Diese Protokolle sind wichtig, weil sie detaillierte Schritte zur Validierung der Wirksamkeit und Selektivität neuartiger HAT-Hemmer bieten, die wichtige Forschungsinstrumente und potenzielle Therapeutika sind. Die in diesem Video demonstrierten Techniken sind einfach durchzuführen und liefern Informationen über die Auswirkungen von HAT-Hemmern auf die globale und regionale Histonacetylierung. Sie ermöglichen es, die epigenetische Regulation der Genexpression zu verstehen.
Die Liebe zum Detail ist entscheidend. Es ist wichtig, die Protokolle Schritt für Schritt zu befolgen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der enzymatischen Reaktion in einem 10-Mikroliter-Volumen in einem 0,2 Milliliter PCR-Rohr nach Manuskriptanweisungen.
Dann inkubieren Sie das komplette Reaktionsgemisch bei 30 Grad Celsius für eine Stunde in einem PCR-Thermocycler. Fügen Sie in der Zwischenzeit zwei Mercaptoethanol im Verhältnis eins bis zehn zum 6X SDS-Probenpuffer hinzu. Entfernen Sie Proben aus dem PCR-Thermocycler und fügen Sie jedem Reaktionsmix zwei Mikroliter des vorbereiteten SDS-Probenpuffers hinzu.
Die Proben auf 95 Grad Celsius auf einem Wärmeblock auf 95 Grad Celsius erhitzen und dann auf Eis abkühlen. Bewahren Sie die Proben bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius auf oder fahren Sie mit Gelelektrophorese und Immunoblotting fort. Samen 100, 000 MCF-7-Zellen in einem Milliliter Zellkulturmedium in jeden Brunnen einer 12-Well-Platte und lassen die Zellen bis zu 80 bis 90% Konfluenz wachsen.
Wenn die Zellen die gewünschte Konfluenz erreichen, aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus den Brunnen vier, fünf und sechs und Pipette einen Milliliter von drei Mikromolaren MS275 in Medium in jedem Brunnen. Dann aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus den Brunnen eins, zwei und drei, und Pipette einen Milliliter verdünnten DMSO in jeden Brunnen. Geben Sie die Zellen für vier Stunden in den Inkubator zurück, um die Ansammlung von acetylierten Histonen in Zellen, die MS275 ausgesetzt sind, zu ermöglichen.
Während die Zellen inkubieren, bereiten Verdünnungen von A-485 in DMSO nach Manuskriptrichtungen vor. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, das Medium aus den Brunnen aspirieren und die Verdünnungen hinzufügen. Bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück und kultiumieren Sie sie für 20 Stunden, dann saugen Sie das Zellkulturmedium aus den Brunnen und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS.
Aspirieren Sie die PBS und fügen Sie 100 Mikroliter passiveLyse Puffer. Lagern Sie die Platte bei minus 80 Grad Celsius über Nacht. Pipette 100 Mikroliter beschalltes Chromatin aus Zellen, die mit DMSO behandelt werden, in zwei 1,5-Milliliter-Röhren, dann Pipette 400 Mikroliter ChIP-Verdünnungspuffer in jedes Rohr, um das Gesamtvolumen auf 500 Mikroliter zu bringen.
Entfernen Sie fünf Mikroliter der Lösung aus einem der Rohre und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius als DMSO-Eingang. Bereiten Sie zwei Röhren mit beschalltem Chromatin aus Zellen vor, die auf die gleiche Weise mit A-485 behandelt werden. Verwenden Sie eine Pipette, um die Acetyl-Antikörper IgG und H3K27 zu den DMSO- und A-485-Proben hinzuzufügen.
Dann fügen Sie 20 Mikroliter Protein A magnetische Perlen zu jeder Röhre, um sicherzustellen, dass die Perlen gut resuspended sind. Drehen Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius. Pellet das Protein A magnetische Perlen mit einem magnetischen Separator und entfernen Sie den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
Die Perlen mit 500 Mikrolitern auf einen Milliliter Salzwaschpuffer waschen und fünf Minuten bei vier Grad Celsius drehen. Führen Sie einen schnellen Spin down durch, pellet die Perlen mit einem magnetischen Separator und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit hohem Salzwaschpuffer, Lithiumchlorid-Waschpuffer und TE-Puffer.
