Wir danken Jeff Tucker, Erica Scappini und Agnes Janoshazi für ihre Hilfe bei der Mikroskopie Ligon Perrow für ihre Verwaltung der Maus Kolonie, und Jun Chen und Michael Sanderson um Hilfe mit dem Gewebe Hobel, und Michael Fessler und Derek Cain für kritische Lektüre das Manuskript. Diese Arbeit wurde durch den intra-Zweig des NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09) finanziert, die von der Abteilung für Gesundheit und Human Services gesponsert wiederum.

Tierversuchsverfahren in diesem Dokument beschrieben sind, wurden durch die NIEHS Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. 1. Lung Vorbereitung <ol><li> Hausmäuse zwischen 6 und 12 Wochen alt ist in spezifischen pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüssen vorgesehen Richtlinien. HINWEIS: Abgebildete Mäuse können entweder naiv oder behandelt sein, abhängig von jedem spezifischen Interessen des Forschers. Hier beschreiben wir Immunzelllokalisierung in naiven Mäusen und in Mäusen, die mit 100 &amp; mgr; g Ovalbumin (OVA) und 0,1 ug Lipopolysaccharid (LPS), unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Vehikel in einem Gesamtvolumen von 50 &amp; mgr; l. Um oropharyngeally OVA / LPS in die Atemwege zu vermitteln, wurden die Tiere mit Isofluran anästhesiert und inhalative vertikal durch ihre Zähne mit einem Gummiband aufgehängt ist. Die Zunge wurde vorsichtig mit einer Pinzette ergriffen und zu einer Seite gehalten zu verhindern, Schlucken und 50 &amp; #181; L der OVA / LPS - Lösung auf der Rückseite der Mundhöhle abgeschieden , wie zuvor beschrieben 17. </li><li> Euthanize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Natriumpentobarbital (100 mg / kg) und der Stift, das Tier zu einem Polystyrol-Basis. </li><li> Öffnen der Bauchhöhle mit einer Schere durch Schneiden der Haut und Bauchfells von der Mitte des Bauches auf den Unterkiefer nach oben. Ziehen Sie den Darm beiseite mit Zange oder der stumpfen Kante der Schere, und schneidet die untere Hohlvene Blut abzulassen weg von Lungen. Durchstechen der Membran mit der scharfen Spitze der Schere Expansion des Brustkorbs zu erlauben, darauf achten, daß die Lungen zu schneiden. </li><li> Klare Speicheldrüsen und andere Gewebe aus der Luftröhre entfernt, indem das Gewebe greifen und manuell entfernt von der darunter liegenden Luftröhre mit einem Pinzette herausziehen. Führe einen kleinen Einschnitt in der Luftröhre an der vorderen Seite des dicksten Bandes des Knorpels mit feinen Pinzetten oder Scheren, aufpassen, nicht dem ganzen Weg, obwohl die tra zu schneidenChea. Der Schnitt wird nur groß genug, um eine 20-G-Nadel zu ermöglichen, hindurchzutreten. </li><li> Schieben eine 1,5 Zoll, 20 G Nadel auf einen Abschnitt von Polyethylenschlauch, so dass etwa 1 cm des Schlauchs über das Ende der Nadel. Schneiden Sie das Rohr in einem Winkel von etwa 45 ° das Ende abzuschrägen, Befestigen der Nadel an einer 1 ml Spritze und laden die Spritze durch Ziehen 0,8 ml warmem (40 ° C) 2% niedrig schmelzender Agarose nach oben durch die Nadel. </li><li> Das Ende der Rohrleitung in den Einschnitt der Trachea und spritzen langsam die Agarose in die Lunge. Ohne Bewegen der Nadel oder Spritze, kleben die Spritze an die Polystyrolbasis die Nadel bleibt in der Trachea sicherzustellen. HINWEIS: Nach der Injektion wird die Lunge in der Brust größer und aufgeblasen werden. Die rechten Lappen erweitern zuerst, dann die linken Lappen. Wenn nur ein Lappen erweitert, hat die Nadel zu tief eingeführt worden ist (vorbei an der Bronchien), und es wird notwendig sein, um es leicht zu ziehen, bevor Sie fortfahren. Dieser Teil derVerfahren muss relativ schnell durchgeführt werden, bevor die Agarose zu erstarren beginnt. </li><li> Platzieren Sie die Maus, mit der Basis und der Spritze noch in der Luftröhre eingeführt, in einem Kühlraum oder Kühlschrank für mindestens 10 min. Falls erforderlich, kann das Tier dort gehalten werden, bis zu mehreren