Wir danken T. Stürner für hilfreiche Korrekturen, Diskussionen und Kommentare zum Manuskript; SL Zipursky fly Aktien zu liefern; M Schölling zum Durchführen einer Bildverarbeitung. Ein Teil der Bildanalyse wurde bei A. Kakita Labor durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung und JSPS-Stipendien für Forschung unterstützt im Ausland (AS), JSPS-Stipendiaten (SH-S.), Grant-In-Hilfe für die Inbetriebnahme (24800024), auf innovative Bereiche (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE Kernfinanzierung (GT) und DZNE Einrichtung Lichtmikroskopie (CM).

Die experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschriebenen beinhalten ausschließlich mit Drosophila funktionieren und nicht zu den Tierschutzgesetze in Deutschland und Japan unterzogen. 1. Lichtbelichtungsbedingungen <ol><li> Bereiten Sie Fliegen , die sinnlosen-Flippase (sens-FLP) und Bruchpilot-FRT-HALT-FRT-gfp (BRP-FSF-gfp) 15 zur Visualisierung von BRP-GFP in Photorezeptor R8 Neuronen (R8) tragen. Die genomische Locus Codierung brp innerhalb eines Bacterial Artificial Chromosome (BAC) wurde modifiziert , um dieses BRP-FSF-GFP - Konstrukt zu erzeugen. In den Fliegen dieser modifizierten BAC die Expression von BRP-GFP trägt , ist unter der Kontrolle der endogenen regulatorischen Sequenzen, aber nach sinnlosen-Flippase vermittelter Entfernung der FRT-STOPP-FRT - Kassette 15 bis R8 Photorezeptoren beschränkt. Beachten Sie, dass sens-FLP selten in R7s Flippase zum Ausdruck bringt. </li><li> Halten Sie die Fliegen in einem 12 h light / 12 h Dunkel - Zyklus (LD) bei 25 ° C von der Larve bis zum Schlüpfen (1A). </li><li> Sammeln Sie die Fliegen zum 0 - 6 h nach dem Schlüpfen und legen Sie sie in ein neues Fläschchen Fliege Nahrung enthält. </li><li> Stellen Sie die Phiolen in eine transparente Zahnstange aus Acrylharz mit drei Stufen (einer Höhe von 41 cm, einer Basis von 21 cm, einer Dicke von 4 cm und einer Höhe von 13 cm für jeden Schritt) (1B). </li><li> Stellen Sie den Abstand zwischen der Zahnstange und einem LED - Panel , die Beleuchtung mit einer durchschnittlichen Intensität von 1.000 Lux , um eine digitale Belichtungsmesser (1C) verwendet wird . </li><li> Halten Sie die Fliegen für 1-3 d unter einer der folgenden Bedingungen: konstanter Dunkelheit (DD), 12 h Licht / 12 h Dunkel - Zyklus (LD) oder Dauerlicht (LL) bei 25 ° C in einem kleinen Inkubator (1A und 1C). </li></ol> 2. Dissection, Immunhistochemie und Imaging <ol><li> Präparieren Fliegen Gehirne mit einer Pinzette, fixieren Sie diese mit 4% formaldehyde und immunostain mit dem primären Antikörper gegen Chaoptin (1:50) und einem zweiten Antikörper zur Visualisierung von auf früheren experimentellen Verfahren 25 basierend Photorezeptoren. Kurz: <ol><li> Bereiten 0,1% Triton X-100 in PBS (0,1% PBT). Diese Lösung wird verwendet, um Antikörpergewebepenetration verbessern. </li><li> Anesthetize fliegt auf einem CO 2 - Pad, sortieren Sie die richtigen Genotyp und übertragen sie in eine Petri mit 0,1% PBT gefüllten Teller. </li><li> Kleben Sie die Zange unter den Rüssel und ziehen Sie die rechte und linke Auge jeweils mit den anderen Zange. </li><li> Entfernen Sie den Rüssel und die Luftröhre an das Gehirn gebunden. </li><li> Übertragen, um das Gehirn mit der Zange in ein 1,5 ml-Röhrchen, enthaltend 150 &amp; mgr; l von 0,1% PBT bei RT. </li><li> Innerhalb von 10 min Wiederholung von 2.1.3 - 2.1.5 so viele Gehirne wie möglich zu erhalten. </li><li> In 