Nach dem Waschen mit TE-Puffer die Eingangsproben aus dem Gefrierschrank entfernen und auf Eis legen. Einen Aliquot aus Proteinase K auftauen, dann die Perlen mit einem magnetischen Separator pellet und den TE-Puffer aus den Perlen entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter ChIP-Elutionspuffer und einen Mikroliter Proteinase K zu jeder Probe einschließlich der Eingangsproben hinzu und inkubieren Sie sie mit Schütteln bei 62 Grad Celsius für zwei Stunden mit einem Thermocycler.
Nach der Inkubation die Proben 10 Minuten auf 95 Grad Celsius erhitzen und dann auf Raumtemperatur abkühlen. Pellet die magnetischen Perlen mit einem magnetischen Separator und übertragen Sie den DNA-haltigen Überstand auf eine neue 1,5 Milliliter Tube. Reinigen Sie die DNA mit einem Standard-PCR-Bereinigungskit und führen Sie qPCR aus.
Der In-vitro-Histon-Acetyltransferase-Assay wurde verwendet, um die Wirkung von Anacardinsäure auf die p300 HAT-Aktivität auf ein Histonsubstrat zu untersuchen. Ein Konzentrationsbereich wurde getestet und Acetyl-CoA wurde der negativen Kontrollreaktion nicht hinzugefügt. Die Immunoblot-Ergebnisse wurden mit ImageJ quantifiziert, was eine deutliche Reduktion von Acetyl H3K18 und Acetyl H3K9 bei 100 Mikromolar-Anacardsäure im Vergleich zur DMSO-Kontrolle zeigte.
Im Chromatin-Hyper-Acetylierungs-Inhibitionstest, Behandlung von MCF-7-Zellen mit HDACi MS275 stark upreguliertAcetylierung von Histon 3 auf mehreren Lysin-Rückständen. Die Basalwerte von Acetyl H3K18 und Acetyl H3K27 waren niedrig, was die Vorteile der Zugabe eines HDACi im ChHAI-Assay zeigt. Die Zugabe von A-485 in Zellen, die mit MS275 vorbehandelt werden, dämt die erhöhte Histonacetylierung bei H3K18 und H3K27 ab, nicht jedoch H3K9.
Die Immunoblot-Ergebnisse wurden auch mit ImageJ quantifiziert. ChIP qPCR wurde verwendet, um die Auswirkungen von HAT-Hemmern auf Gen-Regulierungselemente zu untersuchen, die die Onkogenexpression steuern. In der DMSO-Probe ergab die durch den IgG-Kontrollantikörper gefällte DNA einen höheren Ct-Wert als der Acetyl-H3K27-Antikörper in der qPCR-Reaktion für den Cyclin-D1-Promotor, was darauf hindeutet, dass die unspezifische IgG-Kontrolle weniger DNA-Histonkomplexe auslöste als der Acetyl-H3K27-spezifische Antikörper am Promotor.
Im Vergleich zur DMSO-Steuerung reduzierte A-485 die Acetyl-H3K27-Anreicherung am Cyclin-D1-Promotor. Wichtig ist, A-485 ist bekannt, acetyl H3K27 in der Zellkultur deutlich zu reduzieren. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass die Vorinkubationsschritte der In-vitro-HAT- und ChHAI-Assays unerlässlich sind und nicht vergessen werden sollten.
Es ist auch wichtig, daran zu denken, die Eingabeproben zu speichern und den Verlust der Perlen während ChIP zu vermeiden. Nach der Durchführung dieser Verfahren ist ChIP-seq eine zusätzliche Methode, die ausgeführt werden kann, um globale Informationen über Histon-Acetylierung an regulatorischen Elementen für das gesamte Genom zu erhalten. Diese Protokolle sind hilfreich für Wissenschaftler, um neuartige HAT-Hemmer sorgfältig zu validieren und die Veröffentlichung minderwertiger chemischer Sonden in der Literatur zu vermeiden.
Die validierten HAT-Inhibitoren können als potenzielle Therapeutika weiterentwickelt werden.