Stunden, auch wenn Sie fortfahren zu Bildzellmigration durch Videomikroskopie. </li><li> Sobald die Maus kalt ist, sorgfältig die Agarose aufgeblasenen Lungen mit einer Schere auszuschneiden und sie in einen 3-cm-Schale mit eiskaltem PBS. Halten Sie sich auf dem Eis. </li><li> Wählen Sie die gewünschte Keulen für Gewebe Slicing (zB dem rechten oberen Lobus). Stellen Sie sicher, dass der innere Teil der Lunge (wo es zu Trachea verbindet) ist gegenüber in der Schale nach unten. HINWEIS: Der Lappen verwendet und seine Ausrichtung auf den Kolben wird die Größe der Schiffe und der Atemwege bestimmen, die sichtbar sein wird. Die Orientierung beschrieben hier ist ideal für die Visualisierung großer Atemwege und Parenchym. Mäuse haben eine große linke Lappen und vier kleinere Lappen auf der rechten Seite. ZumPCLS Bildgebung nach der Einführung von Allergenen in die Lungen über oropharyngealen oder intranasal Bestrebung, die rechten oberen Lappens wird teil typischerweise geschnitten, weil es eine bequeme Größe ist, sondern auch, weil inhalierten Mittel verteilen sich gleichmäßig in ihr. Jedoch können auch andere Lappen, vor allem der linke Lappen, kann auch untersucht werden. Wenn Mausstämme oder Behandlungen zu vergleichen, ist es wichtig, die gleichen Lappen zu vergleichen. </li></ol> 2. Lung Slicing HINWEIS: Stellen Sie Scheiben eine automatisierte Schneidemaschine mit Metallkühlblock, Kolben und Metallspritze, nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Bringe einen kleinen Tropfen Allzweck-, kein Gel-run superglue auf den Kolben und verteilt den Klebstoff in einer kreisförmigen Bewegung, dabei nicht der Klebstoff an den Seiten des Metall Spritze berühren zu lassen. Wenn der Klebstoff an den Seiten der Spritze berührt, wird sie die Spritze und Kleber zusammenzuDruckFläche. </li><li> Unmittelbar nach den Kolben mit Leim bedeckt, greifen die sanftexzidiert Lappens mit einer Pinzette mit der Trachea-Seite nach unten auf einem Gewebe dab überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und vorsichtig auf der Oberseite des Kolbens zu legen. Schneiden Sie keine zusätzlichen Gewebe über den Rand des Plungers erstreckt. </li><li> Bewegen Sie den Kolben nach unten, so dass die Seiten der Metall Spritze nach oben und über das Gewebe, die Schaffung einer gut mit der Lunge am Boden geklebt, nicht mehr als einige Zentimeter tief. Band um die Unterseite der Metall Spritze diese Position in Position zu halten. </li><li> gießt vorsichtig 2% niedrig schmelzende Agarose bei 40 ° C in das Bohrloch, so dass es nur die Oberseite des Lappens erstreckt. </li><li> Umgeben die Metall Spritze mit dem eiskalten Kühlblock und Kühlen des Lappens und Agarose für 1 bis 2 min. HINWEIS: Eine kürzere Zeit Kühlung des Agarose das umgebende Gewebe während des Schneidens zu einem Zerfall der Agarose führen könnte, was zu einer ungleichmäßig geschnitten PCLS führen könnte. </li><li> Legen Sie die Probenspritze in die automatische Schneidemaschine und füllen den Puffertank mit eiskaltem PBS. Richten Sie die<html> Schrittmotorantrieb mit der Spritze Probe und Entfernen von der Unterseite des Bandstückes. Schalten Sie den Schalter auf die Schnellvorlauf (FF) Position, bis der Schrittmotorantrieb nur die Rückseite des Kolbens berührt. </li><li> Richten des frischen Klinge mit der Probenspritze. Set Gewebedicke, kontinuierlich / scheibe, Schwingung und die Geschwindigkeit in der Slicer. Zum Beispiel Gewebedicke: 150 &amp; mgr; m, kontinuierliches Schneiden (Forts.), Oszillation: 9 und Geschwindigkeit: 3 - 4. Start drücken. Die obigen Einstellungen müssen auf die spezifischen automatisierten Slicer Spezifikationen angepasst werden. </li><li> Mit einem dünnen Spatel oder Pinsel, sammelt das PCLS einen nach dem anderen, wie sie in den Puffertank fallen und sie in einer 24-Well-Platte eiskalten PBS enthält. HINWEIS: Es ist wichtig, die Scheiben zu halten, um die Konsistenz zwischen den Experimenten zu halten. Obwohl jeder Lunge unterschiedlich ist , je nach Alter, Geschlecht und Gewicht, die 10. Scheibe, so ergibt zB Atemwege im Allgemeinen ähnlich dimensionierten. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 3. Antikörper-Färbung <ol><li> Entwerfen eine Gruppe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern auf dem Basis des Zelltyp von Interesse unter Berücksichtigung der potentielle fluoreszierende spektrale Überlappung und die Erfassungsfähigkeiten des Mikroskops. HINWEIS: Als Beispiel wird ein Panel für DC-Untergruppe Erkennung ist wie folgt: CD11c / alpha X Integrin - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitation: 405 nm, Spitzenemission: 605 nm), CD324 / E-Cadherin - Alexa 488 (AF488 ) (Anregung: 488 nm, Spitzenemission: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - Phycoerythrin (PE) (Anregung: 561 nm, Spitzenemission: 578 nm), CD103 / alpha E Integrin - Allophycocyanin (APC) (Anregung: 633 nm , Spitzenemission: 660 nm). Fluoreszenz spektrale Betrachter Tools (siehe Materialliste) sind nützliche Platten zu entwerfen. </li><li> Stellen einen Antikörper-Cocktail die gewünschten Antikörper enthält. <ol><li> Für statische PCLS Bildgebung, fügen 800 &amp; mgr; l Färbepuffer, 100 &amp; mgr; l Fc-Blocker wurden 50 ul normales Mausserum und 50 &amp; mgr; l normalem Rattenserum in ein 1,5 ml microcentrifugation Rohr für ein Gesamtvolumen von 1 ml. Für die Abbildung lebender Zellen, verwenden 800 &amp; mgr; l Leibovitz-Medium (1x), das 10% FBS (Leibovitz-10) anstelle von Färbepuffer. </li><li> eine gewünschte Endkonzentration jeden Antikörper hinzufügen Antikörper einzustellen. Übertragen Sie die Antikörperlösung auf eine 3-cm-Schale und halten im Dunkeln bis zur Verwendung. HINWEIS: Die Endkonzentrationen werden müssen, für jeden einzelnen Antikörper optimiert (in der Regel 1 bis 5 &amp; mgr; g / ml). </li></ol></li><li> Wählen Sie eine PCLS mit einem anatomischen Bereich von Interesse, wie beispielsweise große Atemweg oder der Peripherie der Lunge, und in der 3-cm-Schale, die 1 ml Antikörperlösung. </li><li> Stain PCLS im Dunkeln auf Eis, Schaukel langsam für 30 oder 60 min. </li><li> Für statische PCLS Bildgebung, geht in Abschnitt 5 mit dem Abschnitt 4 für die Abbildung lebender Zellen, Proceed. </li></ol> 4. Statische Imaging von PCLS <ol><li> Nach 60 min Inkubation von PCLS mit Antikörpern, die Antikörperlösung aus der Schale entfernen und spülen ter schneidet zweimal mit 1 ml eiskaltem PBS. </li><li> Pipettieren von 50 &amp; mgr; l PBS auf ein 3 cm runden Glasbodenschale. Mit einem Spatel oder Pinsel, übertragen die gefärbten PCLS auf den Abfall, Manipulieren sanft die Scheibe, bis sie flach ist und sich auszubreiten. Entfernen Sie die PBS mit einer Pipette. Die Scheibe sollte so flach wie möglich liegt. Die oben genannten Verfahren müssen schnell Photobleichens zu vermeiden, durchgeführt werden. </li><li> 1 Tropfen von Raumtemperatur Montagemedium auf die Scheibe sanft und ein Deckglas in die Vertiefung der Platte fallen. Halten PCLS im Dunkeln bei 4 ° C für bis zu einer Stunde vor der Bilderzeugung. </li><li> Wenn unter einem konfokalen Mikroskop betrachten, verwenden Sie ein 20x - Objektiv (siehe Materialliste). Mit der „Kachel“ Werkzeug zu lokalisieren und die Ränder des Gewebes in der „konvexen Hülle“ Einstellmarke. Dies wird dazu beitragen, die Zeit der Fliese Scan zu reduzieren. </li><li> Während des Z-Stapel Bereich einstellen, an mehreren Bereichen der Scheibe überprüfen, insbesondere entlang der Kanten, dass die eingestellten Bereichegeeignet sind. HINWEIS: Der z-Bereich wahrscheinlich brauchen wird größer zu sein als selbst die Dicke des Gewebes, weil es sehr schwierig ist, das Gewebe zu erhalten völlig flach zu legen. Beispielsweise mit einem 150 um dicken PCLS, der z-Stapelbereich muß wahrscheinlich auf 200 eingestellt werden - 250 um Beulen und Kurven in der Scheibe aufzunehmen. In Abhängigkeit