Wir möchten Jennifer Bair und Einat Snir sowie das Institut für Humangenetik der Universität Iowa für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung und Bearbeitung von Proben anerkennen.

<ol><li>Austin, C., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC40096/">Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina.</a> Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3714606/">The Neuronal Organization of the Retina.</a> Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).</li>
<li>Rodieck, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodieck%2C+R+%22The+First+Steps+in+Seeing%22">The First Steps in Seeing</a>. , Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (1998).</li>
<li>Chiu, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+at+whole+population+and+single+cell+levels+reveals+somatosensory+neuron+molecular+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity.</a> Elife. 3, e04660(2014).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+cell+types+and+states+with+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Defining cell types and states with single-cell genomics.</a> Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li>
<li>Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Positive+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells%3A+From+Form+to+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).</li>
<li>Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+classes+of+mRNAs+that+are+targeted+to+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).</li>
<li>Darmanis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+human+brain+transcriptome+diversity+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).</li>
<li>Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+midbrain+dopaminergic+neuron+diversity+by+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Rep%22%5BJournal%5D)">Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling.</a> Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).</li>
<li>Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+Single-Cell+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Technologies for Single-Cell Isolation.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).</li>
<li>Lovatt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+in+vivo+analysis+%28TIVA%29+of+spatially+defined+single+cells+in+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue.</a> Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).</li>
<li>Qiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+RNA-Seq%3A+Technical+feasibility+and+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility.</a> Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).</li>
<li>Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grouping+and+classifying+electrophysiologically-defined+classes+of+neocortical+neurons+by+single+cell%2C+whole-genome+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling.</a> Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).</li>
<li>Fuzik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+electrophysiological+recordings+with+single-cell+RNA-seq+data+identifies+neuronal+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes.</a> Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J. Vis. Exp. (47), e2367(2011).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Bistratified+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse.</a> J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cone+pathway+influence+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes.</a> J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).</li>
<li>Clontech Laboratories I. <a target="_blank" href="http://www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=41709">SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina® Sequencing</a>. , (2013).</li>
<li>Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+RNA-Seq+libraries+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).</li>
<li>Ecker, J. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20624591">Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision.</a> Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).</li>
<li>Schmidt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Role+for+Melanopsin+in+Alpha+Retinal+Ganglion+Cells+and+Contrast+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection.</a> Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).</li>
<li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Types+of+Retinal+Ganglion+Cells%3A+Current+Status+and+Implications+for+Neuronal+Classification%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification.</a> Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).</li>
<li>Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Profiling+of+Developing+and+Mature+Retinal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e3824(2012).</li>
<li>Trimarchi, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Heterogeneity+of+Developing+Retinal+Ganglion+and+Amacrine+Cells+Revealed+through+Single+Cell+Gene+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Unser Protokoll demonstriert durch eine schnelle und einfach zu bedienende Anleitung eine Methode zur Vorbereitung einzelner Zellen identifizierter morphologischer Klassen für qualitativ hochwertige Sequenzierung mit wenig Verletzung der Probe. In dem vorliegenden Manuskript werden intrinsisch lichtempfindliche retinale Ganglienzellen morphologisch charakterisiert, isoliert und für RNA-Seq vorbereitet. Während der Netzhauthandhabung können zelluläre Spannungen auftreten Aus diesem Grund ersetzen wir jedes Stück Ge...

Die neuronale Diversität wird im gesamten Zentralnervensystem beobachtet, insbesondere in der Wirbeltierhaut, ein hochspezialisiertes Gewebe, bestehend aus 1 glialen und 6 neuronalen Zelltypen, die aus einer Population der Netzhautvorläuferzellen 1 , 2 , 3 entstehen. Viele Subtypen von Zellen können funktionell, morphologisch und genetisch klassifiziert werden. Ziel dieses Protokolls ist es, die genetische Variabilität von Zelltypen an ihre identifizierbaren funktionellen und / oder morphologischen Eigenschaften zu binden. Eine Reihe von Genen wurden für die Klassifizierung von Zellen identifiziert, aber viele Subtypen gehen weiterhin uncharakterisiert, da sie einen kleinen Bruchteil der Gesamtbevölkerung darstellen. Die Identifizierung von Genen innerhalb dieser spezifischen Subtypen wird ein besseres Verständnis der neuronalen Vielfalt innerhalb der Netzhaut ermöglichen und kann auch die Diversifizierung der neuralen Zellen anderswo beleuchten. FuDarüber hinaus erlauben Single-Cell-Studien die Aufdeckung neuer Zelltypen, die aufgrund ihrer geringen Repräsentation unter der Gesamtbevölkerung 4 , 5 , 6 , 7 übersehen werden können . Einer der Vorteile der Single-Cell-Transkriptomik ist, dass einzigartige Marker oder Kombinationen von Markern, die einen bestimmten zellulären Subtyp definieren, entdeckt werden können. Diese können dann verwendet werden, um genetischen Zugang zu diesem Zelltyp für verschiedene Manipulationen zu gewinnen. Zum Beispiel verwenden wir dieses Protokoll zur Charakterisierung der zelltypspezifischen Gene einer Untergruppe von retinalen Ganglienzellen, die das Photopigment Melanopsin exprimieren. Die Verwendung eines fluoreszierenden Markers in Melanopsin-exprimierenden retinalen Ganglienzellen ermöglicht die Untersuchung dieser Zellen, da sie aufgrund ihrer Expression eines bekannten Gens zusammengehäuft sind. Interessanterweise gibt es fünf bekannte Subtypen dieser Zelle PopuLation in der Maus Retina 8 . Um also RNA aus Zellen jedes Typs zu isolieren, haben wir im Rahmen des transgenen Modells etablierte morphologische Klassifikationen verwendet, um jeden Subtyp vor der Zellisolation zu identifizieren. Diese Technik ermöglicht sowohl die Charakterisierung von Zellen als auch für ihre Isolierung direkt aus der Netzhaut, ohne die Notwendigkeit einer Gewebedissoziation, die eine Stressreaktion innerhalb von Zellen und eine Kontamination aufgrund von abgetrennten Dendriten verursachen kann 9 . In den vergangenen Jahren ist eine Vielzahl neuer Techniken aufgetaucht, da sich die RNA-Seq-Methode weiterentwickelt. Diese Werkzeuge ermöglichen eine maximierte Zellaufnahme und eine höhere Kosteneffizienz bei Annäherung an die Frage 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Doch währendDiese Techniken waren hervorragende Stepping-Steine, gibt es eine Reihe von Hürden noch begegnet, dass dieses Protokoll in der Lage ist, Adresse. Zuerst isolieren viele der gegenwärtigen Verfahren Zellen aus dissoziiertem Gewebe und versuchen, entweder Hauptkomponentenanalyse oder hierarchische Clustering Post-hoc zu verwenden, um die Zellklassifizierung zu bestimmen. Das Verlassen auf diese Werkzeuge, um Subtypen zu klassifizieren, kann keine zuverlässigen Ergebnisse liefern und kann dazu führen, dass man neue Wege findet, um diese Daten für die Korrelation eines genetischen Markers zu einem funktionellen Zelltyp zu validieren. Das Erfordernis der Dissoziation in anderen Protokollen kann manchmal zu Gewebeschäden führen und kann dazu führen, dass neuronale Prozesse abgetrennt werden, was zu einem möglichen Verlust an mRNA führt. Weiterhin können in den dissoziierten Zellpräparaten die Stressreaktionen beginnen, die Transkriptome dieser Zellen zu beeinflussen 14 . Dieses Protokoll überwindet diese Herausforderungen durch die Bestimmung der funktionellen Zelltyp vor der Isolierung, und es hält besser die hDie Fähigkeit, das Netzhautgewebe intakt zu halten. Eine Technik wurde im Jahr 2014 eingeführt und bestand aus der in vivo Analyse des Transkriptoms der lebenden Zellen 15 . Während diese Technik die Untersuchung des Transkriptoms mit minimaler mechanischer Störung des Gewebes ermöglicht, fehlt es an der Fähigkeit, spezifische Zelltypen innerhalb des Gewebes zu klassifizieren, bevor sie ihre Transkriptome untersuchen, ohne eine sehr spezifische Reportermaus zu verwenden. Unser Protokoll erfordert keinen spezifischen Reporter, da wir die Zellfüllung und die Elektrophysiologie nutzen, um Zellen vor ihrer Isolation zu charakterisieren. Eine weitere Einschränkung dieses früheren Protokolls besteht darin, dass es eine spezifische Wellenlänge benötigt, um das photoaktivierbare Element anzuregen, während unser Protokoll die Verwendung eines fluoreszierenden Reporters und eines fluoreszierenden Farbstoffs ermöglicht, die leicht verfügbar sind oder von jedem Labor einzeln ausgewählt werden können. Dennoch haben andere Laboratorien die beiden Methoden der Elektrizität geheiratetOphysiologie und Transkriptomik für das Studium der Zellvielfalt. Die Verwendung von Patch-Clamp-Aufnahmen zur Charakterisierung der Funktion einer Zelle vor ihrer Isolation wurde auf dissoziierten Neuronen durchgeführt 16 und in einigen Fällen ist sie der Verwendung der Mikroarray-Analyse 17 für diese Studien vorausgegangen. Die gleichen Komplikationen treten bei jenen Ansätzen auf, da sie eine Gewebedissoziation oder die Verwendung von Mikroarray-Technologie erfordern, die auf der Hybridisierung von Proben auf verfügbare Sonden beruht. Einer der jüngsten Fortschritte war die Entwicklung von Patch-Seq, einer Technik, die den Einsatz von Patch-Clamp-Aufnahmen und RNA-Seq-Technologie kombiniert, um Zellen aus Ganzhirn-Scheiben zu verstehen. Während diese Technik ihre Ähnlichkeiten mit dem hier vorgestellten Protokoll hat, ist es wieder wichtig zu beachten, dass unser Ansatz es dem Gewebe ermöglicht, für die Gesundheit der Zellen intakt zu bleiben. Hier stellen wir ein Protokoll für die optimizat vorIon dieser Allianz, die qualitativ hochwertige Single-Cell-Bibliotheken für den Einsatz von RNA-Seq generiert, um eine hohe Lesetiefe und Mapping-Abdeckung zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>Ames&#039; Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1420-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Spectrum Chemical</td><td>PO178</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Worthington Biochemical&amp;nbsp;</td><td>LS005273</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Worthington Biochemical&amp;nbsp;</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (35 mm diameter)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmologic scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-687-708</td><td></td></tr><tr><td>Glass Micropipette</td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter</td><td></td><td>P-1000 horizontal pipette puller</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>Flexible tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171</td><td></td></tr><tr><td>TCL lysis buffer</td><td>Qiagen</td><td>1031576</td><td>Lysis Buffer 1</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free Water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30124359</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol, Pure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Analog Vortex Mixer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02215365</td><td>Vortex</td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>RNA magnetic beads</td></tr><tr><td>MagnaBlot II Magnetic Separator</td><td>Promega</td><td>V8351</td><td>Magnetic stand</td></tr><tr><td>1.5 mL MCT Graduated Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td><td>Clontech</td><td>634888</td><td>Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification</td></tr><tr><td>10x Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td>Lysis Buffer 2</td></tr><tr><td>5x Ultra Low First-strand Buffer</td><td></td><td></td><td>Buffer 1</td></tr><tr><td>3&#039; SMART-Seq CDS Primer II A</td><td></td><td></td><td>Primer II</td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Oligonucleotide</td><td></td><td></td><td>Oligonucleotide</td></tr><tr><td>SMARTScribe Rverse Transcriptase</td><td></td><td></td><td>Reverse Transcriptase (RT)</td></tr><tr><td>2x SeqAmp PCR Buffer</td><td></td><td></td><td>PCR Buffer</td></tr><tr><td>PCR Primer II A</td><td></td><td></td><td>PCR Primer</td></tr><tr><td>SeqAmp DNA Polymerase</td><td></td><td></td><td>DNA Polymerase</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S</td><td>Eppendorf</td><td>950030020</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>DNA magnetic beads</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>HS Bioanalyzer Chips &amp;amp; Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>For the calculation of sample concentrations</td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Reagents for Tagmentation and Index Coupling</td></tr><tr><td>TD Buffer</td><td></td><td></td><td>Buffer 2</td></tr><tr><td>ATM</td><td></td><td></td><td>Tagmentation Mix</td></tr><tr><td>NT Buffer</td><td></td><td></td><td>Tagmentation Neutralizing Buffer</td></tr><tr><td>NPM</td><td></td><td></td><td>PCR Master Mix</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Indices for Tagmentation</td></tr><tr><td>N501</td><td></td><td></td><td>White 1</td></tr><tr><td>N502</td><td></td><td></td><td>White 2</td></tr><tr><td>N701</td><td></td><td></td><td>Orange 1</td></tr><tr><td>N702</td><td></td><td></td><td>Orange 2</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>For completing sequencing of samples</td></tr></tbody></table>

