Name: single-cell rna-seq of defined subsets of retinal ganglion cells
Uploaded: 2017-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Numunelerin hazırlanması ve işlenmesinde kendilerine yardımcı olması için Jennifer Bair ve Einat Snir&#39;in yanı sıra Iowa Üniversitesi İnsan Genetiği Enstitüsü&#39;nü kabul etmek istiyoruz.

<ol>
	<li>Austin, C., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Cell+Fate+in+the+Vertebrate+Retina.">Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina.</a> Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).</li><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neuronal+Organization+of+the+Retina.">The Neuronal Organization of the Retina.</a> Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).</li><li>Rodieck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The First Steps in Seeing. , (1998).</li><li>Chiu, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+at+whole+population+and+single+cell+levels+reveals+somatosensory+neuron+molecular+diversity.">Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity.</a> Elife. 3, e04660 (2014).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+types+and+states+with+single-cell+genomics.">Defining cell types and states with single-cell genomics.</a> Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-Positive+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells:+From+Form+to+Function.">Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).</li><li>Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+classes+of+mRNAs+that+are+targeted+to+neuronal+dendrites.">Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).</li><li>Darmanis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+human+brain+transcriptome+diversity+at+the+single+cell+level.">A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+midbrain+dopaminergic+neuron+diversity+by+single-cell+gene+expression+profiling.">Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling.</a> Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).</li><li>Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Single-Cell+Isolation.">Technologies for Single-Cell Isolation.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).</li><li>Lovatt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+in+vivo+analysis+(TIVA)+of+spatially+defined+single+cells+in+live+tissue.">Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue.</a> Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).</li><li>Qiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+RNA-Seq:+Technical+feasibility+and+reproducibility.">Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility.</a> Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).</li><li>Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grouping+and+classifying+electrophysiologically-defined+classes+of+neocortical+neurons+by+single+cell,+whole-genome+expression+profiling.">Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling.</a> Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).</li><li>Fuzik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+electrophysiological+recordings+with+single-cell+RNA-seq+data+identifies+neuronal+subtypes.">Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes.</a> Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells.">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Bistratified+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells+in+the+Mouse.">Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse.</a> J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cone+pathway+influence+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+subtypes.">Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes.</a> J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).</li><li>Clontech Laboratories I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina&#174; Sequencing. , (2013).</li><li>Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+RNA-Seq+libraries+for+next+generation+sequencing.">Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).</li><li>Ecker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-expressing+retinal+ganglion-cell+photoreceptors:+Cellular+diversity+and+role+in+pattern+vision.">Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision.</a> Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).</li><li>Schmidt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Role+for+Melanopsin+in+Alpha+Retinal+Ganglion+Cells+and+Contrast+Detection.">A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection.</a> Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).</li><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Types+of+Retinal+Ganglion+Cells:+Current+Status+and+Implications+for+Neuronal+Classification.">The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification.</a> Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).</li><li>Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Profiling+of+Developing+and+Mature+Retinal+Neurons.">Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e3824 (2012).</li><li>Trimarchi, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Heterogeneity+of+Developing+Retinal+Ganglion+and+Amacrine+Cells+Revealed+through+Single+Cell+Gene+Expression+Profiling.">Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Protokolümüz, hızlı ve kolay bir kullanım kılavuzunda, numuneye az zarar veren, yüksek kaliteli sıralama için tanımlanmış morfolojik sınıfların tek hücrelerini hazırlamak için bir yöntem göstermektedir. Mevcut el yazmada, esas olarak duyarlı retina ganglion hücreleri morfolojik olarak karakterize edilir, izole edilir ve RNA-Seq için hazırlanır. Hücresel stresler retina kullanımı sırasında ortaya çıkabilir; Bu nedenle, en fazla 4 saat kullanımdan sonra her bir doku parçasını değiştiririz. Bu hücrelerden kayıt yapmak ve yanıtlarını izlemek için elektrofizyoloji teçhizatını kullanarak hücrelerin durumunu değerlendirebiliriz, böylece hücrelerin sağlıklı olmasını sağlarız. Protokolümüz, başarılı 23 örnekten 15&#39;inde başarılı cDNA kütüphanelerinin oluşturulmasına izin vererek% 65 başarı oranı sağladı. Ayrıca, sıralama verilerinin kalitesi mükemmeldi, çünkü hücrelerimiz tarafından ifade edilen ortalama gen sayısı 2,316-10,353 arasında değişiyordu ve ortalama 5,683Sıfır olmayan bir FPKM değeri ile kayıt yapan genler. Bu rakamlar, diğer nöron çalışmalarında bulunan ifade edilen gen sayımlarına