50 &amp; mgr; l von 16% Formaldehyd in das Röhrchen und mischen durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Sie die Gehirne in Fixiermittel bei RaumTemperatur für 50 min. </li><li> Waschen dreimal mit 200 &amp; mgr; l von 0,1% PBT mit einer Mikropipette, Aufmerksamkeit die Gehirne in der Röhre zu verlassen. </li><li> Nach der letzten Waschung, entfernen Sie die 0,1% PBT und die primäre Antikörperlösung hinzufügen, wie folgt hergestellt: in den 196 &amp; mgr; l von 0,3% PBT (0,3% Triton X-100 in PBS) 4 ul anti-Chaoptin Antikörper (Endverdünnung 1 : 50) für die Visualisierung von Photorezeptoren. </li><li> Inkubieren Sie die Gehirne in der primären Antikörperlösung bei 4 ° CO / N. </li><li> Wasch 3x mit 200 ul 0,1% PBT mit einer Mikropipette. </li><li> Nach der letzten Waschung, entfernen Sie die 0,1% PBT und einen sekundären Antikörper, die 200 &amp; mgr; l der 0,3% PBT hinzuzufügen. </li><li> Inkubieren bei 4 ° CO / N im Dunkeln. </li><li> Waschen dreimal mit 200 ul 0,1% PBT mit einer Mikropipette. </li></ol></li><li> Zur Montage setzen zwei kleine Tropfen (2 ul jeweils) eines Befestigungsmediums mit einer Mikropipette in der Mitte eines Objektträgers bei etwa 2 cm distaNOA voneinander. </li><li> Legen Sie zwei Deckgläser, ein auf jedem Tropfen und lassen einen schmalen Spalt zwischen den Deckgläsern von etwa 0,2 mm. </li><li> Legen Sie 15 ul einer Montagemedium auf dem Deckglas und fügen Sie die Gehirne mit einer Mikropipette in die Montagemedium. </li><li> Unter einem Binokular, positionieren das Gehirn mit der Bauchseite nach oben in den schmalen Spalt zwischen den beiden Deck (Abbildung 2). </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack , um die Probe zu beheben (Abbildung 2). </li><li> Erhalten Sie Bilder der Gehirne mit einem konfokalen Mikroskop. Verwenden Sie ein 63X -Ölimmersionsobjektiv Objektiv (1,4 NA) und ein 2.6X Digitalzoom. Erzeugen mehr als 20 optische Schnitte der zweiten Optik ganglion medulla mit einer Schrittweite von 0,5 um. </li></ol> 3. Die Erzeugung der Spots, Oberfläche Objekte, Startpunkte und End-Punkte <ol><li> Zur Quantifizierung der Zahl, die distribution und die Delokalisierung Ebene von BRP-GFP puncta, öffnen Sie das durch konfokale Mikroskopie erhalten Stapel in der Analyse - Software - Image und Rekonstitution von 3D - Bildern (3A). Beachten Sie, dass der Schritt in dieser Studie wurde mit Imaris durchgeführt. </li><li> Identifizieren Sie die BRP-GFP puncta durch das Punkterfassungsmodul für jeden R8 Axonterminal. <ol><li> Wählen Sie &quot;Neuen Spots&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Segment nur eine Region of Interest&quot; in den Einstellungen des Algorithmus. Wählen Sie einen R8 Axonterminal in der Medulla manuell. </li><li> Wählen Sie den Quellkanal des BRP-GFP-Signal. HINWEIS: Die R7 und R8 Photorezeptor Axone wurden mit immunmarkierten anti-Chaoptin (3A). Nur wenn enthält R8, BRP-GFP puncta und somit leicht zu unterscheiden (3A) werden könnte. Ferner könnte der Endpunkt R8 durch die Verdünnung der anti-Chaoptin-positive Axone am Eintrittspunkt in die Medulla M3 Schicht identifiziert werden. </li><li> Stellen Sie den geschätzten XY Durchmesser to 0,35 um und prüfen &quot;Hintergrund Subtraktion&quot; im Spot-Erkennung aus. </li><li> Wählen Sie &quot;Qualität&quot; in Filtertyp und Filter automatisch. Dann klicken Sie auf Fertig. </li><li> Wiederholen von 3.2.1 t- 3.2.5 für andere R Axone (3B). </li></ol></li><li> Um