei Tagen nach der Gewinnung verwendet werden. </li><li> schrecklichctly nach der anfänglichen Belichtungsperiode, trennen die beiden Gruppen von Antibiotikum behandelten und unbehandelten Fisch in einzelne Plastikbecher 18,2 g Boden in 130 ml APW enthält. Mischen Sie den Boden im Wasser gut mit der Hand vor dem Hinzufügen des Fisches. Die meisten der Teilchen nicht suspendieren und am Boden des Bechers zu bleiben. </li><li> Expose Fisch für eine Dauer von 3 d bei 25 ° C und jede Sterblichkeit aufzuzeichnen. </li></ol></li></ol> 6. osmotischer Stress Herausforderung <ol><li> Nach der Behandlung durch eine 10 h Ruhezeit gefolgt, wie oben beschrieben, individualisieren Fisch in einzelne Tassen, enthaltend NaCl bei 17,5 mg / ml (300 mM) in 150 ml APW. Das ist die Hälfte des typischen Salinität des Meerwassers, die nicht vollständig tödlich (&lt;50%) zu steuern Fisch ist, sondern stark belastend und erfordert wirksame osmoregulation. </li><li> Beachten Sie für die Fischsterblichkeit über eine Dauer von 36 Stunden. </li></ol> 7. Nitrat Toxizität Herausforderung <ol><li> Rest Fisch für eine 10-h-Zeitraum nach einer Antibiotika-Exposure, und dann trennen Fisch in einzelne Schalen einer Natriumnitratkonzentration von entweder 10 mg / ml (118 mM) oder 17,5 mg / ml (206 mM) in 130 ml APW enthält. </li><li> Die Bilanz für die Mortalität über 4 d für niedrige Dosis und 1 d für hohe Dosis. </li></ol> 8. Wachstumsanalyse von Fisch Individualisierte oder gruppierte <ol><li> Complete 3 d Antibiotika Exposition oder Kontrollperiode als Gruppen in Eimern. </li><li> Für einzelne, füllen 8-Unzen Styroporbecher mit 150 ml APW jeder Transfer eines einzelnen Fisches in die Tasse und Rekord für die Erstprüfung Gesamtkörpergewicht. <ol><li> Wiederholen Sie dies für alle Arten von Fisch in den beiden behandelten und unbehandelten Gruppen. Verwenden Sie weiße Styroporbecher, anstatt klare Plastikbecher, weil Fische nicht essen, wenn sie in den klaren Tassen. </li></ol></li><li> Fische füttern täglich mit der Standard-Diät von zwei Pellets pro Fisch. Die Pellets wurden eher als Flocken verwendet, weil Pellets geringe Varianz in einzelnen Masse haben (3,53 ± 0,42 mg jeder oder 8% Abweichung), Resul-g in Fisch ähnliche Mengen an Nahrung zu erhalten. Überwachen Sie Verbrauch durch visuelle Aufzeichnung uneaten Pellets. Verbrauchsraten lagen typischerweise über 80%. </li><li> Am Ende jeder Woche über 4 Wochen, bestimmen Fisch Gewicht. Bereiten Sie eine neue Tasse mit frischem APW, auf ein Gleichgewicht, und dann das Gewicht aufgezeichnet. Dann gießen Sie einen Fisch in einem Kescher aus dem ursprünglichen Tasse und Transfer in den neuen Becher, der dann wieder gewogen wird. Die Fische werden nicht Stress zu vermeiden behandelt. </li><li> Für Gruppen, Platz 2 L von APW in einen 19 L Eimer und tarieren. Halten Sie Fisch zusammen in beiden Gruppen, wenn sie in neue APW Eimer übertragen dann Gesamtgruppe