Wir erkennen die Vienna Drosophila Resource Center und Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) für Drosophila - Stämmen bereitzustellen. Wir danken Jack Fransen vom Mikroskopische Imaging Center für kompetente Unterstützung bei der Bildgebung. Diese Studie wurde von VIDI und TOP Zuschüssen unterstützt (917-96-346, 912-12-109) von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO), die von zwei DCN / Radboud University Medical Center PhD Stipendien vom Deutschen Netzwerk Mentale Retardierung finanziert durch das NGFN + Programm des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) und durch die FP7 der Europäischen Union integrierter Großnetzwerke Gencodys (HEALTH-241995) zu AS. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

&quot;Drosophila NMJ Morphometrics&quot; und &quot;Drosophila NMJ bouton Morphometrics&quot; sind leistungsfähige Werkzeuge für die Forscher interessiert in Synapse Morphologie beurteilen. Manuelle Bewertung der NMJ Parameter ist mühsam; es wird geschätzt, dass die Makros einen erfahrenen Forscher bis zu 15 min sparen würde / NMJ verbrachte auf manuelle Bildsegmentierung. Mit 1.59 Dutzende von ausgewerteten Synapsen pro Zustand oder Genotyp, das summiert sich schnell auf erhebliche Mengen an Zeit gespart, auch in kleinen Studien. Bei großen Bildschirmen durchgeführt wird, die Verstärkung Hochdurchsatzanalyse der Verwendung im Vergleich zur manuellen Bewertung und Quantifizierung kann immens sein. Zusätzlich zu der erhöhten Durchsatz bieten die Makros leicht objektive Analyse; sie schließen persönliche Vorurteile, die sonst geblendet Experimente sowie zwischenmenschliche Unterschiede erfordern, die auftreten, wenn mehrere Forscher bei der Analyse beteiligt sind. Schließlich bieten die Makros eine empfindliche und genaue einalysis von NMJ Funktionen, die Identifizierung von synaptischen Regler ermöglicht, die eher subtil verursachen als dramatische NMJ Defekte und bisher nicht gewürdigt blieb durch das Auge des Forschers. Detaillierte Informationen über Validierungsverfahren und die in den Makros verwendet Algorithmen sind in der Veröffentlichung Nijhof et al. 17. Die Funktionalität der Makros validiert wurde entsprechend 4. morphologische Merkmale von Drosophila melanogaster NMJs Anschließend an Muskel zu messen, wurde gezeigt , dass die Makros auch geeignet waren Synapsen in anderen Muskeln in diesem Organismus zu analysieren. Es ist wahrscheinlich , dass die Makros können auch mit ähnlicher Struktur in anderer Spezies, einschließlich anderen Drosophila - Spezies und weitere Insekten zu messen morphologische Parameter der NMJ verwendet werden. Auch NMJs sehr weit entfernt in der Evolution, zum Beispiel NMJs von Mäusen, zeigt eine ganz ähnliche strukturelle Konformation 29. Die Makros sind nicht auf NMJ Präparate von anderen Spezies getestet worden, aber potenzielle Nutzer werden die Makros für solche Zwecke zu testen gefördert. Es ist sehr wichtig, dass der Benutzer den verschiedenen Auto-Schwellenwerte und Algorithmen untersucht, die am besten geeigneten Makroeinstellungen für die Bilder zu definieren / wählen. Mit diesen Einstellungen wird eine Genauigkeit von etwa 95% erreicht, wenn Makro Beurteilung zur manuellen Auswertung verglichen. die Makro-Einstellungen anpassen, um richtig Segment 100% der Bilder kann ein sehr mühsam oder gar unmöglich Verfahren. Daher Ausschluß von Bildern nicht richtig segmentiert wird empfohlen, wenn ihre Zahl unter 5% liegen. Offensichtlich, wenn die Qualität der Bilder niedrig ist, werden die Makros