die Delokalisierung Ebene von BRP-GFP in R8 Axone messen, Oberflächenobjekte mit dem &quot;Surface&quot; -Funktion für jedes Axon (3C) erzeugen. <ol><li> Wählen Sie &quot;Add new Oberflächen&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Segment nur eine Region of Interest&quot; in den Einstellungen des Algorithmus. Wählen Sie dann manuell einen R8 Axonterminalen in der Medulla. </li><li> Wählen Sie den Quellkanal der Photorezeptoren. </li><li> Abhaken &quot;glatt&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Absolute Intensität&quot; in der Schwelle. </li><li> Check &quot;Enable&quot;. &quot;Seed-Punkte-Durchmesser&quot; ist 0,5 um. </li><li> Wählen Sie Filtertyp &quot;Qualität&quot; und &quot;Anzahl der Voxel&quot;, und dann filtern automamatisch. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Bearbeiten&quot; und löschen Sie die Stücke auf andere nicht interessant Axone erzeugt Oberflächen. </li><li> Wiederholen von 3.3.1 - 3.3.8 für andere R Axone (3C). Hinweis wurden einige Oberflächen Objekte unterbrochen wegen der geringen Dicke und das schwache Signal in Photorezeptoren bei M2-Schicht, aber sie waren immer noch als ein einziges Objekt von Anfang bis Ende Punkte berücksichtigt. </li></ol></li><li> Um die Verteilung der BRP-GFP puncta entlang jedes Neuron in der Medulla neuropil identifizieren, zu definieren den Startpunkt und Endpunkt mit dem Messpunkt - Funktion (3D). <ol><li> Wählen Sie &quot;Neuen Messpunkte&quot;. Wählen Sie dann &quot;Bearbeiten&quot; und wählen Sie &quot;Oberfläche des Objekts&quot; mit der Spitze der Flächenobjekte zu schneiden. </li><li> Setzen Sie Messpunkte auf der Oberfläche Objekte von R Axone in M1 Schicht um. Diese sind definiert nun als Startpunkte (3D). </li><li> Wählen Sie &quot;Neuen Messpunkte&quot;.Wählen Sie dann &quot;Bearbeiten&quot; und wählen Sie &quot;Oberfläche des Objekts&quot; mit der Unterseite der Oberfläche Objekte zu schneiden. </li><li> Setzen Sie Messpunkte auf der Unterseite der Oberflächenobjekte von R Axone in M3 Schicht um. Diese sind definiert nun als Endpunkte (Abbildung 3D). </li></ol></li><li> Um das Hintergrundsignal von der GFP - Kanal subtrahieren, erzeugen Flächenobjekte, Flecken, Start-Punkte und Endpunkte für zwei R Axone in M6 Schicht (Abbildung 3E). <ol><li> Wählen Sie &quot;Add new Oberflächen&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Segment nur eine Region of Interest&quot; in den Einstellungen des Algorithmus. Wählen Sie dann ein Axon R7 Klemme zwischen M5 und M6 manuell Schicht. </li><li> Wählen Sie den Quellkanal des Photorezeptors. </li><li> Abhaken &quot;glatt&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Absolute Intensität&quot; in der Schwelle. </li><li> Wählen Sie Filtertyp &quot;Qualität&quot; und &quot;Anzahl der Voxel&quot;, dann automatisch filtern. </li><li> Wählen Sie &quot;Neuen Spots&quot;;. </li><li> Wählen Sie &quot;automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Center of Object&quot; und einen Platz im inneren Bereich der Oberfläche Objekt hinzufügen, erzeugt aus 3.5.1 - 3.5.6. </li><li> Wiederholen von 3.5.1 - 3.5.9 für eine andere R7 Axonterminal. </li><li> Wählen Sie &quot;Neuen Messpunkte&quot;. Wählen Sie dann &quot;Bearbeiten&quot; und stellen Messpunkte auf der Oberseite der beiden Oberflächenobjekte von der Spitze des R7 Axonterminal in M6 Schicht. Diese werden nun als Startpunkte definiert. </li><li> Wählen Sie &quot;Neuen