Gewicht aufgezeichnet. Nehmen Sie Fischgruppe Gewicht jede Woche über einen Monat Zeitraum von auf einen neuen Eimer zu übertragen. </li></ol> 9. Gut Transitzeit <ol><li> Verwenden Fluorescein-markierten 70 kDa anionischen Dextran. Dextran nicht wesentlich abgebaut und ist zu groß für die Darmschicht absorbiert werden, so werden Durchgang messen Gangszeit durch den Darm.Beschriftete Dextran wurde in Fischfutter eingearbeitet. </li><li> In einem sterilen 1,7 ml-Röhrchen, fügen Sie 360 ​​ul sterilem VE-Wasser und 52 mg Gelatine (13% ige Lösung), und legen Sie den Schlauch auf 60 ° C Wärmeblock, bis die Gelatine schmilzt und vollständig gelöst ist. <ol><li> Grind Goldfischfutter Flocken zu einem feinen Pulver mit einem Mörser und Stößel, und fügen Sie 40 mg dieses Pulvers auf das Rohr, zusammen mit 20 &amp; mgr; l von Fischöl. Nach dem Mischen hinzufügen 1,6 mg FITC-Dextran. </li></ol></li><li> Dispense die heiße flüssige Mischung in 20 &amp; mgr; l auf dem Labortisch auf Parafilm fällt, und lassen Sie sie schnell abgekühlt und verfestigt. Tropfen können für bis zu 4 d gespeichert werden, bevor sie zu hart für Fisch zu essen. Shop fällt im Kühlschrank durch die Parafilm auf die Hälfte einer Petrischale platziert, die dann auf sterilem Wasser in einem verschlossenen Plastikbehälter schwimmt, der die Tropfen befeuchtete hält. </li><li> Kurz vor Fütterung, fällt Quartal in Abschnitte mit einer Rasierklinge. Akklimatisieren die Fische an die StyroSchaumbecher einzeln für 2 Tage ohne Fütterung (Hinweis: Es werden nur unbelichteten Kontrolle Fisch verwendet wurden). Legen Sie vier Viertel des Lebensmittels in die Tasse mit dem Fisch, und beobachten Sie die Fische für 30 Minuten, wie viele Stücke der Nahrung, die sie je essen. </li><li> Um die Überwachungsperiode beginnen, übertragen die Fische einzeln in Becher mit 80 ml APW einen Kescher mit. Jede 2 h vorsichtig schwenken die APW mit der Hand, und dann nehmen Sie eine 1 ml Probe und Speicher in einem markierten 1,7 ml-Röhrchen bei 4 ° C. Proben für 36 Stunden. </li><li> Record Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzspektrophotometer, aller Proben zur gleichen Zeit nach Abschluß des Assays. Legen Sie die gesamte 1 ml Probe in eine Küvette, und notieren Sie die Fluoreszenz unter Verwendung einer Anregung bei 495 nm und Emission bei 520 nm gemessen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Einige Herausforderungen erfordern eine Ruhezeit in einem sauberen APW nach einer Antibiotika-Behandlung für das Medikament in Fischgewebe aufgebraucht werden. Wenn die Ruhezeit übersprungen wird, dann können die Ergebnisse antibiotische Anwesenheit vermengen, insbesondere wenn der Assay Exposition gegenüber Bakterien beinhaltet. Um Effekte aus einer veränderten microbiome Zusammensetzung ohne große Änderungen in der Gesamtzahl von Mikroben auf dem Host, Vorversuche Überwachung microbiome Zusammensetzung (16S Pr...

Es wurde festgestellt, dass Antibiotika können die menschliche microbiome stören zu dysbiosis führt, eine mikrobielle Gemeinschaft Ungleichgewicht bedeutet. Die kompositorische Veränderung der Mikrobiota nach einer Antibiotika - Behandlungen wurde die Vielfalt der Gemeinschaft gezeigt zu senken, wichtige Mitglieder zu reduzieren und Gemeinschaft Stoffwechsel verändern, vor allem im Darm 1, 2. Antibiotic Störung des Darms microbiome kann Kolonisationsresistenz auf Clostridium difficile 3, 4 und 5 Salmonella verringern. Zusätzlich hat die Unterbrechung der Mikrobioten zur Entwicklung vieler Syndromen und Krankheiten bei Menschen in Verbindung gebracht worden (zB Antibiotika-assoziierter Enterokolitis, entzündliche Darmerkrankungen, Stoffwechselstörungen, etc.). Antibiotika sind ebenfalls weit verbreitet in der Landwirtschaft als Wachstumsförderer umgesetzt inVieh und Geflügel Produktion 6. Die Verwendung dieser leistungsfähigen Tools ist nicht ohne Nebeneffekte, die im raschen Anstieg der Antibiotikaresistenz offensichtlich ist, sowie die Auswirkungen eines gestörten microbiome hat mit seinem bewohnter Gastgeber. Viele Studien haben gezeigt, dass Breitspektrum-Antibiotikum Nutzung hat langfristige Folgen für die Struktur und Funktion der Mikrobiota, aber die Nebenwirkungen von einem antibiotika gestört microbiome Auswirkungen auf Host-Physiologie sind nur Spekulationen, die noch unterstützt werden. Das Zusammenspiel zwischen Gastgeber, Mikrobiota und Antibiotika ist bei weitem nicht in prägnanter Weise verstanden zu werden. Daher ist ein einfaches und besser lenkbar Modell vorteilhaft Licht auf die hochkomplexen Säugersystem zu vergießen. Schleimhäuten beim Menschen, einschließlich Darm, Hafen die höchste Dichte und Vielfalt von Mikroben, und auch die intimsten Mikrobe-Wirt-Interaktionen. Die Schleimhaut Haut microbiome Fisch Angebote sehrere Vorteile als Modellsystem. Die Teleostei (Knochenfische) ist eine der frühesten Abstammungslinien innerhalb der Vertebrata Bedeutung zu divergieren , dass teleosts sowohl angeboren haben und erworbene Immunsystem , die eine Beziehung mit symbiotischer Bakterien-Gemeinschaften 7 zusammen entwickelt haben. Fischhaut teilt viele Eigenschaften mit Typ - 1 - Schleimhautoberflächen von Säugetieren, wie physiologische Funktionen, Immunität Komponenten und die Anordnung von Schleim-produzierenden Zellen 8. Die äußere Lage der Fischhaut Schleimhautoberfläche bietet eine microbiome leicht experimentell manipulieren und Probe. Die westliche mosquito, Gambusia affinis (G. affinis), ist ein Modell , Fisch, 9 Paarung und Toxikologie in der Vergangenheit verwendet wurde , für das Studium, 10, 11. In Anbetracht der geringen Größe, Bevölkerung Hülle und Fülle in der Wildnis als eine invasive Spezies, m<html> inimal Pflegekosten und hardy Natur, haben wir G. affinis als Schleimhaut microbiome Modell entwickelt. Ferner teilen Gambusia die Physiologie der Geburt mit viviparous Säugetiere junge leben, die in Fischarten ungewöhnlich ist. Wir haben die umfangreichste Studie zum Zeitpunkt der Fisch normalen Mikrobiota Haut mit 16S Profilierung mit Gambusia 12. Weitere Arbeiten zeigten , drei negative Auswirkungen auf die Host folgende Störung der Haut und der Darmflora mit einem Breitspektrum - Antibiotikum 13. Fünf verschiedene Effekte wurden in der Fisch folgenden Antibiotika Exposition untersucht. Die meisten etablierten Host Nutzen der microbiome ist wettbewerbsfähig Ausschluss von Krankheitserregern. Der Fisch Erreger Edwardsiella ictaluri ist bekannt , 14 Ausbrüche von magensaftresistenten Septikämie in kommerziellen Wels Farmen zu verursachen. E. ictaluri hat auch Zebrabärbling zu letal infizieren gezeigtclass = &quot;xref&quot;&gt; 15, 16 und 17 Gambusia. Eine Herausforderung mit diesem Erreger aus der Wassersäule kann als Maß der Ausgrenzung dienen. Als Vergleich zu Anfälligkeit für einen einzelnen Erreger, Überleben während der Exposition gegenüber einer hohen Dichte von gemischten Organismen wurde ebenfalls durchgeführt. Exkremente und organisch-reichen Boden wurden als häufig angetroffene Quellen mikrobieller Gemeinschaften eingesetzt. Eine andere etablierte Rolle der bakteriellen Darm Gemeinschaft durchführt, ist Nährstoffverarbeitung und Energieertrag, wodurch die Gesamtnahrungsaufnahme für den Wirt zu beeinflussen. Als grobe Messung der Ernährung wurde Fischkörpergewicht im Vergleich vor und nach einem Monat eine Standard-Diät gefüttert. Antibiotika-behandelten Fische als ein durchschnittliches Gewicht verloren, während die Steuerung Fisch im Durchschnitt Gewicht im Laufe des Monats gewonnen. Der Mechanismus für diesen Mangel an Gewichtszunahme ist unklar. Ein möglicher Faktor ist Transitzeit der Nahrung im Darm. Ein GI Motility-Methode wurde von Zebrabärbling (Adam Rich, SUNY Brockpo, persönliche Mitteilung) angepasst Laufzeit zu bestimmen. Es wurde noch nicht bestimmt worden, wenn Antibiotika-behandelten Fische eine veränderte Laufzeit haben. Eine gemeinsame Herausforderung von allen Organismen in der Natur erlebt, vor allem Fisch, ist osmotischer Stress. Gambusia wurden schnell anpassen angezeigt , wenn akut in hohen Konzentrationen von Salinität 18 betont. Überraschenderweise Fisch mit einem Antibiotikum veränderten microbiome zeigte gesenkt Überleben zu einem hohen Salzstress. Der Mechanismus für diesen neuartigen Phänotyp wird untersucht. Eine weitere häufige Belastung auf Wassertiere, insbesondere in Aquarien, ist toxisch Formen von Stickstoff (Ammoniak, Nitrat und Nitrit). Überleben gegen Nitrat war nicht signifikant verschieden zwischen Antibiotika-behandelten und Kontrollfische. Die Methoden in diesem Manuskript präsentiert mit Gambusia oder ähnlichen Fischmodellorganismen wie Zebra verwendet werdenFisch und Medaka, Phänotypen in der Fisch folgenden experimentellen Manipulation zu messen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="568">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:104px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:127px;">557303-1GM</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:184px;">Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS tablets</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>6500-OP</td>
			<td>tablets dissolve in water to make phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of host phenotypes in gambusia affinis following antibiotic treatment

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Ein Gesamtschemadiagramm des experimentellen Systems verwendet , um Fischaufnahmeeffekte aus antibiotischen Belichtungs 13 ist in 1A dargestellt und beinhaltet die Technik zum Extrahieren der Haut (1B) und gut (1C) microbiomes vom Fisch studieren. Drei Tage wurde als Antibiotikum Einwirkungszeit ausgewählt, weil früheren Daten, die zeigt, während die gesamte Haut kultivierbaren Zahl zu Beginn der Behandlung fä...

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Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Diese Studie umfasst Methoden, um Auswirkungen auf ein Modell Fisch-Host folgende Veränderung der Haut und Darm microbiome Gemeinden Zusammensetzung durch ein Antibiotikum zu offenbaren.

Die Prüfung der Host-Phänotypen in<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Nach der Behandlung mit Antibiotika

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

examination-host-phenotypes-gambusia-affinis-following-antibiotic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

7.6K Aufrufe.  Sam Houston State University.  Diese Studie umfasst Methoden, um Auswirkungen auf ein Modell Fisch-Host folgende Veränderung der Haut und Darm microbiome Gemeinden Zusammensetzung durch ein Antibiotikum zu offenbaren. 

Serie: Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

Die Untersuchung der Telomere G-Überhang Struktur in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In Antwort auf Antibiotika-Behandlung

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory bowel disease, asthma and arthritis. Thus, understanding the mechanisms underlying microbiota-immune system crosstalk is of crucial importance. Antibiotic administration, while aiding pathogen clearance, also induces drastic changes in the size and composition of intestinal bacterial communities which can have an impact on human health. Antibiotic treatment in mice recapitulates the impact and long-term changes in human microbiota from antibiotic treated patients, and enables investigation of the mechanistic links between changes in microbial communities and immune cell function. While several methods for antibiotic treatment of mice have been described, some of them induce severe dehydration and weight-loss complicating the interpretation of the data. Here, we provide two protocols for oral antibiotic administration which can be used for long-term treatment of mice without inducing major weight-loss. These protocols make use of a combination of antibiotics that target both Gram-positive and Gram-negative bacteria and can be provided either ad libitum in the drinking water or by oral gavage. Moreover, we describe a method for the quantification of microbial density in fecal samples by qPCR which can be used to validate the efficacy of the antibiotic treatment. The combination of these approaches provides a reliable methodology for the manipulation of the intestinal microbiota and the study of the effects of antibiotic treatment in mice.