höhere Verhältnisse unbefriedigender Segmentierung erzeugen. Bilder von niedriger Qualität werden in ähnliche Weise manuelle Auswertung beeinflussen und können daher nicht auf die Leistung des Makros verknüpft werden. Dennoch sind die Makros eher robust, wie sie für Bild entworfen wurdenS auf einen hohen Gehalt Mikroskops (ein automatisiertes Fluoreszenz - Mikroskop , das Abbilden von einer großen Anzahl von Proben ermöglicht) 17 erzeugt. Ein kritischer Punkt ist, dass der Benutzer visuell alle Ergebnisse Bilder von dem Makros erzeugt inspiziert. Dies ermöglicht Bilder mit unbefriedigender Segmentierung zu erkennen und auszuschließen. In Abschnitt 6 dieses Protokolls wird der Benutzer geführt, wie die Einstellungen für eine korrekte Bildsegmentierung einzustellen, wenn der Sub-Makro „Analyze“ ausgeführt wird. Um schnell mit den Anforderungen des Makros vertraut machen und wie die Makro-Einstellungen anpassen ein Ordner namens „Examples_adjusting Makro-Einstellungen“ im Makro-Repository https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a enthalten. Dreizehn Unterordner, die jeweils mit den Beispielen Bildern auf verschiedenen Plattformen Mikroskop (high content / konfokalen / Fluoreszenzmikroskope) und verschiedenen Immunfärbungen erhalten, vorgesehen sind. Ein PDF-Titel „Beispiele guide“ ist in den gleichen enthaltenOrdner, in dem die Einstellungen für jedes Beispiel erforderlich sind, zur Verfügung gestellt, zusammen mit einem Textdokument der erwarteten Ergebnisse und die Ergebnisse Bilder bereitstellt. Die Makros wurden entwickelt, um Bilder gespeichert zu verarbeiten, als TIFF-Dateien getrennt, dennoch einige Nutzer könnten ihre Bilder in einem anderen Format gespeichert haben. Die folgende Website https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 enthält einen Ordner mit dem Namen „Drosophila NMJ“ , wo drei Beispieldateien (Beispiel 1 - 3) und das Dokument „Beispiele Guide“ mit detaillierten Anweisungen , wie Sie Bilder in den Makro importieren wenn nicht als .TIFF separierten Dateien gespeichert sind, können auch im gleichen Ordner. Gemeinsam &quot;Drosophila NMJ Morphometrics&quot; und &quot;Drosophila NMJ bouton Morphometrics&quot; Makros quantifizieren zehn verschiedene NMJ Funktionen: NMJ Bereich, NMJ Umfang, Anzahl der boutons, NMJ bouton Bereich, NMJ Länge, NMJ längste Zweiglänge, Anzahl der islands, die Anzahl der Zweige, die Anzahl der Verzweigungspunkte und die Anzahl der aktiven Zonen. Dies stellt einen großen Vorteil gegenüber bisher verfügbaren Werkzeuge , die 30, 31 nur eine oder wenige synaptischen Funktionen beurteilen können. Multiparametrischer quantitative Analyse trägt ein großes Potenzial für neue Entdeckungen, zum Beispiel neue Regulierer zu identifizieren , die eine Steuerung von bis zu zahlreichen Aspekten der Synapse Biologie. Es bietet auch die erforderliche Auflösung Gene zu bestimmen, die genau die gleichen oder überlappenden Merkmale NMJ coregulate und sind somit wahrscheinlich in gemeinsamen molekularen Wegen zu arbeiten. Schließlich eröffnet sie die Möglichkeit , wie die verschiedenen synaptischen Parameter miteinander in Abwesenheit störender Einflüsse 17 korrelieren zu untersuchen und die Gene dieser koordinierten morphometrische Korrelationen gewährleisten. Zusammengenommen dieses Protokoll zeigt , wie die beiden Makros „Drosophila NMJ Morphometrics“ verwenden , und„Drosophila NMJ Bouton Morphometrie“, die in einer Hochdurchsatz - Weise objektiv und empfindliche Quantifizierung von zehn morphologischen Merkmalen NMJ zuführen.

Kognitive Störungen wie geistige Behinderung, Autismus - Spektrum - Störung und Schizophrenie sind oft durch abnormale synaptische Funktion 1 charakterisiert, 2, 3. Synapse Morphologie und Funktion sind eng miteinander verflochten; morphologische Defekte können synaptischen Störungen und in umgekehrter Richtung, aberrant synaptischen Übertragung 4 synaptischen Reifung und Morphologie wird Auswirkungen verursachen, 5, 6. Eine Reihe von Modellorganismen wurde , um besser zu verstehen , Synapse Biologie und Aufschluss darüber , wie synaptische Veränderungen beeinflussen die Gehirnfunktion in Gesundheit und Krankheit 7, 8, 9 eingesetzt. Das Drosophila NMJ wird ein umfangreich untersucht und gut etabliertes in vivo - Modell für glutamaterge synapse biology 10, 11. In den vergangenen Jahrzehnten hat sich dieses Modell für physiologische und Gen-Studien konzentrierten sich sowie für große genetische Screens, mit dem Ziel eingesetzt morphologischen Unterschiede zwischen NMJs zu erkennen. Insbesondere haben vorwärts genetischen Screens viele wichtige Regulatoren und Mechanismen , die Synapse Entwicklung identifiziert und Funktion 12, 13, 14, 15, 16. die meisten dieser Bildschirme jedoch verließ sich auf die visuelle Beurteilung von NMJ Terminal Morphologie und qualitativen Nachweis der synaptischen Abnormalitäten oder semi-quantitative scoring von wenigen morphologischen Eigenschaften. Als Konsequenz eher subtile synaptischen morphologische Anomalien, die nicht offensichtlich für das menschliche Auge sind, sind leicht zu übersehen. Um umfassend zu können quantitative Unterschiede erkennen, dieNMJ hat genau durch systematische Quantifizierung der morphologischen Parameter von Interesse zu bewerten. NMJ Merkmale Messung manuell ist umständlich, insbesondere, wenn es mehr NMJ Merkmale von Interesse und / oder bei großen genetischen Screenings durchgeführt wird. Um multiparametrischer, Hochdurchsatz - morphologische Analyse zu unterstützen und objektive Quantifizierung zu erreichen, zwei Makros „Drosophila NMJ Morphometrics“ und „Drosophila NMJ Bouton Morphometrics“ wurden 17 entwickelt. Beiden Makros ausführen , in der Open - Source - Bildanalyse - Software Fiji 18 und können sowohl konfokale und nichtkonfokalen Bilder quantifizieren. „Drosophila NMJ Morphometrie“ misst NMJ Terminals mit der postsynaptischen Spuranreißerscheibe immunhistochemisch groß-1 (HLG-1) oder der präsynaptischen Meerrettich - Peroxidase (HRP), mit dem aktiven Zonen - Markierungs - Bruchpiloten (BRP) co-markiert. Sie quantifiziert neun morphologische parameters (weiter unten beschrieben): NMJ Bereich, NMJ Umfang, Anzahl boutons, NMJ Länge NMJ längste Zweiglänge, Anzahl der Inseln, die Anzahl der Zweige, die Anzahl der Verzweigungspunkte und die Anzahl der aktiven Zonen in dem synaptischen Terminal (Abbildung 1) . Obwohl ein Algorithmus die Anzahl der boutons zur Bestimmung in diesem Makro vorhanden ist, es entsprach nicht die Kriterien für die Richtigkeit 17. Um richtig die Anzahl der boutons beurteilen zu können , ist es notwendig , die „Drosophila NMJ Bouton Morphometrics“ Makro zu verwenden, die speziell entwickelt wurde , Boutons mit NMJ Präparate immunhistochemisch durch anti-Synaptotagmin (Syt) oder anti-Cystein - String - Protein (CSP) zu quantifizieren, und Co-immunomarkiert mit Brp. Die „Drosophila NMJ Bouton Morphometrie“ Makro quantifiziert die folgenden Parameter: Anzahl der boutons, NMJ bouton Bereich, NMJ Länge NMJ längste Zweiglänge, Anzahl der Inseln, die Anzahl der Zweige, die Anzahl der Verzweigungspunkte und die Anzahl der aktiven zones (Abbildung 2). Das Makros besteht aus 3 Unter Makros: (I) identifiziert alle Dateien Bild „zu stapeln Convert“ und erzeugt Z-hyperstacks und Maximumintensitätsprojektion der beiden Kanäle. Als Ausgabe wird dieser Makro zwei neue Dateien pro Synapse erzeugen „stack_image_name“ und „flatstack_image_name“ genannt. II) „Define ROI“ öffnet alle maximalen Projektionsbilder „flatstack_image_name“ nacheinander und präsentieren sie mit der Anforderung , um manuell den interessierenden Bereich (ROI zu definieren) , in dem der spezifischen synaptischen Terminal von Interesse vorhanden ist. Dies wurde Ausschluß von Synapsen Verbinden mit benachbarten Muskeln und / oder anderen Arten von synaptischen Terminals (wie 1 s) zu ermöglichen , implementiert , die in den Bildern 11 vorhanden sein können. (III) „Analyse“ trifft völlig automatisierte Analyse auf alle Regionen der Bilder innerhalb der Grenzen der ROI. Wieein Ergebnis dieses Schrittes wird der Benutzer zwei neue Dateien erhalten: „results.txt“, wo die alles numerische Messung kommentiert werden wird und ein „res_image_name.tif“, wo das darunter liegende Bild Segmentierungen durch das Makro erzeugt wird erläutert. Während der Bildanalyse werden drei Strukturen von jedem synaptischen Terminal abgeleitet: der NMJ Umrisses, der NMJ Skeletts, und die Anzahl der BRP-positiven aktiven Zonen. Die NMJ outline wird verwendet, um den NMJ Bereich und seinen Umfang und eine anschließende Wende Trennung stellt die Anzahl der boutons zu bestimmen. Aus dem Skelett, fünf NMJ Merkmale abgeleitet werden: die Gesamt NMJ Länge, wobei die Summe der Länge der längsten kontinuierlichen Pfad alle zwei Endpunkte (längste Astlänge), die Anzahl der nicht verbundenen Kammern pro NMJ Verbindungs ​​(bezeichnet als „Inseln“ die Anzahl der Verzweigungen und die Anzahl der Verzweigungspunkte), (ein Verzweigungspunkt verbindet, drei oder mehr Verzweigungen). Die Anzahl der aktiven Zonen in der BRP-Kanals bestimmt durch ZählenBRP-positive Flecken. Die kommentierte NMJ outline (gelbe Linie), die NMJ Skeletts (blaue Linie), und die Anzahl der BRP-positiven aktiven Zonen (durch weiße Foci angegeben) werden in einem Ergebnisbild angezeigt, und die Messungen der Parameter werden einem verarbeitet (. txt) Ausgabedatei (Abbildung 3). Drosophila NMJ Morphometrie“und‚Drosophila NMJ Bouton Morphometrie‘wurden zuerst von Nijhof et al beschrieben und ausführlich validiert. 17. Diese Handschrift konzentriert sich auf die Methodik NMJ Morphologie mit den Makros zu analysieren‚Drosophila NMJ Morphometrie‘und‚Drosophila NMJ Bouton Morphometrie‘. Trotzdem vor der Makro-assisted Analysen müssen NMJ Dissektionen und Immunfärbungen durchgeführt werden. Diese entscheidenden Schritte sind, und die Kombination von Markern für die Immunhistochemie verwendet wird, muss geeignet für Makroanalysen werden. Diese Schritte werden kurz erwähnt in section 1 dieses Protokolls und leiten den Benutzer auf Referenzen im Detail beschreibt die Protokolle, diese Verfahren auszuführen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Immunostainings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-discs large 1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AFFN-DLG1-4D6</td>
			<td>1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-horseradish peroxidase</td>
			<td>Jackson IR</td>
			<td>323-005-021</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Synaptotagmin</td>
			<td>Gift from Hugo Bellen</td>
			<td></td>
			<td>Jan-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Cysteine string protein</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>DCSP-1(ab49)</td>
			<td>1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Bruchpilot</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Jan-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Z25006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Confocal microscope or fluorescence microscope</td>
			<td>Leica SP5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Mac or Pc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two algorithms for high-throughput and multi-parametric quantification of drosophila neuromuscular junction morphology

Synaptische Morphologie ist eng verbunden mit der synaptischen Wirksamkeit, und in vielen Fällen morphologische Synapse Mängel letztlich zu synaptischen Fehlfunktion führen. Die Drosophila Larven neuromuskulären Synapse (NMJ), ein gut etabliertes Modell für glutamatergen Synapsen, wird seit Jahrzehnten intensiv untersucht. Identifizierung von Mutationen NMJ morphologische Defekte verursachen ergab ein Repertoire von Genen, die Synapse Entwicklung und Funktion reguliert. Viele von ihnen wurden in groß angelegten Studien identifiziert , die auf qualitativen Ansätzen konzentrierten morphologische Anomalien der Drosophila NMJ zu erkennen. Ein Nachteil von qualitativen Analysen ist, dass viele subtilen Spieler NMJ Morphologie unbemerkt bleiben wahrscheinlich bei. Während quantitative Analysen der subtileren morphologischen Unterschiede zu erkennen sind erforderlich, sind solche Analysen noch nicht allgemein durchgeführt, da sie umständlich sind. Dieses Protokoll beschreibt im Detail zwei Bildanalysealgorithmen &quot;Drosophila </em&gt; NMJ Morphometrics“und‚Drosophila NMJ Bouton Morphometrics‘, erhältlich als Fidschi-kompatible Makros für quantitative, genaue und objektive morphometrische Analyse des Drosophila NMJ. Diese Methodik NMJ Terminals entwickelt immunomarkiert mit dem üblicherweise verwendeten Marker Dlg-1 zu analysieren und . Brp Zusätzlich seine breitere Anwendung auf andere Marker wie Hrp, Csp und Syt in diesem Protokoll vorgestellt Die Makros können neun morphologische NMJ Merkmale beurteilen. NMJ Bereich, NMJ Umfang, Anzahl der boutons, NMJ Länge, NMJ längste Zweig Länge, Anzahl von Inseln, die Anzahl der Zweige, die Anzahl der Punkte und die Anzahl der aktiven Zonen in der NMJ Terminal Verzweigung.

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Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Zwei Bildanalysealgorithmen, „Drosophila NMJ Morphometrie“ und „Drosophila NMJ Bouton Morphometrie“ wurden geschaffen, um automatisch neun morphologischen Merkmale der neuromuskulären Synapse Drosophila zu quantifizieren (NMJ).

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskuläre Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

9.6K Aufrufe.  Radboud University Medical Center.  Zwei Bildanalysealgorithmen, „Drosophila NMJ Morphometrie“ und „Drosophila NMJ Bouton Morphometrie“ wurden geschaffen, um automatisch neun morphologischen Merkmale der neuromuskulären Synapse Drosophila zu quantifizieren (NMJ). 

Serie: Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Detektion<em&gt; In-situ-</em&gt; Protein-Protein-Komplexe bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM Imaging und FIMtrack: Zwei neuer Instrumente, die Hochdurchsatz und Kosteneffektiv Locomotion Analyse

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Detektion

FIM Imaging und FIMtrack: Zwei neuer Instrumente, die Hochdurchsatz und Kosteneffektiv Locomotion Analyse

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Hochdurchsatz-Analyse des Bewegungsapparates Verhaltens in der Drosophila -Insel-Assay