Messpunkte&quot;. Wählen Sie dann &quot;Bearbeiten&quot; und stellen Messpunkte auf der Unterseite der beiden Oberflächenobjekte von der Spitze des R7 Axonterminal in M6 Schicht. Diese sind definiert nun als Endpunkte (Abbildung 3E). </li></ol></li></ol> 4. Berechnung der Anzahl der Spots, Verteilung des Spot-Frequenz und Pegel des Anreicherung von BRP-GFP mit einer angepassten Bilddatenanalyse-Software <ol><li> Kopieren Sie die Datei&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot; und die &quot;Funktionen&quot; Ordner in den Imaris XT Matlab Ordner. Beachten Sie, dass die Berechnung in dieser Studie mit einem angepassten Plugin implementiert in Matlab durchgeführt wurde. Laden Sie das Plugin von der Website ( <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li> Öffnen Sie einen Datensatz mit n-Spots, n Oberflächen und zwei Messpunktobjekte, die jeweils n Messpunkte (hergestellt 3,1 bis 3,4). Der erste Messpunkt Objekt definiert die Startpositionen für alle Axone. Der zweite Messpunkt Objekt definiert die Endposition aller Axone. Beide Messpunktobjekte müssen die gleiche Anzahl von Messpunkten zu haben (dh die Anzahl von Axonen). </li><li> Führen Sie die Bildverarbeitung &gt;&gt; CUSTOM&gt; atsushis Synapse Erkennung Vs 6. </li><li> Überprüfen Sie Metadaten und Pixelgrößen in Bildanalyse-Software für den Fall, ändern Sie es nicht korrekt ist. </li><li> Wählen Sie den Kanal für die performance der Intensitätsanalyse von Spots Regionen und Cytoplasma-Regionen (der Kanal mit BRP-GFP). </li><li> Definieren Sie den Dateinamen, die Ergebnisse für den Export. </li><li> Definieren Sie die Anzahl der Bins und Axonlänge in Prozent. Geben Sie die Anzahl der Behälter als &quot;10&quot; und den Bereich der Behälter als &quot;100%&quot; (4A und 4B). </li><li> Definieren Sie die Bereiche der Spots und den anderen zytoplasmatischen Regionen für die BRP-GFP Delokalisierung Analyse. Geben Sie Flecken Radius als &quot;0,35 um&quot; und der Breite auf die Umgebung als &quot;50 &amp; mgr; m&quot;. Der Flecken Radius definiert den Bereich für das puncta GFP-Signal (0,35 &amp; mgr; m Durchmesser, auf einer punctum zentriert). Die Breite Bereich der umgebenden definiert den Bereich für das GFP - Signal im Cytoplasma - Bereich (50 &amp; mgr; m Durchmesser, auf dem punctum zentriert, aber auch nur R8 und unter Ausschluss aller Punktbereiche im Zytoplasma) (4A und 4C). </li><li> Warten Sie, bis alle Neuron Masken verarbeitet werdenund exportiert als PDF - Dateien (4B und 4C) und eine CSV - Tabelle zur weiteren Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm . Die CSV-Tabelle enthält die Anzahl der Punkte, die mittlere Signalintensität in der &quot;Cytoplasma-Bereich&quot; und die maximale Signalintensität in der &quot;Punkt&quot; in jedem Fach für alle R8 Axone. </li><li> Öffnen Sie einen Datensatz erstellt in 3.5 für die Subtraktion des Hintergrundsignals. </li><li> Führen Sie die Bildverarbeitung von 4.3 - 4.9. </li><li> Berechne den Mittelwert der Gesamtzahl und der Verteilung der BRP-GFP puncta in ein Tabellenkalkulationsprogramm (Figuren 4D und 4E). </li><li> Berechne den Mittelwert der Delokalisierung von BRP-GFP - Signal in einer Kalkulationstabelle durch das Verhältnis der durchschnittlichen Intensität in der &quot;zytoplasmatische Bereich&quot; geteilt durch die maximale Intensität in der &quot;Spot&quot; subtrahiert durch die durchschnittliche Intensität des Hintergrundsignals (4F) . </li></ol>