Here we provide detailed protocols for the oral administration of antibiotics to mice, collection of fecal samples, DNA extraction and quantification of fecal bacteria by qPCR.

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail treatment. This Gram-negative bacterium causes gonorrhea exclusively in humans. During infection, it is able to form aggregates and/or biofilms. The minimum inhibitory concentration (MIC) test is used for to determine susceptibility to antibiotics and to define appropriate treatment. However, the mechanism of the eradication in vivo and its relationship to laboratory results are not known. A method that examines how GC aggregation affects antibiotic susceptibility and shows the relationship between aggregate size and antibiotic susceptibility was developed. When GC aggregate, they are more resistant to antibiotic killing, with bacteria in the center surviving ceftriaxone treatment better than those in the periphery. The data indicate that N. gonorrhoeae aggregation can reduce its susceptibility to ceftriaxone, which is not reflected using the standard agar plate-based MIC methods. The method used in this study will allow researchers to test bacterial susceptibility under clinically relevant conditions.

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

A simple ATP-measuring assay and live/dead staining method were used to quantify and visualize Neisseria gonorrhoeae survival after treatment with ceftriaxone. This protocol can be extended to examine the antimicrobial effects of any antibiotic and can be used to define the minimal inhibitory concentration of antibiotics in bacterial biofilms.

Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

Antibiotika-Dereplikation mit der Antibiotikaresistenzplattform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

Visualisierung der bakteriellen Resistenz mit fluoreszierenden Antibiotikasonden

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are widely used as a convenient cell system for analyzing SAMHD1 activity due to a low level of SAMHD1 RNA expression, leading to undetectable endogenous protein expression. Based on similar assays developed in the Stoye laboratory to characterize other retroviral restriction factors, the Bishop lab developed a two-color restriction assay to analyze SAMHD1 in U937 cells. Murine Leukaemia Virus-like particles expressing SAMHD1, alongside YFP expressed from an IRES, are used to transduce U937 cells. Cells are then treated with phorbol myristate acetate to induce differentiation to a quiescent phenotype. Following differentiation, cells are infected with HIV-1 virus-like particles expressing a fluorescent reporter. After 48 h, cells are harvested and analyzed by flow cytometry. The proportion of HIV-infected cells in the SAMHD1-expressing population is compared to that in internal control cells lacking SAMHD1. This comparison reveals a restriction ratio. SAMHD1 expression leads to a five-fold reduction in HIV infection, corresponding to a restriction ratio of 0.2. Our recent substitution of RFP for the original GFP as the reporter gene for HIV infection has facilitated flow cytometry analysis.
This assay has been successfully used to characterize the effect of amino acid substitutions on SAMHD1 restriction by transducing with viruses encoding altered SAMHD1 proteins, derived from site-directed mutagenesis of the expression vector. For example, the catalytic site substitutions HD206-7AA show a restriction phenotype of 1, indicating a loss of restriction activity. Equally, the susceptibility of different tester viruses can be determined. The assay can be further adapted to incorporate the effect of differentiation status, metabolic status, and SAMHD1 modifiers to better understand the relationship between SAMHD1, cell metabolic state, and viral restriction.

Described here is an established method to determine the extent of HIV-1 restriction by the cellular inhibitory protein SAMHD1. Human myeloid lineage U937 cells are transduced with a SAMHD1 expression vector co-expressing YFP, differentiated and then challenged with HIV-RFP. The level of restriction is determined by flow cytometry analysis.

Analyse der SAMHD1-Restriktion durch Durchflusszytometrie in humanen myeloischen U937-Zellen

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...