Wir danken Dr. Nael Alami und Dr. Nam Chul Kim für ihre hilfreichen Kommentare zu diesem Manuskript.

1. Vorbereitung für Immunfluoreszenz: <ol><li> So erstellen Sie ein Sezieren Oberfläche, pour Sylgard 184 Silikon-Elastomer Basis in einen kleinen Gewebekulturplatte. Achten Sie darauf, nicht auf die Platte komplett, so dass die Dissektion Bereich niedriger als der Rand zu füllen. </li><li> Trim Dissektion Stifte zu einer Länge von ca. 3,5 mm für eine einfachere Handhabung, und stellen Sie sicher, mindestens 6 Pins pro Larve haben. </li><li> Sie müssen stumpfen Pinzette, mit denen Sie erfassen die Stifte für die Dissektion wird. </li></ol> 2. Dissection der Larven: <ol><li> Wählen Sie wandern dritten Larvenstadium, die sich um die Seiten der Flasche kriechen und haben noch nicht begonnen sich zu verpuppen. </li><li> Legen Sie eine Larve auf dem Sezieren Oberfläche unter einem Stereomikroskop. Wick entfernt überschüssige feuchter mit einem Kimwipe. </li><li> Ordnen Sie jedem Larve, so dass die Rückenseite nach oben zeigt. Sie können auf zwei Luftröhre, weiße Linien entlang der Rückenseite der Larven zu sehen. Versuchen Sie, diese Mitte in der Mitte so viel wie möglich, weil dieses Zeichen der dorsalen Mittellinie. </li><li> Legen Sie Pin # 1 knapp oberhalb der Mündung Haken (Abbildung 1). </li><li> Legen Sie Pin # 2 in den Schwanz direkt über die Luftlöcher zwischen den Tracheen. </li><li> Fügen Sie eine kleine Menge von PBS für die Larven zu verhindern Austrocknen der Nagelhaut. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte mit allen Larven, um sicherzustellen, dass die Genotypen räumlich, indem Sie einen Stift zwischen den einzelnen Genotyp getrennt. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt quer rechts oben Pin Nr. 2 über beide Luftröhre (Abbildung 1). </li><li> Legen Sie die Schere in den ersten Schnitt und Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie zwischen den Tracheen den ganzen Weg bis vergangenen Pin # 1. </li><li> Sie müssen andere kleine Schnitte an der Spitze und unten auf jeder Seite der Nagelhaut zu machen, so dass die linken und rechten Seite öffnet sich damit Sie sie festzunageln, ohne Ziehen an der Nagelhaut. </li><li> Legen Sie Stift # &#39;s 3, 4, 5 und 6 an jeder Ecke. </li><li> Fix die Probe mit 4% PFA für 20-25 Minuten bei Raumtemperatur </li><li> Dekantieren der PFA und gründlich mit PBS 3-4 mal, Dekantieren jeder Zeit. </li></ol> 3. Entfernung von Gewebe: <ol><li> Beginnen Sie mit dem Entfernen von Gewebe am hinteren Ende, weil Sie in der Regel auf den Bereich, wo das Gehirn befindet sich schützen wollen. </li><li> Bei Verwendung einer steromicroscope und mit den Larven unter einem Tropfen PBS, zuerst greifen das hintere Ende eines der Luftröhre und ziehen Sie ihn heraus, die möglicherweise einige der fetten Körper mit ihr zu entfernen. Wiederholen Sie dies für die zweite Luftröhre. </li><li> Ergreifen Sie einige der hinteren Fett des Körpers oder der Darm und ziehen sie aus dem prep. Nachdem die meisten der hinteren Gewebe entfernt worden ist, auf die Beseitigung der kleinen Gewebe um das Gehirn zu konzentrieren. Wenn Sie nur in den Muskeln, oder Morphologie der NMJ interessiert sind, können das Gehirn als auch zu entfernen. </li><li> Die Entfernung des Gehirns ermöglicht eine bessere Visualisierung der Muscle 31, die eine hilfreiche Marker für Abdominalsegment Orientierung. </li></ol> 4. Immunfluoreszenz für Active Zones: <ol><li> Add Blocker (5% normalem Ziegenserum in PBS), die seziert preps in der Sektion Gericht. Block 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wenn Sie möchten, dass nur dann eine Lösung für die Sperrung und Antikörper-Verdünnungen gehören 0,1% TritonX-100 zu Ihrem Blockierungsmittel für Gewebe Permeabilisierung. </li><li> Wenden Sie den primären Antikörper in Blockierungslösung mit 0,1% TritonX-100 verdünnt. Die aktive Zone Antikörper ist erreichbar durch das Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Verwenden Sie eine Referenz-Antikörper (zB Meerrettichperoxidase-Cy3-Konjugat), um die NMJ Membran und Axone Etikett. </li><li> Inkubieren Sie die primären Antikörper bei 4 ° C über Nacht. So, dass die Trockenheit der Kühlschrank wird nicht verdunsten die Antikörper-Lösung, erstellen Sie eine feuchte Kammer, indem etwas Wasser in den Boden eines gebrauchten Pipettenspitze Feld. Bedecken Sie den transluzenten Deckel mit Alufolie zu fluoreszierenden reduzieren Bleichen. Legen Sie die Dissektion Folie in der feuchten Kammer und legte die ganze Kiste in den 4 ° C Inkubator über Nacht. </li><li> Am nächsten Morgen, mit PBST (PBS mit 0,2% Triton-X-100) 5-10 mal für 5-10 Minuten zu waschen. </li><li> Inkubieren mit dem sekundären Antikörper (zB Invitrogen Alexa Goat anti-Mouse-488) in Blocking-Reagenz mit 0,1% TritonX-100 bei Raumtemperatur für 2-4 Stunden in der überdachten feuchte Kammer verdünnt. Fügen Sie eine Kernfärbung (zB DAPI) in der Sekundarstufe, wenn Sie möchten, um die Position des Kerns in die Muskeln oder das Gehirn zu identifizieren. </li><li> Waschen mit PBST (PBS mit 0,02% Triton-X-100) 5-10 mal für 5-10 Minuten. </li></ol> 5. Montage der Larven Proben auf Folien: <ol><li> Dekantieren und Docht aus den letzten PBST waschen. </li><li> Pipette ca. 1 ml 80% Glycerin, die festgenagelt Larven Pelze decken. </li><li> Entfernen 5 der 6 Pins in allen Larven. </li><li> Wenn Sie bereit sind, den ersten Genotyp auf einen Objektträger gebracht entfernen Sie die letzten Bolzen für die Larven, die genotype. </li><li> Bereiten Sie eine &quot;wash&quot; slide, indem man zwei Tropfen Ihres Eindeckmedium auf einen sauberen Objektträger. Dieser Schritt ist wichtig, um das Wasser aus der Lösung und Larven waschen für die Montage und klarer Bildgebung. </li><li> Greifen Sie einen Larve durch den Schwanz mit dem stumpfen Pinzette, ziehen die Larve etwa in dem Glycerin und dann entlang der trockenen Kanten Ihrer Dissektion Gericht, um eine Mehrheit der Glycerin zu entfernen. Legen Sie die Larven im ersten Eindeckmedium fallen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6 für alle die Larven des gleichen Genotyps. </li><li> Sobald alle Larven sind in den ersten Eindeckmedium fallen, greifen die erste Larve durch den Schweif und ziehen Sie es durch die Tropfen und dann entlang der trockenen Kanten der Schale, um eine Mehrheit des Mediums zu entfernen. Dann legen sich die Larven in der zweiten Eindeckmedium fallen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 8 für alle die Larven mit den gleichen Genotyp. </li><li> Bereiten Sie Ihre letzte Folie durch Etikettierung es schaffen und eine kleine &quot;T&quot; Form Eindeckmedium auf der Folie. </li><li> Wie in Schritt 5,8, greifen die Larve durch den Schwanz; ziehen das Fell über die zweite Eindeckmedium fallen zu lassen und dann entlang der trockenen Seiten der &quot;Wash&quot; slide. Nachdem die Mehrheit des Mediums ist gekommen, versetzen die Larven Fell auf der letzten Folie in der Montage Medium. </li><li> Wiederholen Sie dies für alle Larven Pelze. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Larven Pelze angeordnet sind, wie gewünscht, sicherzustellen, dass die Nagelhaut Seite nach unten und die freigelegten Muskel nach oben zeigt. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf dem Objektträger, die seziert Larven bedecken, mit dem Beginn Rand in der oberen Zeile des &quot;T.&quot; </li><li> Setzen Sie ein kleines Gewicht (zB 9-Volt-Batterie) auf das Deckglas, um sicherzustellen, dass die Montage Medium vollständig verbreitet unter dem Deckglas. </li><li> Zur Reduzierung möglich Fluoreszenzlöschung, legen Sie die Folie in einer Schublade oder dunklen Raum, bis das Eindeckmedium ausgehärtet ist. </li><li> Clean up the Eindeckmedium, dass die Kanten des Deckglases übergelaufen. Reinigen Sie das überschüssige trockene Montage Medium auf das Deckglas oder Objektträger mit 70% Ethanol. </li><li> Um eine endgültige Abdichtung zu schaffen, das Siegel mit Nagellack. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel Folie präpariert und immungefärbt Larven ist in Abbildung 2 dargestellt. Wenn die Larven Dissektionen, Flecken und Montage ordnungsgemäß durchgeführt, kann der Benutzer die Larven Muskel von Interesse (Abbildung 3) in Segmente A2-A6 zu identifizieren. Hoang et al. Enthält eine detaillierte Beschreibung des Muskel-Position sowie Charakterisierung von spezifischen synaptischen boutons (Hoang und Chiba, 2001). Mit Hilfe eines Hochleistungs-Objektiv kann der Anwender auf einer einzigen Synapse zu fokussieren und Z-Stapel-Bild. Ein Vertreter maximale Projektionsbild eines Teils der Synapse 6 / 7 angezeigt wird (Abbildung 4). Dann mit Imaging-Software, können die aktiven Zonen quantitativ, das bei Ihrem Mutantenphänotyps ausgewertet werden. Beispiele für Features, die in einem bestimmten Mutantenphänotyps verändert werden können, beinhalten die Gesamtzahl, Fluoreszenz-Intensität, und der Abstand zwischen den aktiven Zonen. Mögliche Fallstricke: Immunfluoreszenz Auswertung der larvalen neuromuskulären Synapse ist ein wertvolles System, das einen wertvollen Einblick in synaptischen Biologie Verfügung stellen kann, obwohl es potenzielle Fallstricke, dass der Nutzen dieses Systems verhindern könnten. Zum Beispiel, häufig ist es wünschenswert, Bild der Färbungsmuster von zwei oder mehr primäre Antikörper in der gleichen Probe. Die Wahl der geeigneten primären Antikörpern, geeignete Fluorophore und entsprechende Negativ-Kontrollen ist entscheidend für den Erfolg. Wenn Imaging zwei Antigene in Ihrem Experiment, sicher sein, dass die primären Antikörper von verschiedenen Spezies, so dass jedes Protein von Interesse eindeutig mit einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper identifiziert werden. Eine empfohlene Methode, um Hintergrund zu reduzieren, ist ein Blockierungsmittel zu verwenden, die das normale Serum der Spezies, aus der der sekundäre Antikörper abgeleitet (z. B. Einsatz normalem Ziegenserum als Blockierungsmittel bei der Verwendung von Ziege-Anti-Kaninchen-oder anti-Maus Sekundärantikörper) wurden. Nach der Planung der primären und sekundären Antikörper, die Sie in Ihrem Experiment verwenden, müssen Sie auch einschließlich der Kontrollen in Ihrem Färbung betrachten setzt, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Signal, das Sie sehen real und nicht nur Hintergrund ist. Wenn möglich, sind negative Kontrollproben, die keine das Protein von Interesse. Dies ist leicht in Studien von exogenen Transgen-Überexpression durch die Aufnahme eines Wildtyp-Tieren gemacht, aber in manchen Fällen kann durch die Verwendung einer homozygoten Mutante von Ihrem Protein von Interesse durchgeführt werden. Ein weiterer wesentlicher negative Kontrolle, nützlich für die Messung der Hintergrundwerte von Ihrem Fluoreszenzsignal ist an den sekundären Antikörper ohne den primären Einsatz. Bei der Darstellung Ihres resultierenden preps, ist es wichtig zu verstehen, dass alle das Fluoreszenzsignal, dass Sie sehen vielleicht nicht real, und vielleicht Hintergrund von yo werdenur Sekundärantikörper oder aus körpereigenem Gewebe Hintergrund. Möglicherweise müssen Sie Ihre Bilder zu normalisieren, um Hintergrundfluoreszenz berücksichtigen, wenn Testen auf Änderungen zwischen Fluoreszenzintensität. Wahl der Fluorophor muss auch mit Vorsicht erfolgen. Die Berücksichtigung der Anregungs-und Emissionsspektren für jeden Fluorophor und die Fähigkeit zur eindeutigen Erkennung jedes Signal ist wichtig, Kanal Durchscheinen zu vermeiden. Wenn es eine Unsicherheit, eine einfache Möglichkeit, um festzustellen, ob das Ausmaß der Blutung bis hin zu mit einem Fluorophor-markierten Antikörper in einer Zeit immunostain und überprüfen Sie das Bild mit jedem Kanal, dass Sie in Ihrem letzten Experiment verwenden ist. Dies sollte zeigen, ob Durchscheinen mit Ihrem Mikroskop Filter gesetzt auftritt. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Flussdiagramm Nagelhaut schneiden und Platzierung der Pins 1-6. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/2676/2676fig1_large.jpg">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen</a> <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Platzierung der Larven auf den letzten Folie. Stellen Sie sicher, dass die Larven preps Muskel Seite ausgesetzt sind und Nagelhaut Seite nach unten. Lassen Sie mindestens ein Larvenkörpers Breite in-zwischen jeder Probe. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Bei der Darstellung, suchen Sie die Muskeln und Segmente von Interesse. Gemeinsame neuromuskulären Synapsen charakterisiert innervieren Muskeln 6 / 7, Muskel-13, Muskel-12, oder Muskel-4. Auf der gegenüberliegenden Seite der ventralen Mittellinie, es ist ein Spiegelbild Muskulatur der dargestellten Hemi-Segment. Verwenden Muscle 31 als einen Marker zu identifizieren, welches Segment Sie Bildgebung. Bild der gleichen Synapsen und Segmente für den Rest Ihrer Proben, sammelt viele synaptische Bilder pro Genotyp, dass für die Quantifizierung verwendet werden können. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Ein Vertreter maximale Projektionsbild eines Teils der NMJ innervieren Muskeln 6 / 7 gezeigt. NC82 (Bruchpilot) Färbung ist in grün dargestellt. HRP präsynaptischen Fleck ist rot dargestellt. Notieren Sie sich die aktive Zone Tränenpünktchen, dass weitere von Imaging-Software quantifiziert werden kann.

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	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

Für Neuronen wird die synaptische Anschlussbereich von entscheidender Bedeutung, und ist die Brücke für eine ordnungsgemäße Kommunikation zwischen dem post-und pre-synaptischen Zellen. Ein guter Weg, um die Gesundheit des Neurons in Krankheitsmodelle zu untersuchen ist, Proteine ​​der synaptischen Terminals durch Immunfluoreszenz analysiert. Die Immunfluoreszenz hier vorgestellte Methode ermöglicht es dem Forscher, viele Larven gleichzeitig zu untersuchen, während die Begrenzung der ökologischen Unterschiede...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silikon-Elastomer Basis </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Nach dem Mischen ermöglichen Blasen steigen langsam aus, indem Sie auf langsamen Rotor oder die Möglichkeit für 30 Minuten oder mehr sitzen. </td></tr><tr><td> Stainless Steel Minutien Pins </td><td> Feine Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td> Trim auf ca.. 3-4mm lang mit regelmäßigen Schere </td></tr><tr><td> Laminektomie Pinzetten (zum Greifen Pins Blunt-Used) </td><td> Feine Werkzeuge Wissenschaft </td><td> 11223-20 </td><td> Verwenden Sie als einer stumpfen Zange zum Greifen Pins </td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFine Vannas Schere, 8cm lang </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Maus anti-Brp Antikörper </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Verwenden 1:50-Verdünnung </td></tr><tr><td> Cy3 AffiniPure Goat Anti-Meerrettichperoxidase </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 123-165-021 </td><td> Verwenden Sie bei 1:200-Verdünnung </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Verwenden Sie ca.. 1:200-Verdünnung </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

Die Drosophila-Larven neuromuskulären Synapse (NMJ) ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der synaptischen Struktur und Funktion. Drosophila ist bekannt für die Leichtigkeit des starken genetischen Manipulationen und die Larven des Nervensystems hat sich besonders bewährt bei der Untersuchung nicht nur die normale Funktion, sondern auch Störungen bekannt daß begleiten einige neurologische Erkrankung (Lloyd und Taylor, 2010). Viele wichtige synaptische Moleküle in Drosophila gefunden werden auch in Säugetieren gefunden und wie die meisten ZNS-Synapsen in Säugetieren ist das Drosophila NMJ glutamatergen und zeigt Aktivität abhängig Umbau (Koh et al., 2000). Darüber hinaus können Drosophila Neuronen werden individuell identifiziert, weil ihre Innervation Muster stereotype und repetitive machen es möglich, identifiziert synaptischen Terminals, wie sie zwischen Motoneuronen und der Körper-Wand Muskelfasern, die sie innervieren (Keshishian und Kim, 2004). Studie Die Existenz der evolutionär konserviert Synapse Komponenten zusammen mit der Leichtigkeit von genetischen und physikalische Manipulation machen die Drosophila-Modell ideal für die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen synaptischer Funktion (Budnik, 1996). Die aktiven Zonen am synaptischen Terminals sind von besonderem Interesse, da diese die Standorte der Freisetzung von Neurotransmittern sind. NC82 ist ein monoklonaler Antikörper, der Drosophila-Protein Bruchpilot (BRP), ein CAST1/ERC Familienmitglied, das ein wichtiger Bestandteil der aktiven Zone (Wagh et al., 2006) wird anerkannt. Brp wurde gezeigt, direkten Einfluss auf die aktive Zone T-bar und ist verantwortlich für die effektive Bündelung Ca 2 +-Kanäle unter dem T-Bar-Dichte (Fouquet et al., 2009). Mutanten von BRP haben Ca 2 + reduziert Kanaldichte, deprimiert evozierte Vesikelfreisetzung und veränderte kurzfristige Plastizität (Kittel et al., 2006). Änderungen an aktiven Zonen in Drosophila Krankheitsmodelle beobachtet worden. Zum Beispiel zeigten Immunfluoreszenz mit dem NC82-Antikörper, der die aktive Zone Dichte in Modellen von amyotrophe Lateralsklerose und Pitt-Hopkins-Syndrom (Ratnaparkhi et al, 2008.; Zweier et al, 2009.) Verringert wurde. So kann die Evaluierung von aktiven Zonen oder anderen synaptischen Proteinen, in Drosophila-Larven Modelle von Krankheiten stellen eine wertvolle erste Hinweise auf die Anwesenheit eines synaptischen Defekt. Vorbereiten ganzen Berg seziert Drosophila-Larven für Immunfluoreszenz Analyse der NMJ erfordert etwas Geschick, kann aber von den meisten Wissenschaftlern mit ein wenig Übung erreicht werden. Präsentiert wird eine Methode, die für mehrere Larven präpariert und immungefärbt in der gleichen Präparation Gericht stellt, Begrenzung der Umwelt-Unterschiede zwischen den einzelnen Genotyp und bietet genügend Tiere für das Vertrauen in die Reproduzierbarkeit und statistische Analyse.

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Ist ein wichtiges Modellsystem für die Untersuchung normale synaptische Funktion sowie Störungen der synaptischen Funktion in bestimmten neurologischen Erkrankungen gefunden. Wir präsentieren ein Protokoll für die Präparation des<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven motorischen System und Immunfärbung für aktive Zone Proteine ​​innerhalb der NMJ.

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

15.3K Aufrufe.  St. Jude Children’s Research Hospital. Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) von Drosophila melanogaster Ist ein wichtiges Modellsystem für die Untersuchung normale synaptische Funktion sowie Störungen der synaptischen Funktion in bestimmten neurologischen Erkrankungen gefunden. Wir präsentieren ein Protokoll für die Präparation des Drosophila Larven motorischen System und Immunfärbung für aktive Zone Proteine ​​innerhalb der NMJ.

Serie: Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Forschung

Neurowissenschaften

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Detektion<em&gt; In-situ-</em&gt; Protein-Protein-Komplexe bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskuläre Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...