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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Mapping+of+Neuronal+Circuitry+With+an+Index-Optimized+Clearing+Agent.">Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent.</a> Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li><li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states.">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In dieser Studie haben wir gezeigt, wie die Lichtverhältnisse vorzubereiten Fliegen auf eine gleiche Lichtintensität zu belichten. Wir quantifiziert nicht nur die Anzahl der synaptischen puncta Marker könnte aber auch räumlich die Dichte von Synapsen entlang Axone lösen und die Delokalisierung Ebene des Markerproteins in zytoplasmatischen Bereichen zu messen. Diese drei Beurteilungen ermöglichen es uns, die Details der synaptischen Dynamik bei einzelnen Neurons Ebene in verschiedenen Umweltbedingungen zu bewerten....

<html> Die Modulation der synaptischen Funktion trägt zu der bemerkenswerten Fähigkeit des Nervensystems genau zu reagieren oder auf sich ändernde Umweltstimuli anpassen. Die präsynaptischen Vesikelfreisetzung Wahrscheinlichkeit Einstellen ist eine Möglichkeit , 1 synaptischen Stärke zu steuern. Synaptische Vesikel - Freisetzung erfolgt an der aktiven Zone (AZ), einem spezialisierten Bereich der präsynaptischen Membran 2. Die AZ wird durch eine Kassette von spezifischen Proteinen charakterisiert 3, 4. Die meisten Proteine zu AZ Montage beitragen , werden in Nematoden, Insekten und Säugetieren 5 hoch konserviert. Neuere Studien legen nahe , dass das Niveau von neuronaler Aktivität der molekularen Zusammensetzung des AZ reguliert, das wiederum trägt zur Regelung der Funktionsausgang sowohl in vitro als auch in vivo 6, 7,&gt; 8. Wir fanden vorher , dass Photorezeptor AZs molekulare Umbau in Drosophila unterzogen werden nach längerer Exposition gegenüber natürlichen Umgebungslicht 9. In diesem Zustand wurde beobachtet, dass die Anzahl der Bruchpilot (BRP) -positiven AZs in dem Photorezeptor Axone reduziert wurde. Die Brp / CAST / ELKS Familie Proteine sind Grundbausteine von AZs in Wirbeltieren und wirbellosen Synapsen 10. Bei Drosophila brp Mutanten, evozierte Vesikelfreisetzung 11 unterdrückt wird, 12. Die 17 C-terminalen Aminosäurereste von Brp sind für synaptic vesicle clustering an der Drosophila Neuromuscular Junction (NMJ) 13, 14. Diese Studien zeigten, die zentrale Rolle dieses Moleküls in AZ Organisation und Funktion. Mit einem neu entwickelten genetischen Werkzeug, synaptic tagging mit Rekombinations (Stern), Brpkann in vivo in spezifische Zelltypen, bei endogenen Expressionsniveaus und bei einer einzelnen Synapse Auflösung 15 beobachtet werden. Dieses Werkzeug ermöglicht es, die endogene Dynamik der Synapsen quantitativ in dem Komplex des zentralen Nervensystems zu bewerten. Es wurden mehrere Studien Quantifizierungen einschließlich Synapsen basierend auf Daten aus der konfokalen Mikroskopie erhalten. Synaptische Veränderungen wurden durch Messen der Länge, die Fläche, das Volumen, die Dichte und das Zählen der Anzahl basierend auf hoch entwickelten Software-Anwendungen bewertet. Zum Beispiel stellt die Freeware ImageJ eine Quantifizierungsmethode für die gesamte synaptischen Bereich und Synapsendichte Maßnahmen an der Drosophila NMJ 16. Die Anzahl der Kolokalisation Websites von Pre - und postsynaptischen Markern wurden 17 mit dem Plugin &quot;Puncta Analyzer&quot; auf der ImageJ Software - Plattform quantifiziert. Alternativ kann ein Multi-Paradigm numerischen Rechenumgebung basiertes Programm, Synapse Detector (SYND) können automatisch mit einem fluoreszierenden Marker markiert Dendriten von Neuronen Spuren und quantifiziert dann die synaptischen Proteinmengen als Funktion des Abstands von dem Zellenkörper 18. Die Software Synaptische Puncta Analysis (SynPAnal), hat sich für die schnelle Analyse von 2D-Bildern von Neuronen erworben von konfokalen oder Fluoreszenzmikroskopie entwickelt. Die primäre Funktion dieser Software ist die automatische und schnelle Quantifizierung von Dichte und Intensität der Protein puncta 19. Vor kurzem wurde eine automatische lernbasierte Synapse Erkennungsalgorithmus wurde für die Quantifizierung der synaptischen Zahl in 3D 20, erzeugt wurde 21 die Vorteile der 3D - Visualisierung-Assisted Analysis (Vaa3D) Software nehmen. Kommerzielle Bildanalyse-Software sind auch leistungsfähige Werkzeuge für die synaptische Quantifizierungen. Zum Beispiel kann die fluoreszenzmarkiertem Neurotransmitter - Rezeptoren oder eine präsynaptische AZ Komponente in drei Dimensionen mit Einzelsiebzug Synapse Auflösung in C. elegans 22 oder der Drosophila olfaktorische System 23, 24, so dass Hunderte von Synapsen zu schnell charakterisiert innerhalb einer einzigen Probe quantifiziert. Hier präsentieren wir eine Methode, durch eine maßgeschneiderte Bildanalyse-Software-Plug-in in einem Multi-Paradigma numerische Rechenumgebung implementiert, die halbautomatisch mehrere Aspekte der AZs analysieren können, einschließlich deren Anzahl, Verteilung und dem Grad der Anreicherung von molekularen Komponenten zu der AZ. Somit ist diese komplexe Analyse erlaubt uns, die Dynamik der synaptischen Komponenten in Axonterminalen unter verschiedenen Umweltbedingungen zu bewerten. Wir untersuchten die Wirkung von Licht-Exposition auf den Ausgangs Synapsen der erwachsenen Fliege Photorezeptoren. Das Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt: 1)Vorbereitung zur Belichtung, 2) Dissektion, Immunhistochemie und konfokale Bildgebung und 3) Bildanalyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vial</td>
			<td>Hightech, Japan</td>
			<td>MKC-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug</td>
			<td>Thermo Fisher Sciehtific, USA</td>
			<td>AS-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized transparent rack made of acrylic resin&#160;</td>
			<td>Shin-Shin Corporation, Japan</td>
			<td></td>
			<td>a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool incubator</td>
			<td>MITSUBISHI ELECTRIC, Japan</td>
			<td>CN-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED panel</td>
			<td>MISUMI, Japan</td>
			<td>LEDXC170-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital light meter</td>
			<td>CEM</td>
			<td>DT-1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly pad</td>
			<td>Tokken, Japan</td>
			<td>TK-HA03-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 x 10 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One International, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablet</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako, Japan</td>
			<td>160-24751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>A. 152X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 16%</td>
			<td>NEM, Japan</td>
			<td>3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-chaoptin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa568-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide (76 x 26 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm)</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Microscopes</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZ61-C-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope Lighting</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>LSM780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.6.4 or above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>The MathWorks, Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel for Mac&#160;</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing synaptic modulation of drosophila melanogaster photoreceptors after exposure to prolonged light