benzer 5, verilerimizin de iyi kalitede olduğunu gösterir. Bu spesifik nöronlar için bu protokol ile başarı elde etmiş olmakla birlikte, bu tekniğin küçük düzeltmelerinin bir takım farklı uygulamalar için uygulanabileceğini belirtmek gerekir. Floresansla aktive olan bir Hücre Sıralayıcısı&#39;nı (FACS) ayrı bir fare modeli kullanarak, merkezi sinir sisteminden bir GFP markörü ile etiketlenmiş küçük hücrelerin (1.000-2.500) izole ettik. Bu popülasyondaki RNA izole edildi ve adım l&#39;de ters transkripsiyonu başlatmak için bu RNA&#39;nın 1 μL&#39;si (12 ng / μL&#39;de az veya biraz düşük) kullanıldı. Bu adımdan sonra protokole yapılması gereken tek ayar, adım 7.4&#39;te gerçekleşir; bu noktada, daha az PCR döngüsü kullanmayı seçebilirsiniz. Başlangıç ​​örneğinde g bulunması durumunda 19 siklüs kullandıkReaktör 10.000&#39;den daha fazla hücre olduğunu ve bunun iyi kalitede cDNA kütüphaneleri ürettiğini bulduk. Örneğin, hücre örnekleri bir FACSorted popülasyondan hazırlandı ve ifade edilen gen sayısı, 12.340-14.052 arasında değişti ve ortalama sıfır olmayan bir FPKM değeri olan 13.265 gen bulundu. Bu teknik, floresan muhabirinin bulunduğu çeşitli fare modellerine uygulanabilir. Bu değişikliğe bağlı olarak, araştırmacılar potansiyel olarak, floresan muhabiri fare olan herhangi bir hücre popülasyonunu inceleyebilir ve nöronal çeşitlilik alanını aşan çalışmaları genişletebilir. İkinci bir ayar, sadece morfoloji yerine işlevselliğe dayalı hücreleri profillemek için yapılabilir. Bu proje, transgenik bir modele dayanır, ancak bu teknik, moleküler tanımlayıcıları bilinmeyen nöronlara uygulanabilir. Örneğin, halihazırda tanımlanan 27&#39;nin üzerinde 30&#39;dan fazla işlevsel alt tip retinal gangliyon hücresi vardır, bunların çok azı benzersiz belirteçlere sahiptir. Bu teknik olarakZaten bir hücre dolgusu için bir elektrofizyoloji teçhizatına dayanıyor, birisi kendi spike modeline dayanarak her bir hücrenin fonksiyonel yanıt profilini tanımlamak için yama sıkıştırma kullanabilir. Işık uyarılmış diken kayıtlarını kullanarak, retina nöronlarının sınıflandırılması, hücre izolasyonundan önce saptanabilir. Bu teknik retinal ganglion hücreleri üzerinde çalışır, ancak diğer retinal nöronları incelemek için uzatılabilir. Bununla birlikte, eğer bu protokol, iç nükleer tabaka içinde retinal bipolar veya amacrine hücreleri yazmak için kullanılıyorsa, örneğin, hücrelerin elektrot ucunda, hücrelere temas etmesini önlemek için, elektrot ucunda sabit pozitif basınç sağlamak için dikkatli olunmalıdır Elektrod ganglion hücre tabakası ve iç pleksiform tabakadan geçer. İç nükleer tabaka içindeki retinal nöronlar için, hücresel kayıtlardan önce retinal kesitlerin hazırlanması muhtemelen kontaminasyonu önlemek için en iyi sonuç verecektir. Her hücre, burada tarif edildiği gibi izole edilecek ve hazırlanacaktır.Hesaplama basamağı. Ayrıca, bu protokolün nöronların çalışması için kullanılmasını öneriyoruz, ancak bu teknik morfolojik olarak karakterize edilebilen veya transjenik bir model kullanılarak izole edilebilen herhangi bir hücre türüne uygulanabilir. Bu teknik, daha önce hazırlanmış cDNA kütüphaneleri ile çalışmak için de değiştirilebilir, çünkü geçmişte mikrodizim hibridizasyonu 28 için ürettik. Ayrı ayrı hazırlanmış bir kütüphane ile cDNA miktarları 50-150 ng aralığında başlar ve 8.4. Adımda protokol başlar; Daha yüksek ve düşük konsantrasyonlarda çalışılmasına rağmen, bunlar da çalışabilirler. DNA boncukları kullanarak cDNA&#39;nın saflaştırılması ilk önce gerçekleşir, ardından etiketleme ve PCR amplifikasyonu yapılır. Bu ayarlamayı mikroarray hibridizasyon 29 gibi kütüphane preparatlarından cDNA ile test ettik ve RNA-Seq için başarıyla etiketlenmiş kütüphaneler ürettik. yüzgeçMüttefiki, bu protokol, indüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden (iPSC&#39;ler) belirli bir hücre popülasyon indüksiyonunun başarısının değerlendirilmesinde kullanılabilir. Yeniden programlanan pluripotent hücrelerin farklılaşmasının ardındaki itici güç, hücre tiplerinin birbirinden ayrı olarak gelişmesine yol açan transkripsiyon faktörlerinin anlaşılmasına dayanır. IPSC&#39;leri belirli hücrenin kaderlerine doğru yönlendirmek, nöronal çeşitliliği araştırmak için yeni bir yöntemdir, çünkü selektif olarak hücre tipleri üretmek için kullanılabilir. Bu protokol, bu modelden farklılaşmış hücreler arasındaki çeşitliliğin kalitesini değerlendirmek için uyarlanabilir. Daha önce belirtildiği gibi 30&#39;dan fazla fonksiyonel alt tip retinal gangliyon hücresi bulunmaktadır ve iPSC&#39;lerden işlevsel RGC&#39;ler üretmek için birçok çaba gösterilmiştir. RGC alt türleri için belirteçlerin belirlenmesi - bizim durumumuzda, ipRGCs - araştırmacıya çeşitli alt tip RGC üretmede protokollerinin başarısını değerlendirebiliriz. Hücre tiplerinin değerlendirilmesiBu protokollerden yararlanacak ve bu model sistemi kolaylıkla erişilebileceği için alt tipe özel belirteçlerin araştırılmasına devam edilmesi için bir araç görevi görecektir. Bu yazıda, transkriptomik analiz için tek hücrelerin izolasyonu ve hazırlanması için basit bir teknik açıklanmaktadır. Ayrıca, protokolü düzenlemenin yollarını öneriyoruz, böylece bu teknik, çeşitli hedefler düşünülerek çok sayıda deneme için kullanılabilir. Burada tarif edilen protokol, Trombetta ve ark. Tarafından tarif edilen bir protokolden adapte edildi . 24 , düşük girişli RNA-Seq için önerilen kit talimatlarının bir ayarı olarak. En büyük farklılıklar, bu projenin ihtiyaçlarına en uygun şekilde seçtiğimiz hücre izolasyonu ve çeşitli hacimsel değişikliklerdir. Bu protokolün en önemli adımı retinal dokudan hücrelerin izolasyonu olduğunun altını çizmek önemlidir. Protokol durin bu noktadaEn fazla hata oluşabilecek g&#39;ye dikkat etmeli ve en dikkatli bir şekilde uygulanmalıdır. Herhangi bir bulaşma miktarı kullanılamaz örneklerle sonuçlanabilirken, sitoplazmanın kaybı mRNA moleküllerinin ciddi şekilde tükenmesine neden olabilir. Bu adım, numunelerin tam olarak işlendiğinden emin olmak için dikkatle ve aynı kişi tarafından deneyden deneye kadar yapılmalıdır. Özetle, bu protokol, yüksek kaliteli RNA-Seq için hücrelerin sınıflandırılması, izolasyonu ve hazırlanması için bir teknik açıklamaktadır. Bu, tek hücrelerden gelen verilerin kalitesini optimize etmek için verimli ve nispeten düşük maliyetli bir yoldur. Bu teknik çok yönlüdür ve çeşitli çalışmalara uygulanması için minimum düzeyde değiştirilebilir.

Nöronal çeşitlilik merkezi sinir sistemi boyunca, özellikle retinal progenitör hücreler 1 , 2 , 3&#39;ün bir popülasyonundan ortaya çıkan, 1 glial ve 6 nöronal hücre tipinden oluşan, son derece uzmanlaşmış bir doku olan omurgalı retinada gözlemlenir. Birçok alt hücre tipi işlevsel, morfolojik ve genetik olarak sınıflandırılabilir. Bu protokolün amacı hücre tiplerinin genetik değişkenliğini tanımlanabilir işlevsel ve / veya morfolojik özelliklerine bağlamaktır. Hücrelerin sınıflandırılması için bir dizi gen tanımlanmıştır, ancak genel popülasyonun küçük bir bölümünü oluşturduğu için birçok alt tip karakterize edilmeye devam etmektedir. Bu spesifik alt tiplerdeki genlerin tanımlanması, retinadaki nöronal çeşitliliğin daha iyi anlaşılmasına ve başka yerlerde sinir hücrelerinin çeşitlenmesine ışık tutabilir. FuAyrıca, tek hücreli çalışmalar, genel nüfus 4 , 5 , 6 , 7 arasında gösterilememeleri nedeniyle gözden kaçmış olabilecek yeni hücre tiplerinin ortaya çıkmasına izin verir. Tek hücre transkriptomisinin faydalarından biri, belirli bir hücresel alt türü tanımlayan eşsiz belirteçlerin veya işaretçilerin kombinasyonlarının keşfedilmesidir. Bunlar daha sonra farklı manipülasyonlar için o hücre türüne genetik erişim elde etmek için kullanılabilir. Örneğin, bu protokol, fotopigment melanopsini ifade eden bir retina ganglion hücresi alt grubunun hücre tipine özgü genleri karakterize etmek için kullanıyoruz. Melanopsin ifade retinal gangliyon hücrelerinde bir flüoresan markör kullanımı, bu hücrelerin bilinen bir genin ekspresyonu nedeniyle birlikte kümelenmiş olarak çalışmasını sağlar. İlginçtir ki, bu hücre popülünün bilinen beş alt türü vardırFare retinasındaki lation 8 . Böylece, RNA&#39;yı her türün hücrelerinden izole etmek için, hücre izolasyonundan önce her alt türün tanımlanması için transjenik model içinde yerleşik morfolojik sınıflamaları kullandık. Bu teknik, hücrelerin içinde stres tepkisine neden olabilecek doku ayrışması ve parçalanmış dendritler nedeniyle kontaminasyona neden olmadan, hücrelerin tanımlanmasına ve retinadan doğrudan izole edilmesine imkan verir 9 . RNA-Seq yöntemi geliştikçe, son birkaç yılda birçok yeni teknik ortaya çıkmıştır. Bu araçlar eldeki soruna yaklaşırken 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 nolu numaralı hücrelerin toplanmasını ve daha fazla maliyet etkinliği sağlar. Ancak, süreBu teknikler mükemmel basamak taşı olmuştur, hala bu protokolün adresleyebileceği birçok engeli vardır. Birincisi, mevcut prosedürlerin birçoğu hücreleri ayrışmış dokudan ayırır ve hücre sınıflandırmasını belirlemek için post-hoc ya ana bileşen analizi ya da hiyerarşik kümeleme kullanmaya çalışır. Alt tipleri sınıflamak için bu araçlara güvenmek, güvenilir sonuçlar vermeyebilir ve bir genetik işaretin fonksiyonel bir hücre türüne korelasyonu için bu verileri doğrulamanın yeni yollarını bulmaya zorlayabilir. Diğer protokollerde ayrılma gereksinimi bazen doku hasarına neden olabilir ve nöronal proseslerin kopmasına neden olarak mRNA&#39;nın potansiyel bir kaybına neden olabilir. Dahası, ayrışmış hücre preparatlarında stres tepkileri, bu hücrelerin transkriptomlarını etkilemeye başlayabilir 14 . Bu protokol, izolasyondan önce işlevsel hücre türünü belirleyerek bu zorlukların üstesinden gelir veRetinal dokuyu bozulmadan tutarak hücrelerin sağlıklı kalmasını sağlar. Bir teknik 2014 yılında tanıtıldı ve canlı hücrelerin transkriptomunun in vivo analizinden oluşuyordu 15 . Bu teknik dokuya asgari mekanik bozulma ile transkriptomun incelenmesine izin verirken, çok özel bir muhabir fare kullanmadan transkriptomlarını incelemeden önce dokudaki spesifik hücre tiplerini sınıflandırma yeteneğinden yoksundur. İzolasyonundan önce hücreleri karakterize etmek için hücre doldurma ve elektrofizyolojiyi kullandığımız için, protokolümüzde belirli bir muhabir kullanılmasına gerek yoktur. Bu önceki protokolün diğer bir kısıtlaması, fotoaktivite edilebilir elementi uyarmak için spesifik bir dalga boyu gerektirmesidir; oysa protokolümüz, kolayca bulunabilen veya her laboratuvar tarafından ayrı ayrı seçilebilen bir flüoresan muhabirinin ve floresan boyanın kullanımına izin vermektedir. Yine de, diğer laboratuvarlar iki elektrık yöntemini evlendilerOfiyoloji ve transkriptomikler gibi konularda bilgi verir. Bir hücrenin izolasyondan önce fonksiyonunu karakterize etmek için yama-klemp kayıtlarının kullanılması, ayrışmış nöronlar 16 üzerinde gerçekleştirildi ve bazı vakalarda, bu çalışmalar için mikro-dizi analizi 17&#39;den önce geldi. Bu yaklaşımlarla aynı komplikasyonlara rastlanır çünkü bunlar, doku ayrışması veya numunelerin kullanılabilir problara hibridize edilmesine dayanan mikroarray teknolojisinin kullanılması gerektirir. En yeni gelişmelerden biri, tam beyin dilimlerinden gelen hücreleri anlamak için patch-clamp kayıtlarının ve RNA-Seq teknolojisinin kullanımını birleştiren bir teknik olan Patch-Seq&#39;in geliştirilmesidir18. Bu teknik burada sunulan protokole benzemekle birlikte, yaklaşımımızın dokuların hücrelerin sağlığı için bozulmadan kalmasını sağladığına dikkat etmek önemlidir. Burada optimizat için bir protokol sunmaktayız.Yüksek okuma derinliği ve haritalama kapsamı elde etmek için RNA-Seq kullanımı için yüksek kalitede, tek hücreli kütüphaneler üreten bu ittifakın iyonu.

<table><tbody><tr><td>Ames&#039; Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1420-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Spectrum Chemical</td><td>PO178</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Worthington Biochemical&amp;nbsp;</td><td>LS005273</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Worthington Biochemical&amp;nbsp;</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (35 mm diameter)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmologic scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-687-708</td><td></td></tr><tr><td>Glass Micropipette</td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter</td><td></td><td>P-1000 horizontal pipette puller</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>Flexible tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171</td><td></td></tr><tr><td>TCL lysis buffer</td><td>Qiagen</td><td>1031576</td><td>Lysis Buffer 1</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free Water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30124359</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol, Pure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Analog Vortex Mixer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02215365</td><td>Vortex</td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>RNA magnetic beads</td></tr><tr><td>MagnaBlot II Magnetic Separator</td><td>Promega</td><td>V8351</td><td>Magnetic stand</td></tr><tr><td>1.5 mL MCT Graduated Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td><td>Clontech</td><td>634888</td><td>Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification</td></tr><tr><td>10x Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td>Lysis Buffer 2</td></tr><tr><td>5x Ultra Low First-strand Buffer</td><td></td><td></td><td>Buffer 1</td></tr><tr><td>3&#039; SMART-Seq CDS Primer II A</td><td></td><td></td><td>Primer II</td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Oligonucleotide</td><td></td><td></td><td>Oligonucleotide</td></tr><tr><td>SMARTScribe Rverse Transcriptase</td><td></td><td></td><td>Reverse Transcriptase (RT)</td></tr><tr><td>2x SeqAmp PCR Buffer</td><td></td><td></td><td>PCR Buffer</td></tr><tr><td>PCR Primer II A</td><td></td><td></td><td>PCR Primer</td></tr><tr><td>SeqAmp DNA Polymerase</td><td></td><td></td><td>DNA Polymerase</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S</td><td>Eppendorf</td><td>950030020</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>DNA magnetic beads</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>HS Bioanalyzer Chips &amp;amp; Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>For the calculation of sample concentrations</td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Reagents for Tagmentation and Index Coupling</td></tr><tr><td>TD Buffer</td><td></td><td></td><td>Buffer 2</td></tr><tr><td>ATM</td><td></td><td></td><td>Tagmentation Mix</td></tr><tr><td>NT Buffer</td><td></td><td></td><td>Tagmentation Neutralizing Buffer</td></tr><tr><td>NPM</td><td></td><td></td><td>PCR Master Mix</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Indices for Tagmentation</td></tr><tr><td>N501</td><td></td><td></td><td>White 1</td></tr><tr><td>N502</td><td></td><td></td><td>White 2</td></tr><tr><td>N701</td><td></td><td></td><td>Orange 1</td></tr><tr><td>N702</td><td></td><td></td><td>Orange 2</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>For completing sequencing of samples</td></tr></tbody></table>