single-cell rna-seq of defined subsets of retinal ganglion cells

Die Entdeckung von zelltypspezifischen Markern kann Einblicke in die zelluläre Funktion und die Ursprünge der zellulären Heterogenität geben. Mit einem jüngsten Push für das verbesserte Verständnis der neuronalen Vielfalt ist es wichtig, Gene zu identifizieren, deren Ausdruck verschiedene Subpopulationen von Zellen definiert. Die Netzhaut dient als hervorragendes Modell für die Untersuchung der zentralen Nervensystem-Vielfalt, da sie aus mehreren Hauptzelltypen besteht. Die Untersuchung jeder Hauptklasse von Zellen hat genetische Marker ergeben, die die Identifizierung dieser Populationen erleichtern. Allerdings gibt es mehrere Subtypen von Zellen innerhalb jeder dieser großen retinalen Zellklassen, und wenige dieser Subtypen haben genetische Marker bekannt, obwohl viele durch Morphologie oder Funktion charakterisiert wurden. Eine Kenntnis von genetischen Markern für einzelne retinale Subtypen würde die Untersuchung und Kartierung von Hirnzielen ermöglichen, die sich auf spezifische visuelle Funktionen beziehen und auch einen Einblick in die Gennetze vermitteln könnenPflegen zelluläre Vielfalt. Die gegenwärtigen Wege, die verwendet wurden, um die genetischen Marker von Subtypen zu identifizieren, besitzen Nachteile, wie die Klassifizierung von Zelltypen nach der Sequenzierung. Dies stellt eine Herausforderung für die Datenanalyse dar und erfordert rigorose Validierungsmethoden, um sicherzustellen, dass Cluster Zellen der gleichen Funktion enthalten. Wir schlagen eine Technik zur Identifizierung der Morphologie und Funktionalität einer Zelle vor der Isolierung und Sequenzierung vor, die eine leichtere Identifizierung von subtypspezifischen Markern ermöglicht. Diese Technik kann auf nicht-neuronale Zelltypen sowie auf seltene Populationen von Zellen mit geringfügigen Variationen erweitert werden. Dieses Protokoll liefert hervorragende Daten, da viele Bibliotheken Lese-Tiefen von mehr als 20 Millionen Lesungen für einzelne Zellen zur Verfügung gestellt haben. Diese Methodik überwindet viele der Hürden, die von Single-Cell RNA-Seq präsentiert werden, und kann für Forscher geeignet sein, die darauf abzielen, Zelltypen auf einfache und hocheffiziente Weise zu profilieren.

Zelltypen werden nach der Farbstoffinjektion leicht klassifiziert Abbildung 1 zeigt ein Beispiel eines GFP + RGC vor und nach der Fluoreszenz-Tracer-Füllung. Diese Zelle wurde anhand ihrer Expression von GFP in der transgenen Linie identifiziert (Abbildung 1A ). Eine dichte Abdichtung wurde mit einer feinen Spitze, gezogenen Glaselektrode auf dem Soma dieser Zelle gebildet. Um den Subtyp zu char...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde.

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Aufrufe.  Iowa State University.  Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde. 

Serie: Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Forschung

Neurowissenschaften

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Biotechnik

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies revealing novel paradigms in vascular biology. Applying these methods to models of vascular development requires the optimization of cell isolation techniques from embryonic and postnatal tissues. Cell yield, viability, and purity all need to be maximal to obtain accurate and reproducible results from next-generation sequencing approaches. The neonatal mouse retinal vascularization model is used by researchers to study mechanisms of vascular development. Researchers have used this model to investigate mechanisms of angiogenesis and arterial-venous fate specification during blood vessel formation and maturation. Applying next-generation sequencing techniques to study the retinal vascular development model requires optimization of a method for the isolation of retinal endothelial cells that maximizes cell yield, viability, and purity. This protocol describes a method for murine retinal tissue isolation, digestion, and purification using fluorescence-activated cell sorting (FACS). The results indicate that the FACS-purified CD31+/CD45- endothelial cell population is highly enriched for endothelial cell gene expression and exhibits no change in viability for 60 min post-FACS. Included are representative results of next-generation sequencing approaches on endothelial cells isolated using this method, including bulk RNA sequencing and single-cell RNA sequencing, demonstrating that this method for retinal endothelial cell isolation is compatible with next-generation sequencing applications. This method of retinal endothelial cell isolation will allow for advanced sequencing techniques to reveal novel mechanisms of vascular development.

This protocol describes a method for the isolation of murine postnatal retinal endothelial cells optimized for cell yield, purity, and viability. These cells are suitable for next-generation sequencing approaches.

Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Entwicklungsbiologie

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during development and in disease states. Single-cell RNA sequencing allows us to comprehensively profile gene expression changes observed in retinal development and disease at a cellular level, while single-cell ATAC-Seq allows analysis of chromatin accessibility and transcription factor binding to be profiled at similar resolution. Here the use of these techniques in the developing retina is described, and MULTI-Seq is demonstrated, where individual samples are labeled with a modified oligonucleotide-lipid complex, enabling researchers to both increase the scope of individual experiments and substantially reduce costs.

Here, the authors showcase the utility of MULTI-seq for phenotyping and subsequent paired scRNA-seq and scATAC-seq in characterizing the transcriptomic and chromatin accessibility profiles in retina.

Multiplexe Analyse der retinalen Genexpression und der Chromatinzugänglichkeit mittels scRNA-seq und scATAC-seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

Isolierung der Netzhaut von Mäusen und Methanolbehandlung zur Untersuchung von retinalen Ganglienzellen

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autor im Rampenlicht: Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation

Multiplexe Analyse der retinalen Genexpression und der Chromatinzugänglichkeit mittels scRNA-seq und scATAC-seq

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen