Diese Arbeit wurde durch einen V Scholar Award (V2014-004) und ein Gelehrter V plus Award (D2016-030) von der V Foundation for Cancer Research und eine amerikanische Krebs Gesellschaft institutionelle Research Grant (ACS IRG Grant 58-006-53) an der Purdue University Center für Krebs unterstützt. Forschung. E. G. P. wurde von der Borch Graduate Endowment Award an der Purdue University medizinische Chemie und Molekulare Pharmakologie Abteilung unterstützt.

1. Vorbereitungen <ol><li>vorbereiten 100 mL Hypotonische Lösung Puffer A: 0,3 M Saccharose, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, und 0,5 % NP-40. Bei 4 º c. 
	Hinweis: Einige Zelllinien, wie HEK293T, erfordern weniger strenge Lysiereinrichtung Auflagen. Wenn Kerne leicht lösen, benutzen Sie geändert Puffer A: 25 mM HEPES pH 7.6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,05 mM EDTA 0,1 % NP-40 und 10 % Glycerin.</li>
	<li>Bereiten eine 250 mL Stammlösung 2 X mRIPA Lösung: 100 mM Tris pH 8.0, 2 % NP-40 und 0,5 % Natrium-Deoxycholate.</li>
	<li>Bereiten eine 100 mL Stammlösung 5 M NaCl.</li>
	<li>Mit 2 X mRIPA und 5 M NaCl-Lösungen, 50 mL 1 X mRIPA-Lösung für jede der sechs Salzkonzentrationen vorbereiten: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM und 500 mM NaCl. Vor Beginn des Experiments, alle Lösungen auf Ice cool</li>
	<li>Grow Zellinien gewünschten Bedingungen. 
	Hinweis: Wenn Sie die Auswirkungen der umzuwerfen eines Proteins zu bestimmen, muss SSE für die Knockdown Linie mit Wildtyp-Zellen verglichen werden. Diese SSE muss nebeneinander durchgeführt werden. Für Beispiele für die Verwendung von chemischen Inhibitoren oder Reize, siehe Abschnitte 3-5.</li>
</ol> 2. Grundlegenden sequenzielle Salzgewinnung <ol><li>Ernte 8 Millionen Zellen der einzelnen Zustand und zweimal mit 5 mL Eis kaltem PBS waschen. 
	Hinweis: Es ist entscheidend für die gleiche Anzahl von Zellen zu entsprechenden Proteinkonzentrationen haben. Die genaue Anzahl der Zellen müssen für die einzelnen Zell-Linien oder bestimmte Proteine optimiert werden. Es ist wichtig, nicht zu viele, da der Anstieg der Proteinkonzentrationen Beobachtung der Elution Kurve, verhindert das Gleichgewicht Bindung abhängt. Jedoch mit zu wenig Zellen möglicherweise nicht genügend Protein um die Kurve zu erkennen und das Chromatin-Pellet ist schwieriger zu isolieren und verloren zwischen Brüchen.</li>
	<li>Wieder aussetzen Zellen in 1 mL Puffer A + Protease-Inhibitoren, transfer in 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren und drehen oben über Boden bei 4 ° c für 10 min.</li>
	<li>Isolieren die Kerne durch Zentrifugation bei 6000 X g für 5 min bei 4 ° c. 
	Hinweis: Nach diesem Schritt sollte die Kernhülle noch intakt sein. Wenn die Kernhülle intakt ist, wird das Pellet vollständig neu aussetzen; jedoch wird wenn der Umschlag lysiert und das Chromatin wird freigegeben, das Pellet nicht erneut aussetzen. Wenn die Kernhülle nach Puffer A Inkubation nicht intakt ist, verwenden Sie modifiziert Puffer A.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL mRIPA 0 mM NaCl + Protease-Inhibitoren, jedes Kerne Pellet vor Aussetzung neu Pellet. 15-Mal mit einer 1-mL-Pipette pipettieren, um jede Probe zu homogenisieren. Das Pellet sollten leicht wieder auszusetzen, jedoch wird die Kerne lösen, wie es Pipettieren ist und die Probe wird dick und klebrig und schwer zu pipette.
	<ol><li>Um das Pellet in der Spitze aufzustellen, tippen am Ende die Pipettenspitze gegen die Unterseite des die Zentrifugenröhrchen. Das Pellet wird nicht vollständig auflösen, sobald die DNA wird aus den Kernen entlassen, aber Pipettieren bricht es auf</li>
	</ol></li> <li>Wenn alle Proben homogenisiert worden sind, brüten die Proben auf Eis für 3 min. 
	Hinweis: Die Inkubationszeit kann je nach Protein des Interesses optimiert werden müssen.</li>
	<li>Isolieren Chromatin Pellet durch Zentrifugieren die Proben für 3 min bei 6500 X g bei 4 º c.</li>
	<li>Transfer überstand zu einer Zentrifuge sauber 1,5 mL Tube. Dies wird die Fraktion 0 mM sein. Diese 0 mM mRIPA Lösung kann fungieren als ein Waschschritt zur Lyse der Kerne und entfernen Sie alle losen Proteine nicht im Zusammenhang mit Chromatin.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL mRIPA 100 mM NaCl + Protease-Inhibitoren, jedes Chromatin Pellet vor Aussetzung neu Pellet. Unterteilen Sie das Chromatin Pellet durch pipettieren die Kugel nach oben und unten 15 Mal. 
	Hinweis: Es ist entscheidend für die Anzahl der Wiederholungen entsprechen die Pellet in pipettiert.</li>
	<li>Inkubation für 3 min auf Eis. Diese Inkubationsschritt kann alle Proben einen Gleichgewichtszustand zu erreichen, was besonders wichtig ist, gibt es mehrere Proben.</li>
	<li>Zentrifuge bei 6500 X g für 3 min bei 4 ° c und Übertragung Überstand auf eine saubere 1,5 mL-Tube.</li>
	<li>Wiederholen Sie 2,6-2.10 für die verbleibenden Salzkonzentrationen. 
	Hinweis: Nach 400 mM NaCl, mRIPA das Pellet sollte klar und glitschige und bleibe nicht am Boden des Röhrchens. Das Pellet in den Deckel des Zentrifugenröhrchen während des Überstands isoliert platziert werden kann.</li>
	<li>Hinzufügen 70 µL 4 x Protein laden färben, jede Fraktion und laden Sie 30 µL der einzelnen Fraktionen auf ein SDS-Acrylamid-Gel für die western-Blot Analyse. 
	Hinweis: Um das verbindliche Profil des Proteins zu bestimmen, ist es wichtig, entsprechende Mengen an lysate, anstatt be-gleich Proteinkonzentrationen laden.</li>
	<li>Führen Sie eine standard-western-Blot durch die Übertragung auf eine Membran und primären Antikörper für interessierender Proteine.</li>
	<li>, Das Protein aus dem Chromatin eluiert quantitate inkubieren der Blot in Infrarot-Fluoreszenz IRDye Sekundärantikörper und Bild Blot mit einem Imager. Während andere Methoden der Entwicklung verwendet werden können, empfehlen wir Fluoreszenz oder Infrarot-Bildgebung, wie es in der Natur mehr quantitative.</li>
	<li>Einsatz ImageJ oder ähnliche Software zu berechnen, die Intensität für das Protein an jede Salzkonzentration eluiert. Durch die grafische Darstellung der Band Intensität gegen die Salzkonzentration, die Elution Muster von Ihr Protein des Interesses bestimmt werden kann.</li>
</ol> 3. Sequentielle Salzgewinnung in Anwesenheit von ein &#34; Leser &#34; Inhibitor <ol><li>zwei Gruppen von Zellen (4 Millionen) zu ernten und isolieren die Kerne wie in einem standard SSE.</li>
	<li>Wieder auszusetzen, beide in 200 µL mRIPA 0 mM NaCl und 3 min inkubieren. Dadurch wird für die Entfernung von jedem kostenlos Protein in den Kernen.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL mRIPA 0 mM NaCl, jedes Pellet. Hinzufügen der Steuerelementsatz Inhibitor (2 µL 1 mm (+) JQ1) zu einer Probe oder DMSO.</li>
	<li>Rühren die Pellets durch Pipettieren 15mal und inkubieren Sie für 5 min auf Eis</li>
	<li>Zentrifuge bei 6500 X g für 3 min bei 4 ° c und Übertragung Überstand auf eine saubere 1,5 mL-Tube.</li>
	<li>3.3-4 für die Salzkonzentrationen wiederholen und führen Sie eine standard-western-Blot.</li>
</ol> 4. Sequentielle Salzgewinnung in Anwesenheit von ein &#34; Schriftsteller &#34; Inhibitor <ol><li>Zellen mit dem Inhibitor (10 µM SAHA) zu behandeln oder DMSO für 3 h</li>
	<li>Ernte 4 Millionen Zellen für jede Behandlung.</li>
	<li>Führen ein standard SSE für die Proben mit dem Inhibitor hinzugefügt, um die Puffer.</li>
</ol> 5. Sequentielle Extraktion folgende DNA Salzschäden <ol><li>Behandlung von Zellen mit 1 µM Doxorubicin für 1 h.</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium auf die Zellen und lassen sie wieder für 3 h.</li>
	<li>8 Millionen Zellen zu ernten, und führen Sie die grundlegenden SSE.</li>
</ol> 6. Nicht-sequenziellen Salzgewinnung <ol><li>12 Millionen Zellen ernten und waschen mit PBS.</li>
	<li>Kluft Zellen, so dass es 2 Millionen Zellen pro Mikro Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Neu in 500 µL Puffer A und 10 min. inkubieren</li>
	<li>Isolieren Sie die Kerne durch Zentrifugation bei 6000 X g.</li>
	<li>In 200 µL der einzelnen mRIPA Puffer + NaCl pellets wieder auszusetzen.</li>
	<li>Homogenisieren jede Probe durch Pipettieren 15-Mal mit einer Pipettenspitze 1 mL.</li>
	<li>Inkubation auf Eis für 3 min.</li>
	<li>Isolieren das Chromatin durch Zentrifugation bei 6500 X g und übertragen den Überstand um Rohre zu reinigen. Hinzufügen von 70 µL Farbstoff zu laden und ausführen 30 µL auf einem SDS-Page-Gel für die western-Blot Analyse.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Charakterisierung von Protein und Chromatin-Interaktionen durch Salz Extraktionen ist eine gängige Methode, die beschäftigt war für Jahrzehnte14,15; jedoch wurde es nicht systematisch vor optimiert, um den vollen Nutzen zu offenbaren. Wir zeigen, wie diese sequenziellen Methode bietet eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Veränderungen im Chromatin Bindung zu unterscheiden, wenn das Protein oder die Umwelt geändert wird. SSE ist sehr anpassungsfäh...

DNA-Verordnung in eukaryotischen Zellen ist eine komplizierte und anspruchsvolle System, die durch ein Sortiment von Proteinen hochstrukturiert ist, die Antworten auf die intrazelluläre und extrazelluläre Stimuli zu koordinieren. DNA ist Histon Octamers zur Form Nukleosomen, gewickelt, lose verteilt entlang DNA oder in engen Spulen1verdichtet werden können. Diese strukturelle Anordnung der DNA und Histonen bekannt als Chromatin, die durch ein Netz von Proteinen, die lesen, schreiben und löschen Post translationale Modifikationen (PTM) auf Histone2geregelt ist. Einige Histon PTMs, wie Acetylierung, ändern die Ladung der Aminosäure, die sie auf, abgelagert werden Wechselwirkungen zwischen Histonen und DNA-2zu verändern. Histon-PTMs dienen auch zur transkriptionellen Regulierungsbehörden, Chromatin Remodelers, DNA-Schäden reparieren Maschinen und DNA-Replikation Maschinen auf bestimmte Regionen des Genoms3zu rekrutieren.
Die meisten Methoden zur Untersuchung Chromatin Wechselwirkungen Sonde kleinen Interaktionen oder große genomweite Analysen beinhalten. In Vitro Bindung Studien nutzen oft einzelne rekombinante Domains mit Histon-Peptide oder DNA in Tests wie Elektrophorese Mobilität Verschiebung Assays (EMSA), Isotherm Titration Kalorimetrie, Fluoreszenz-Polarisation und Peptid Pulldowns. Da diese Tests in der Regel auf eine einzelne Protein-Domäne konzentrieren, sie erleichtern das Verständnis von einem kleinen Stück des Puzzles, aber lassen Sie sich nicht uns zu verstehen, die kooperative Art der multidomain Proteine, geschweige denn ihre Rolle in Multi-protein -komplexe. Eine weitere Schicht der Komplexität wird durch die heterogene Zusammensetzung der meisten Säugetiere Chromatin-modifizierende komplexe hinzugefügt. Diese Heterogenität Protein macht in Kombination mit der dynamischen Natur der Chromatin-Landschaft, eine Herausforderung, um die in Vivo an Chromatin in VitroInteraktionen der Chromatin Proteine binden zu rekapitulieren.
In-Vivo -Methoden haben bedeutende Fortschritte gemacht; Allerdings sind sie oft teuer, zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll. Chromatin Immunopräzipitation gefolgt durch Sequenzierung (ChIP-Seq) ist sehr nützlich für die Bestimmung der Lokalisierung von Proteinen und Histon-Modifikationen in das Genom, aber es erhebliche Optimierung4 erfordert. Proteine sind oft vernetzt, Chromatin, Interaktionen zu bewahren; Allerdings können künstliche Interaktionen produzieren und kann dazu führen, dass Epitop Maskierung5. Darüber hinaus erfordern die Immunperoxidase (IP) hochspezifische Antikörper und umfassende Optimierung von DNA zu scheren und IP-Bedingungen von ChIP-qPCR mit einer bekannten Bindungsstelle, die oft nicht verfügbar- a-prioriist. Nach der Optimierung von ChIP Bedingungen Verarbeitung der Proben ist aufwändig und erfordert mehrere Wochen bis Monate, zu sequenzieren und analysieren. Obwohl dieses Verfahren von unschätzbarem Wert für die Ermittlung der Lokalisierung von Chromatin Proteine gebunden über das Genom, die Kosten und Zeitaufwand machen es unerschwinglich zur Verwendung dieser Methode zum Generieren von Hypothesen darüber, wie kleine Veränderungen globalen Bindungseigenschaften beeinflussen kann .
In diesem Artikel beschreiben wir wie ein sequentielle Salzgewinnung (SSE) Assay verwendet werden kann, global verbindliche Profile von Chromatin-gebundene Proteine untersuchen und unterscheiden, wie Änderungen in einem Protein, komplexe oder globale PTM Profil Interaktionen verändern können. Obwohl Salz Extraktionen allgemein und allgemein verwendete Technik sind, zeigen wir, wie diese sequenziellen Methode äußerst reproduzierbare und vielseitig ist. SSE erlaubt uns zu charakterisieren, wie eine einzelne Untereinheit eines Komplexes oder sogar einer einzelnen Domäne, die Anlage insgesamt Affinität für Schüttgut Chromatin beiträgt. SSE kann auch verwendet werden, um festzustellen, ob die Bindung eines Proteins ist beeinflusst durch Änderungen im Chromatin Landschaft, bietet interessante Hypothesen für Histon Mark targeting, die mittels ChIP-Seq und andere Genom breite Studien bestätigt werden können.
Wir ursprünglich diese Methode von Wu Et Al., prüfen der Funktion des Polybromo1 angepasst (PBRM1) in der Bindung der PBAF Chromatin Fertighausbau6,7. Mit dieser Technik, wir die Rolle des PBRM1 für Chromatin Bindung innerhalb der PBAF Chromatin Umbau komplexer und dann bestimmt den relative Beitrag der sechs einzelnen Bromodomänen zu dieser Funktion7.
Hier beschreiben wir wie Sie diese Methode, um Chromatin Bindung in verschiedene Zelltypen zu beurteilen, die relative Bindungsaffinität von ähnlichen Chromatin bearbeiten komplexe, untersuchen die Verschiebung eines Proteins aus Chromatin durch einen chemischen Inhibitors erkunden zu optimieren und Ermittlung die Auswirkungen von Chromatin Bindung nach Veränderungen der Chromatin-Landschaft.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, Crystal 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>8360-04</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &gt;=99.9% (titration), crystalline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>4931-02</td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td><td>Amresco</td><td>E109-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>GLYCEROL, 1L</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-690-032</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td><td>Cell Signaling</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>BMI-1 antibody</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBRM1 antibody</td><td>Bethyl</td><td>A301-591A</td><td></td></tr><tr><td>ARID1a antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32761</td><td></td></tr><tr><td>BRD4 antibody</td><td>Bethyl</td><td>A301-9852a</td><td></td></tr><tr><td>(+) JQ1</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>11187</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10009929</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>AK Scientific</td><td>25316-40-9</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Macron</td><td>4948-02</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini Gel Tank</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, Bovine (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100g</td><td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td></tr><tr><td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0001</td><td></td></tr><tr><td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td><td>Macron</td><td>3041-10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin kEDTA, 1X</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td><td>Amresco</td><td>0639-250G</td><td></td></tr><tr><td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td><td>Amresco</td><td>0227-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine,for electrophoresis, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898-1kg</td><td></td></tr><tr><td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L Pipet Tips</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125BOX</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>22035-0.005</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>APROTININ, 10 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>20550-0.01</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>PEPSTATIN A, 5 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>30100-0.005</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>OVCA429 cells</td><td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>McCoy&#039;s 5A media</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td><td>Corning Mediatech</td><td>50-011-PC</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>VWR Power Source</td><td>VWR</td><td>13-690-032</td><td></td></tr></tbody></table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