single-cell rna-seq of defined subsets of retinal ganglion cells

Hücre türüne özgü belirteçlerin keşfedilmesi, hücresel fonksiyon ve hücresel heterojenliğin kökeni hakkında bilgi sağlayabilir. Nöronal çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için yeni bir itki ile, ifadeleri hücrelerin çeşitli alt popülasyonlarını tanımlayan genleri tanımlamak önemlidir. Retina merkezi sinir sistemi çeşitliliğinin çalışılması için mükemmel bir model olarak hizmet eder, çünkü çok sayıda ana hücre tipinden oluşur. Her büyük hücre sınıfının çalışması, bu popülasyonların tanımlanmasını kolaylaştıran genetik belirteçler verdi. Bununla birlikte, bu önemli retinal hücre sınıflarının her birinde çok sayıda alt hücre tipi mevcuttur ve pek çoğu morfoloji veya fonksiyonla karakterize olmasına rağmen, bu alt tiplerin az bilinen genetik belirteçleri vardır. Bireysel retinal alt tipler için bir genetik belirteç bilgisi, belirli görsel fonksiyonlarla ilgili beyin hedeflerinin çalışılması ve haritalandırılması için izin verir ve ayrıcaHücresel çeşitliliği muhafaza edin. Alt tiplerin genetik belirteçlerini belirlemek için kullanılan cari yollar, sıralamayı takiben hücre tiplerinin sınıflandırılması gibi dezavantajlara sahiptir. Bu, veri analizi için bir zorluk oluşturuyor ve kümelerin aynı işleve sahip hücreler içerdiğinden emin olmak için titiz doğrulama yöntemleri gerektiriyor. İzolasyon ve sıralama öncesinde bir hücrenin morfolojisini ve işlevselliğini tanımlamak için bir tekniği öneriyoruz, bu da alt tipe özgü belirteçlerin daha kolay tanımlanmasını sağlayacaktır. Bu teknik, nöronal olmayan hücre tiplerine ve küçük varyasyonlar gösteren nadir hücre popülasyonlarına kadar uzatılabilir. Çoğu kütüphane, tek hücreler için 20 milyondan fazla okuma derinlikleri sağladığından, bu protokol mükemmel kalitede veri üretir. Bu metodoloji, Tek hücreli RNA-Seq tarafından sunulan engellerin çoğunun üstesinden gelir ve hücre tiplerini basit ve etkili bir şekilde profillemeyi amaçlayan araştırmacılar için uygun olabilir.

Hücre türleri, boya enjeksiyonundan sonra kolayca sınıflandırılır Şekil 1 , flüoresan izleyici dolumundan önceki ve sonraki bir GFP + RGC örneğini göstermektedir. Bu hücre, transjenik çizgide GFP ifadesine dayanarak tanımlandı ( Şekil 1A ). Bu hücrenin soma üzerine ince uçlu, çekilmiş bir cam elektrot ile sıkı bir conta oluşturuldu. Alt türün karakterize edilmesi için floresan boyası soma enjekte edildi ve ilgili tüm işlemleri doldurmaya bırakıldı ( Şekil 1B ). M4 ipRGC sınıflandırması, bu hücrenin çok büyük bir soma olduğu ve süreçlerinin iç pleksiform tabakanın ON sublaminasında sona erdiği gözlemi ile sağlandı ( Şekil 1C ). Bir izole retinal preparatta ayırt edilebilen tabakalaşma farklılıklarının bir örneği olarak, M1 (OFF-stratifyinG), M3 (bistratified) ve M4 (ON tabakalandırıcı) floresan bir izleyici ile ipRGCs onları sabit ve ON ve OFF sublaminae ( Şekil 1D ) konfokal görüntüleme gerçekleştirildi. Dendritlerin konfokal görüntüleme vasıtasıyla görselleştirilmesi, hücreler flüoresan izleyici ile doldurulduğunda dentritlerin sabitlenmemiş in vitro dokudaki görünümüne çok benzer (Schmidt ve Kofuji 2009, 2010 ve 2011). Tek hücreden cDNA kütüphaneleri Bir Oligo d (T) primerinin kullanılması seçici ters transkripsiyon ve mRNA&#39;nın amplifikasyonuna izin verir. Her bir hücreden cDNA kütüphanelerini ürettikten ve büyüttükten sonra kütüphanelerin kalitesini ve boyutunu değerlendirmek için biyolojik analizci cips kullanıldı. Bu analizin sonuçları, iyi bir numunede ideal cDNA smearlerinin 0.5-2 Kb olduğunu göstermektedir ( Şekil 2A ). Bazı örnekler 300 bp işaretin altında birkaç bant veya smear gösterir, sugBu kütüphanelerin kalitesi düşüktür (sorun giderme için Tablo 1&#39;e bakın). İyi kalitede bir biyolojik analizci izine bir örnek, 300 bp&#39;nin altında DNA bantlarının az veya hiç olmadığını ve 500 bp ile 2 Kb arasında sağlam bir bulaşmayı gösterdiğini göstermektedir (Şekil 2B). Boş kontrol şeritleri dalgalanma göstermeyen istikrarlı bir taban çizgisinin yanı sıra sırasıyla 35 ve 10380 bp&#39;de alt ve üst işaretleri göstermelidir. Çeşitli kütüphaneler, mükemmel okuma derinlikleri ve yüksek haritalama oranları üreten Şekil 2B ve 2C&#39;nin her ikisi tarafından görülebileceği gibi, kaliteli veriler üretebilir. Yalnızca beklenen boyuttaki güçlü cDNA kütüphanelerine sahip olan numuneler, etiketlenmeye kadar taşınmalıdır (sorun giderme için bkz. Tablo 1 ). Düşük girdi etiketleme, sıralama için yüksek kalitede örnekler hazırlar Bu protokol, az miktarda başlangıç ​​maddesiyle etiketleme için optimize edilmiştir.<html> l. Daha düşük miktarlar düzgün şekilde çoğaltılamaz ve daha yüksek miktarlar tamamen parçalanmayacağından, başarılı bir etiketleme için sadece 250 pg en iyi çalışır. Etiketleme ve PCR amplifikasyon / numune temizliğini tamamladıktan sonra, numuneler bir biyoanalizör çipi üzerinde tekrar analiz edildi. Bu noktada ideal cDNA smearleri 0.2-1 Kb olmalıdır ( Şekil 3A ). İz iki boyut arasında pürüzsüz ve düzgün bir şekilde dağılmış görünmelidir ( Şekil 3B ); Bu iz, şerit 1&#39;deki örneğe karşılık gelir. Şekil 3C , kolaylıkla çözülebilecek olan eksik bir etiketlemeyi gösterir (sorun giderme için Tablo 1&#39;e bakın). Numuneler üzerinde veri analizi yaptık ve bu protokolün mükemmel okuma derinliklerine sahip numuneler ürettiğini bulduk; bu, genellikle numune başına 12 milyon okumayı aştı; Ortalama% 69.1 haritalama; Ve 5.000&#39;in üzerinde ifade edilen gen. <html> /55229fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: Melanopsin ifade eden ipRGC&#39;lerde GFP Anlatımına ve Tipolojik Morfolojik Özellikler Üzerine RGC Türlerinin Belirlenmesi. ( A ) Retinanın gangliyon hücresi tabakası, bütün montaj retina preparatında IR-DIC kullanılarak görselleştirildi. ( B ) Aynı preparasyon, GFP ifade eden gangliyon hücrelerini tanımlamak için epifloresansta (~ 480 nm) görselleştirildi. ( C ) Yama-kelepçe kaydı için hedeflenmiş ve flüoresan bir izleyici ile dolu bir GFP ifade eden hücre. Hücre, çok büyük soma boyutuna ve AÇIK katmanlayıcı dendritleri 25 , 26 temel alan bir M4 ipRGC olarak tanımlanabilir. ( D ) IPL&#39;nin (M1) ON ve / veya OFF sublaminasında, IPL&#39;nin (M4) ON alt-minesinde ve IPL&#39;nin (M3) hem AÇIK hem de KAPALI alt-minesinde imgeleyen ipRGC dendritlerinin konfokal görüntüsü. IR-DIC: kızılötesi diferansiyel girişim kontrastı..jove.com / files / ftp_upload / 55229 / 55229fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55229/55229fig2.jpg" /> Şekil 2: Bir Bioanalizör İzi ile cDNA Kütüphanesinin Kalitesinin Analizi. ( A) Ters transkribe, amplifiye edilmiş ve saflaştırılmış birden çok numune için biyoanalizör çıktı örneği. Şerit 1-3, DNA&#39;nın çoğunluğu 300 bp&#39;den daha büyük olan ideal DNA smearlerini gösterir. Bu aralıktaki lekeleri olan kütüphaneler, hücre başına sürekli olarak ortalama 5,683 gen ifade eden mükemmel sıralama verileri sağlamıştır. Şerit 4, başarısız bir şekilde işlenmiş olan bir cDNA örneği üreten bir örneği temsil etmektedir. Başarılı kontrol şeridi, sabit bir taban çizgisine ve 35 ve 10,380 bp&#39;de iki temiz pike sahiptir. ( B ) 2 Kb civarında yüksek yoğunluklu cDNA ile başarılı bir biyoanalizör izinin örneği. Bu s<html> Mear, şerit 1&#39;deki numuneye karşılık gelir. ( C ) cDNA 500 bp civarında ortalanmış başarılı bir biyoanalizör izinin örneği. Bu iz 3 şeridindeki örneğe karşılık gelir <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55229/55229fig2large.jpg" target="_blank">. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen burayı</a> tıklayınız <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55229/55229fig2large.jpg" target="_blank">.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55229/55229fig3.jpg" /> Şekil 3: Etiketli Örnekler 0-2 ve 2 Kb arasında Sağlam Yırtıkları Gösteriyor. ( A ) Etiketleme, amplifikasyon ve PCR temizlemesini takiben temsilci bir örnek biyoanalizör çıktısı. ( B ) (A) &#39;daki şerit 1&#39;e karşılık gelen başarıyla etiketlenmiş bir numunenin izi. ( C ) 1 Kb&#39;lik zirve yoğunluğuyla temizlenen, tamamlanmamış etiketleme ile bir numunenin izinin örneği.&quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sorun </td><td> Muhtemel neden </td><td colspan="2"> Çözüm </td></tr><tr><td> Adım 3.3) GΩ mühür oluşturamıyor </td><td> Hücrenin yüzeyi yeterince temiz değil </td><td colspan="2"> Pozitif basınç kullanarak daha da temizleyin </td></tr><tr><td> Adım 3.3) Hücre, deflate / ölmek üzere görünüyor </td><td></td><td colspan="2"> Yeni pipet hazırlayın ve yeni bir hücre hedefleyin </td></tr><tr><td> Adım 3.4) Dendritlerin terminal konumunu belirleyemiyorum </td><td> Alexafluor&#39;un hücre boyunca yayılması için yeterli zamanı olmadığı veya konsantrasyonunun Alexafluor&#39;un yeterince yüksek olmadığı </td><td colspan="2"> Kameradaki kazanç ve pozlamanın yeterince yüksek olduğundan emin olmak için kontrol edin. Dendritleri görmeden önce 5 dakika daha bekleyin. Dendritler hâlâ görünür değilse, yüksek Alexafluor ile çözelti hazırlayınkonsantrasyonu. </td></tr><tr><td> Adım 4.1) Tüm sitoplazmayı aspire edilemiyor </td><td></td><td colspan="2"></td></tr><tr><td> Adım 5.5) Süpematan 8 dakika sonra net değil </td><td></td><td colspan="2"> Hâlâ manyetik ayırıcı üzerinde iken, tüm çözeltiyi iki kez hafifçe pipetleyin ve 5 dakika daha bekletin </td></tr><tr><td> Adım 5.5) Pellet, pipetleme sırasında dağılır. </td><td> Numune mıknatıstan çok uzak </td><td colspan="2"> Tüm pipetleme sırasında tüpleri manyetik ayırma cihazında tutun. Çözümü boşaltın ve boncukların 5 dakika boyunca tekrar pelet olmasına izin verin </td></tr><tr><td> Adım 5.7) 5 dakika sonra örnekler hala parlak görünür </td><td> Maksimum EtOH miktarı kaldırılmadı </td><td colspan="2"> Kurutma sırasında örnekleri izlemeye devam edin. Her 2 dakikada bir P10 pipet kullanın ve tüpün altındaki EtOH&#39;leri çıkarın </td></tr><tr><td> Adım 8.9) Pelet, rehidrasyon öncesinde çatlaklara sahiptir. </td><td></td><td colspan="2"> Numunenin rehin alınmasına izin verToplam 2 dakika değil, toplam 4 dakika sürmelidir (Adım 8.10) </td></tr><tr><td> Adım 8.11) Az miktarda boncuk süpernatanla yetiştirildi </td><td></td><td colspan="2"> Tüm numuneyi tüpe geri çekin ve 1 dakika boyunca manyetik ayırıcıya yerleştirin; Yavaşça pipetleyin ve pelet önlemeye dikkat edin </td></tr><tr><td> Adım 8.12) DNA smearları tutarsızdır ve fluoresan ölçeği sürekli olarak değişir </td><td> HS çipi için çok yüksek DNA konsantrasyonu </td><td colspan="2"> Numunenin konsantrasyonunu kontrol edin ve 1 - 10 ng / μL arasında seyreltin. Biyolojik analizciyi tekrar çalıştır </td></tr><tr><td> Adım 8.12) Düşük moleküler ağırlıklı smear </td><td> RNA Degradasyonu </td><td colspan="2"> Toplama işleminden hemen sonra dondurma hücresini hızlı bir şekilde flaşlamaya dikkat edin. Bu cDNA kitaplığını at </td></tr><tr><td> Adım 8.12) Kontrol şeridinde dalgalı marker taban çizgisi </td><td> Kirlilik veya eski reaktif </td><td colspan="2"> DNA markerini atın ve Bioanalyzer için yeni bir tüp çalıştırın </td></tr><tr><td> Adım 8.12) DNA zımbası yok </td><td> Hücrenin atılmaması </td><td colspan="2"> Biraz daha büyük bir uçla yeni iğneler çekin </td></tr><tr><td></td><td> RNA Boncuk Hasarı </td><td colspan="2"> Kullanmadan önce boncukların tamamen süspansiyon haline getirildiğinden emin olun ve örneklerin manyetik ayırıcıya yerleştirilmeden önce inkübe edilmesine izin verin </td></tr><tr><td> Adım 8.12) Zayıf DNA zımbası </td><td> Yeterli amplifikasyon yok </td><td colspan="2"> Daha fazla PCR döngüsü istif et </td></tr><tr><td> Adım 8.12) 500 bp-2Kb aralığının dışındaki DNA smear </td><td></td><td colspan="2"> DNA smearının 0.5&#39;in altında ve 2 Kb&#39;nin üstünde olması muhtemel kirliliktir. Örneği at </td></tr><tr><td> Adım 8.12) DNA izi üzerinde düzenli olarak aralıklı sivri uçlar </td><td> Numunenin kirlenmesi </td><td colspan="2"> Daima yeni eldiven giyin ve durulamalar için yeni etanol yapın; Filtre ipuçları her zaman kullanılmalıdır </td></tr><tr><td> Adım 9.3) Florometredeki numunenin konsantrasyonu tespit edilemedi </td><html><td></td><td colspan="2"> Algılama seviyesinin altındaki örneklerin etiketlenmesi için çok az DNA var ve kullanılamıyor </td></tr><tr><td> Adım 10.10) Numuneler 10 dakika sonra kuru değildir </td><td> Fazla EtOH&#39;yi uzaklaştırmaya devam et </td><td colspan="2"> Örneklerin daha uzun süre havadaki kurumasına izin verin, onları her dakikada kontrol edin </td></tr><tr><td> Adım 10.13) 2Kb&#39;ye doğru eğrilmiş leke </td><td> Eksik tamamlama </td><td colspan="2"> Numuneyi, 0.2 ng / μL yerine 0.15 ng / μL konsantrasyonda tekrar seyreltin; Etiketi yeniden çalıştır </td></tr><tr><td> Adım 10.13) 200bp&#39;ye doğru eğrilmiş leke </td><td> Çok az DNA girişi </td><td colspan="2"> Numuneyi daha az seyreltin, 0.4 ng / mL&#39;lik bir konsantrasyon deneyin; Etiketi yeniden çalıştır </td></tr><tr><td></td><td> Etiketleme reaksiyonu çok uzun </td><td colspan="2"> Etiketlenmenin tepki süresini 8 dakikaya düşürün </td></tr><tr><td> Adım 10.13) Zayıf smearler </td><td> DNA&#39;nın yanlış Amplifikasyonu </td>2 &quot;&gt; Numuneyi 0.4 ng / mL konsantrasyona seyreltin ve tekrar etiketleme yapın </td></tr><tr><td> Adım 11.2) Elde edilen maksimum havuz konsantrasyonu 5 nM&#39;nin altındadır. </td><td></td><td colspan="2"> Hangi örnek (ler) in önemli ölçüde düşük konsantrasyonlara sahip olduğunu belirleyin ve yeni dilüsyon ile etiketleme işlemini tekrarlayın </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Protokoldeki Potansiyel Engeller için Çözümler ve Öneriler. Bu tablo, bu protokol sırasında oluşabilecek olası güçlükleri ve bunlarla karşılaşılabilecek adımları listeler. Bu tablo, bu sorunların birçoğunun olası nedenlerini ve herhangi bir sorunu çözmeye yardımcı olabilecek çözümleri listeler.

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Görüntüleme.  Iowa State University.  Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar. 

Video: Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Nörobilim

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Biyomühendislik

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies revealing novel paradigms in vascular biology. Applying these methods to models of vascular development requires the optimization of cell isolation techniques from embryonic and postnatal tissues. Cell yield, viability, and purity all need to be maximal to obtain accurate and reproducible results from next-generation sequencing approaches. The neonatal mouse retinal vascularization model is used by researchers to study mechanisms of vascular development. Researchers have used this model to investigate mechanisms of angiogenesis and arterial-venous fate specification during blood vessel formation and maturation. Applying next-generation sequencing techniques to study the retinal vascular development model requires optimization of a method for the isolation of retinal endothelial cells that maximizes cell yield, viability, and purity. This protocol describes a method for murine retinal tissue isolation, digestion, and purification using fluorescence-activated cell sorting (FACS). The results indicate that the FACS-purified CD31+/CD45- endothelial cell population is highly enriched for endothelial cell gene expression and exhibits no change in viability for 60 min post-FACS. Included are representative results of next-generation sequencing approaches on endothelial cells isolated using this method, including bulk RNA sequencing and single-cell RNA sequencing, demonstrating that this method for retinal endothelial cell isolation is compatible with next-generation sequencing applications. This method of retinal endothelial cell isolation will allow for advanced sequencing techniques to reveal novel mechanisms of vascular development.

This protocol describes a method for the isolation of murine postnatal retinal endothelial cells optimized for cell yield, purity, and viability. These cells are suitable for next-generation sequencing approaches.

Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Gelişim Biyolojisi

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during development and in disease states. Single-cell RNA sequencing allows us to comprehensively profile gene expression changes observed in retinal development and disease at a cellular level, while single-cell ATAC-Seq allows analysis of chromatin accessibility and transcription factor binding to be profiled at similar resolution. Here the use of these techniques in the developing retina is described, and MULTI-Seq is demonstrated, where individual samples are labeled with a modified oligonucleotide-lipid complex, enabling researchers to both increase the scope of individual experiments and substantially reduce costs.

Here, the authors showcase the utility of MULTI-seq for phenotyping and subsequent paired scRNA-seq and scATAC-seq in characterizing the transcriptomic and chromatin accessibility profiles in retina.

scRNA-Seq ve scATAC-Seq Kullanarak Retinal Gen Ekspresyonu ve Kromatin Erişilebilirliğinin Multipleks Analizi

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

Longitudinal In Vivo Imaging of Retinal Cells with Tailored Adeno-Associated Virus Serotypes via Confocal Scanning Laser Ophthalmoscopy

The dynamic nature of retinal cellular processes necessitates advancements in gene delivery and live monitoring techniques to enhance the understanding and treatment of ocular diseases. This study introduces an optimized adeno-associated virus (AAV) approach, utilizing specific serotypes and promoters to achieve optimal transfection efficiency in targeted retinal cells, including retinal ganglion cells (RGCs) and M&#252;ller glia. Leveraging the precision of confocal scanning laser ophthalmoscopy (CSLO), this work presents a non-invasive method for in vivo imaging that captures the longitudinal expression of AAV-mediated green fluorescent protein (GFP). This approach eliminates the need for terminal procedures, preserving the continuity of observation and the well-being of the subject. Furthermore, the GFP signal can be traced in AAV-infected RGCs along the visual pathway to the superior colliculus (SC) and lateral geniculate nucleus (LGN), enabling the potential for direct visual pathway mapping. These findings provide a detailed protocol and demonstrate the application of this powerful tool for real-time studies of retinal cell behavior, disease pathogenesis, and the efficacy of gene therapy interventions, offering valuable insights into the living retina and its connections.

This protocol describes the use of adeno-associated virus (AAV) vectors for cell-specific labeling and in vivo imaging using a confocal scanning laser ophthalmoscope (CSLO). This method enables the investigation of different retinal cell types and their contributions to retinal function and disease.

The dynamic nature of retinal cellular processes necessitates advancements in gene delivery and live monitoring techniques to enhance the understanding ...

Isolating Murine Retinal Ganglion Cells Using Fluorescence-Activated Cell Sorting

Source: Chintalapudi, S. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55785">Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the procedure for isolating murine primary retinal ganglion cells (RGCs) by using flow cytometry. This method allows for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralaması Kullanılarak Murin Retinal Ganglion Hücrelerinin İzole Edilmesi

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1. Preparation of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nöronal Kültür Teknikleri

Birincil Nöronal Kültür

Quantification of Retinal Ganglion Cell Somas Following Cauterization-Induced Ocular Hypertension 

<a href='https://app.jove.com/v/63442/full-circle-cauterization-limbal-vascular-plexus-for-surgically'>Source: Lani-Louzada, R., et al.&#160; Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents. J. Vis. Exp. (2022).</a>This video demonstrates the quantification of retinal ganglion cells from chemically fixed rat retinas subjected to full-circle cauterization of the limbal vascular plexus. The process includes permeabilization, antibody staining, and nuclear counterstaining, followed by visualization under an epifluorescence microscope to assess the impact of elevated intraocular pressure on retinal ganglion cell viability.

Source: Lani-Louzada, R., et al.&#160; Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents. J. Vis. Exp. ...