Das Nervensystem hat die bemerkenswerte Fähigkeit, auf verschiedene Reize anzupassen und zu reagieren. Diese neuronale Anpassung wird weitgehend durch Plastizität bei der synaptischen Ebene erreicht. Die aktive Zone (AZ) ist der Bereich an der präsynaptischen Membran, die die Freisetzung von Neurotransmittern vermittelt und ist von einer dichten Ansammlung von Gerüstproteine ​​bestehen. AZs von Drosophila melanogaster (Drosophila) Photorezeptoren unterziehen molekularen Remodeling nach längerer Exposition gegenüber natürlichen Umgebungslicht. Somit ist die Höhe der neuronalen Aktivität kann die molekulare Zusammensetzung der AZ neu anordnen und die Regulierung des Funktionsausgang beitragen. Ausgehend von der Belichtung Set-up Vorbereitung auf die Immunhistochemie, Details dieses Protokoll , wie die Anzahl zu quantifizieren, um die räumliche Verteilung und die Delokalisierung Ebene synaptischer Moleküle an AZs in Drosophila Photorezeptoren. Mit Bildanalyse software, Cluster des GFP-fusionierten AZ Komponente Bruchpilot wurden für jede R8 Photorezeptor (R8) Axonterminal identifiziert. Erkannt Bruchpilot Spots wurden auf einzelne R8 Axone automatisch zugewiesen. Um die Verteilung der Frequenzkanal entlang des Axons zu berechnen, führten wir eine maßgeschneiderte Software-Plugin. Jedes Axon Startpunkt und Endpunkt wurden manuell definiert und die Position jedes Bruchpilot Stelle wurde auf der Verbindungslinie zwischen Start- und Endpunkt projiziert. Neben der Anzahl der Bruchpilot Cluster, quantifiziert wir auch die Delokalisierung Niveau der Bruchpilot-GFP innerhalb der Cluster. Diese Messungen beziehen sich im einzelnen ortsaufgelösten synaptic Dynamik in einem einzigen Neuron unter verschiedenen Umgebungsbedingungen auf Reize.

Das Facettenauge von Drosophila umfasst ~ 780 Ommatidien, die jeweils acht Typen von Photorezeptoren (R1-8). R7 und R8 Projekt ihre Axone in die zweite Optik Ganglion, der Medulla, wo sie Synapsen in Schichten M6 und M3 bilden jeweils 26. Um die Wirkung von längerer Einwirkung von Licht auf der molekularen Zusammensetzung des Photorezeptors R8 aktiven Zonen zu untersuchen, nutzten wir die STaR Methode 15. Endogene Expression von B...

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Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Hier zeigen wir , wie die Anzahl und die räumliche Verteilung der synaptischen aktiven Zonen in Drosophila melanogaster Photorezeptoren zu quantifizieren, markiert mit einem genetisch molekularen Marker codiert und deren Modulation nach längerer Einwirkung von Licht.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

analyzing-synaptic-modulation-drosophila-melanogaster-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

6.5K Aufrufe.  Niigata University.  Hier zeigen wir , wie die Anzahl und die räumliche Verteilung der synaptischen aktiven Zonen in Drosophila melanogaster Photorezeptoren zu quantifizieren, markiert mit einem genetisch molekularen Marker codiert und deren Modulation nach längerer Einwirkung von Licht. 

Serie: Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Forschung

Neurowissenschaften

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Bestimmung der spontanen lokomotorischen Aktivität in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Bedingungen, die sozialen Raum, in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Futter suchen Pfad-Länge-Protokoll für<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor cells in isolated eyestalks using the discontinuous single electrode-switched voltage-clamp configuration. First, with a razor blade we made an opening in the dorsal cornea to get access to the retina. Thereafter, we inserted a glass electrode through the opening, and penetrated a cell as reported by the recording of a negative potential. Membrane potential was clamped at the photoreceptor's resting potential and a light-pulse was applied to activate currents. Finally, the two light-flash protocol was employed to measure current desensitization and recovery. The first light-flash triggers, after a lag period, the transduction ionic current, which after reaching a peak amplitude decays towards a desensitized state; the second flash, applied at varying time intervals, assesses the state of the light-activated conductance. To characterize the light-elicited current, three parameters were measured: 1) latency (the time elapsed between light flash delivery and the moment in which current achieves 10% of its maximum value); 2) peak current; and 3) desensitization time constant (exponential time constant of the current decay phase). All parameters are affected by the first pulse.
To quantify recovery from desensitization, the ratio p2/p1 was employed versus time between pulses. p1 is the peak current evoked by the first light-pulse, and p2 is the peak current evoked by the second pulse. These data were fitted to a sum of exponential functions. Finally, these measurements were carried out as function of circadian time.

A protocol for the study of desensitization and sensitivity recovery of crayfish photoreceptors as a function of circadian time is presented.

Desensitisierung und Wiederherstellung von Krebse Photorezeptoren nach der Lieferung eines leichten Stimulus

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.