Aufklärung der Bindungseigenschaften von Chromatin-targeting Proteinen kann aufgrund der komplexen Natur des Chromatins und der heterogenen Natur der meisten Säugetiere Chromatin-modifizierende komplexe sehr anspruchsvoll sein. Um diese Hürden zu überwinden, haben wir einen sequenzielle Salzgewinnung (SSE) Assay für die Bewertung der relativen verbindliche Affinitäten der Chromatin-gebundene komplexe angepasst. Dieser Assay einfach und unkompliziert einsetzbar von nicht-Experten bewerten die relative Differenz verbindliche Affinität von zwei verwandte komplexe, die Veränderungen in Affinität eines Komplexes als eine Untereinheit verloren ist oder eine einzelnen Domäne wird inaktiviert und die Veränderung der Bindungsaffinität nach Veränderungen der Chromatin-Landschaft. Durch das nacheinander wieder aufhängen Bulk Chromatin in steigenden Mengen von Salz, können wir die Elution eines bestimmten Proteins aus Chromatin Profil. Diese Profile können wir bestimmen, wie Änderungen in einem Chromatin-modifizierende komplex oder Änderungen an der Chromatin-Umwelt bindender Wechselwirkungen auswirken. Kupplung SSE mit anderen Tests in Vitro und in Vivo , bestimmen wir die Rollen der einzelnen Domänen und Proteinen auf die Funktionalität eines Komplexes in einer Vielzahl von Chromatin-Umgebungen.

In diesem Beitrag zeigen wir die Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der häufig verwendeten sequentielle Salzgewinnung (SSE) Methode, die wir aus der Literatur6angepasst haben. In Abbildung 1vergleichen wir die Reproduzierbarkeit der SSE, Proteine nicht sequenziell zu kassieren, indem die Elution Muster von ARID1a und PBRM1 zu erkennen. Wir beobachten immer wieder, dass ARID1a, BAF-Untereinheit elutes in erster Linie bei 200 mM NaCl...

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

sequential-salt-extractions-for-analysis-bulk-chromatin-binding

Research

JoVE Journal

Genetics

8.3K Aufrufe.  Purdue University. Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Serie: Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Forschung

Genetik

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Medizin

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Krebsforschung

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Biologie

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Identifizierung von MyoD Interaktom Gekoppelt Mit Tandem Affinity Purification zu Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single strands, each requiring distinct modes of replication: continuous (leading) and discontinuous (lagging). Understanding the interactions of chromatin-associated proteins with replicating DNA strands in vivo is crucial for elucidating the mechanisms of chromatin assembly and DNA repair coupled to DNA replication. This protocol presents the enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) method, designed to quantify relative protein levels on nascent leading and lagging DNA strands at replication forks. The eSPAN procedure starts with chromatin immunoprecipitation (ChIP, in yeast) or cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag; in mammalian cells) of a protein of interest, followed by enrichment of the protein-associated nascent DNA by bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitation. Strand-specific next-generation sequencing is applied to isolated ssDNA. This technique can be used to determine whether a protein is enriched at leading or lagging replication forks. The eSPAN provides genome-wide strand-preference of chromatin-associated proteins, including histones at replication forks.

Enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) was developed to detect the relative abundance of a chromatin-associated protein on two replicating DNA strands, thereby revealing molecular insight into chromatin replication and its coupled processes. This protocol describes eSPAN procedures in yeast and mouse embryonic stem (ES) cells.

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

Chromatin Immunoprecipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex called &#8220;chromatin&#8221;. These proteins can be modified through the addition of chemical groups, and these changes affect gene expression. Researchers use a technique called chromatin immunoprecipitation (ChIP) to better understand which DNA regions associate with specific histone modifications or other gene regulatory proteins. Antibodies are used to isolate the protein of interest, and the bound DNA is extracted for analysis. Here, JoVE presents the principles behind ChIP, discussing specific histone modifications and their relationship to gene expression and DNA organization. We then review how to perform a ChIP protocol, and explore the ways scientists are currently using this technique.

Chromatin-Immunpräzipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex ...