Die diffuse Verteilung und die eingeschränkte Sichtweite des TEM stellen Herausforderungen für die Infrastrukturanalyse dar. Dieses Protokoll stellt eine innovative und effiziente Probenvorbereitungsmethode dar, die den herkömmlichen Ansatz übertrifft. Diese fortschrittliche Methode der TEM-Probenvorbereitung ist im Vergleich zur herkömmlichen Methode wirksamer, um das Kräuseln der Proben zu verhindern, indem sie die Proben während der anschließenden Dehydratisierung flach bleiben lässt.
Die Auswahl der Reagenzien und die Anpassung der Dosierung müssen je nach Probentyp erforderlich sein. Es gibt viele giftige chemische Reagenzien, die bei der Probenvorbereitung verwendet werden. Sheng Qingyuan, ein Meisterschüler aus dem Labor von Dr. Gan Guangming, wird das Verfahren vorführen.
Zu Beginn sezieren Sie die wandernden Drosophila-Larven im späten dritten Stadium in Januar-Lösung und erhalten Sie die gesamte Körperwand gemäß den Standardverfahren. Fixieren Sie die Körperwand der Larve mit dem Fixiermittel in der Präparierkammer über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag wird die Larvenkörperwand aus der Sezierkammer in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und mehrmals mit Natriumcacodylatpuffer gespült.
Fixieren Sie die Körperwand der Larve zwei Stunden lang in 1%Osmiumtetroxid. Waschen Sie die Proben nach der Fixierung mehrmals mit destilliertem Wasser. Geben Sie 2% gesättigte Urinalacetatlösung in das Röhrchen, um die neuromuskuläre PHI-Verbindung zu färben.
Spülen Sie die Proben nach zwei Stunden mit entionisiertem Wasser ab. Schneiden Sie anschließend mit einer Schere zwei runde Stücke Metallgitter mit einer Porengröße von 270 Mikrometern ab. Lege das Metallgitter an den Boden einer Flasche mit flachem Boden.
Legen Sie dann die fixierten Larven auf das Netz und platzieren Sie anschließend ein weiteres Netz. Dehydrieren Sie die Proben in einer ansteigenden Ethanolkonzentration für jeweils 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend spülen Sie die Proben zweimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Propylenoxid aus.
Legen Sie anschließend die Proben in eine Propylenoxid- und Epoxidharzlösung, gefolgt von reinem Epoxidharz für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Schneiden Sie zum Einbetten eine Polyethylenfolie in ein großes Quadrat und eine kleine, hohle rechteckige Stütze. Klebe das kleine Quadrat mit dem großen Quadrat zusammen.
Geben Sie ausreichend Epoxidharz in die Mitte des großen Quadrats. Schalten Sie dann das Stereoskop ein und legen Sie die Proben mit der Muskelseite nach oben in das vorpositionierte Epoxidharz. Geben Sie einige Tropfen Epoxidharz auf die Proben und bedecken Sie sie mit Polyethylenfolie.
Legen Sie die Proben für die Polymerisation jeweils 24 Stunden lang bei steigenden Temperaturen. Entfernen Sie nach der Polymerisation mit einer scharfen Klinge die überschüssigen Teile des Larvenkörpers, während Sie ein Trapez behalten, einschließlich des A2- und A3-Segments. Entfernen Sie das Trapez von der verbleibenden Körperwand der Larve und befestigen Sie es mit AB-Kleber an der mit Harz gefüllten Kapsel.
Bestätigen Sie unter einem Lichtmikroskop die Position des sechsten und siebten Muskels des A2- und A3-Segments, wobei Sie die Tangentialebene parallel zum sechsten Muskel beibehalten. Schneiden Sie dann ein Fünftel der Probe entlang der beiden Seiten des A3-Segments ab. Bereiten Sie mit einem Mikrotom einen ultradünnen Schnitt der Probe vor, beginnend mit dem sechsten Muskel.
Befestigen Sie nach dem Schneiden so viele Scheiben wie möglich an jedem Kupfernetz. Verwenden Sie ein Transmissionselektronenmikroskop, um die Proben zu beobachten. Neben dem Lowicryl K4M-Harz und dem Epoxidharz lieferte das Lowicryl K4M-Harz schärfere und leichter beobachtbare Ergebnisse der Drosophila-Körpermuskulatur.
Die konfokale Bildgebung zeigte eine verbesserte Visualisierung der neuromuskulären Verbindung zwischen dem sechsten und siebten Muskel. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte kügelchenartige neuromuskuläre Verbindungen, die eine verbesserte synaptische Strukturinformation bieten. Die Proben blieben während des gesamten Dehydratisierungsprozesses aufgrund der Einschränkung der Metallgewebe flach.
Außerdem wurden die Proben zwischen den Kunststoffprodukten polymerisiert, wodurch ein Falten der Proben verhindert wurde. In Zukunft kann die Methode der TEM-Probenvorbereitung auf Neuropil des Gehirns und des ventralen Nervenstrangs angewendet werden, wodurch das Potenzial der Ultrastrukturforschung verbessert wird.