von dem z-Stack-Bereich und der Größe des Gewebes, jede volle Lungenscan dauert zwischen 7 bis 12 h mit einem 20x-Objektiv. Jede Lunge ist einzigartig und die Einstellungen für jedes Experiment eingestellt werden. </li></ol> 5. Live Cell Imaging von PCLS <ol><li> Nach 30 min Inkubation von PCLS mit Antikörpern, die Antikörperlösung aus der Schale entfernen und die Scheiben zweimal mit 1 ml kalten Leibovitz-10 spülen. </li><li> Pipette 50 ul frische Leibovitz-10 in einen Schlitz eines Kammerdeckgläser (8 Slots). Verwenden eines Spatels PCLS die auf das Medium zu übertragen, Manipulieren es leicht, bis die Scheibe flach ist und sich auszubreiten. Die obigen Verfahrenmüssen schnell Photobleichens zu vermeiden, durchgeführt werden. </li><li> Entfernen Sie die 50 &amp; mgr; l Medium mit einer Pipette. Die Scheibe ist so flach wie möglich zu liegen. HINWEIS: Es ist akzeptabel, wenn die Ränder der Scheibe sind vertikal an der Wand der Kammer nach oben geklappt. Des Weiteren kann, wenn vorhanden, ein Metall der Platingewicht verwendet werden, um die Scheibe zu verankern, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Siehe die beigefügte Materialliste für ein Beispiel aus Platindraht, der in kleine Gewichte geschnitten und gebogen werden kann. </li><li> In einem 4 ° C kalten Raum, Mischung 100 &amp; mgr; l Wachstumsfaktor reduziert, Phenolrot-freier extrazellulärem Matrix mit 100 &amp; mgr; l Leibovitz-10. Verwenden vorgekühlten Pipettenspitzen für diese, oder die extrazelluläre Matrix wird in der Spitze verfestigen. Hinweis: Dieses Verhältnis von Matrix und Medium (1: 1) erzeugt ein Gel dicht genug, um die PCLS unten halten in Gewebekulturbedingungen. </li><li> Pipette vorsichtig die Matrix zu mischen, und Pipette vorsichtig auf der Oberseite der PCLS, um sicherzustellen, dass das Gel auf das lu gehtng Scheibe, und dass die Scheibe aufschwimmen nicht auf der Oberseite des Gels. Das Gel sollte als Gewicht arbeiten, die PCLS nach unten auf den Boden der Platte zu verankern. </li><li> übertragen sorgfältig die Kammerdeckgläser auf einen 37 ° C Inkubator und lassen die Matrix für ~ 5 min verfestigen. </li><li> Überträgt die gesamten Kammerdeckgläser auf die vorgewärmte Phase eines konfokalen Mikroskops. Pflegen die Kammer bei 37 ° C im gesamten Bildgebung. CO 2 -Zufuhr wird während der Zellinkubation erforderlich , wenn Leibovitz-Medium verwendet wird . </li><li> Stellen Sie den Z-Stapel Bereich und Fliesenbereich basierend auf dem gewünschten Abstand zwischen der Frames. Wenn unter einem konfokalen Mikroskop betrachten, verwenden Sie ein 20x-Objektiv (siehe Materialliste). Mit dem „Kachel“ Werkzeug den Bereich von Interesse in dem Gewebe zu bezeichnen, das „zentrierte Gitter“ -Einstellung verwendet ( zum Beispiel ein 2x2 Gitter zentriert). </li><li> Während des Z-Stapel Bereich einstellen, an mehreren Bereichen der Scheibe überprüfen, ob die festgelegten Bereiche geeignet sind. HINWEIS: Die zrange wird die Dicke des Gewebes wahrscheinlich entsprechen. Jede Lunge ist einzigartig und die Einstellungen für jedes Experiment eingestellt werden. 2x2 Fliesen und 10 Z-Stapel werden in ~ 1 Bild / 2 min im Allgemeinen zur Folge hat. Sicherstellen, dass die Autofokusfunktion aktiviert ist vor Beginn des Versuchs xy und z-Drift während des Bilderzeugungsperiode zu minimieren. </li></ol>

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Das hier beschriebene Protokoll wurde ursprünglich die Positionen von zwei Untergruppen von cDCs in der Lunge sichtbar zu machen entwickelt. Jedoch kann dieses Protokoll ohne weiteres viele verschiedene Zelltypen zu untersuchen, während die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen und die dreidimensionale Architektur der Lunge angepasst werden. Das letztere Merkmal ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber Kultursysteme Zelle und erleichtert die Identifizierung von seltenen Zelltypen. Das Verfahren beruht auf d...

Nach Einatmen von proinflammatorischen Stimuli wie Lipopolysaccharide (LPS), gibt es eine koordinierte Bewegung von Immunzellen in die, innerhalb und aus der Lunge. Zum Beispiel werden Neutrophile Lungenparenchym und Atemwegs schnell rekrutiert. Darüber hinaus sind einige professionelle antigenpräsentierende als herkömmliche dendritische Zellen (cDCs) bekannten Zellen durchlaufen eine relativ komplizierte Migrationsmuster 1, 2. cDCs kann CD11c auf ihrer Anzeige des Oberflächenmarker, unter Verwendung von identifizierte Durchflusszytometrie, basierend teilweise. Distinct Subsets von DCs können durch die Differentialoberflächenexpression von CD11b CD103 und 3 unterschieden werden. Bei inhalativen Antigen Erwerb verlassen einige cDCs die Lunge und wandern durch die Lymphgefäße zu Lungen-Lymphknoten (LNS) , wo sie Peptide präsentieren 4 T - Zellen-spezifisches Antigen. Dies ist ein kritisches frühes Ereignis in der Einleitung der adaptiven Immun rAHMEN. Aus unbekannten Gründen jedoch nicht alle cDCs , die inhaliert Antigene erwerben lassen , die Lunge, und viele dieser Zellen bleiben in diesem Organ für mehrere Monate 5, 6. Diese Beobachtung kann teilweise durch die Entwicklungs Vorfahren dieser Zellen , da Monozyten abgeleiteten Zellen CD11c + erklärt werden , um den Chemokin - Rezeptor fehlen, CCR7, sind nicht in der Lage zu regionalen LNs 7, 8 zu wandern. Es scheint wahrscheinlich, dass das Migrationspotenzial von cDCs auch bestimmt ist, zumindest teilweise durch ihre anatomische Position innerhalb der Lunge. Jedoch ist die genaue Lokalisierung dieser verschiedenen Populationen von cDCs in der Lunge nicht vollständig charakterisiert. Eine verbesserte Kenntnis von Immunzellen Lokalisation innerhalb der Lunge und des Moleküls, die sie leiten, ist für ein besseres Verständnis davon, wie das Immunsystem der Lunge benötigt wird aktiviert. PCLS werden steigendely verwendete als ex - vivo - Ansatz zellulare Positionierung und Zell-Zell - Wechselwirkungen sichtbar zu machen , während die strukturelle Integrität der Lungenarchitektur 9, 10 aufrechterhalten wird . PCLS wurden verwendet Lungen vielen Arten zu untersuchen, darunter Mäuse, Rinder, Affen, Schafe, Pferde und Menschen 11. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik besteht darin, dass etwa 20 Scheiben aus einer einzigen Keule einer Mauslunge hergestellt werden können, wodurch die Anzahl von Tieren für die einzelnen Versuche benötigt reduzieren. Praktisch alle Immunzelltypen, einschließlich DCs, Makrophagen, Neutrophile und T-Zellen, sind in PCLS und pflegen ihre normalen Strukturen. PCLS 13 kann auch mit Acetylcholin oder Methacholin 12 zu studieren Calcium - Signalisierung und die Kontraktilität des Atemweg und glatten Muskelzellen nach der Behandlung verwendet werden. Bei diesem Ansatz ist nur ein kleiner Teil der Lunge einalyzed mikroskopisch, aber eine Studie berichtete , dass die Messungen der Atemwegskontraktion in PCLS nur etwa 10% von der Scheibe variieren zu schneiden, und diese Varianz vergleichbar ist , das zu 14 in intakten Tieren unter Verwendung von Lungenfunktionstests beobachtet. Andere Forscher haben PCLS als Ex - vivo - Ansatz verwendet zu untersuchen Veränderungen in der Zytokin - Expression und Zelloberflächenmarker nach der Inkubation mit LPS 15. PCLS haben auch in einem ex vivo - Modell der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion in kleinen intra acinar Arterien eingesetzt. Diese Schiffe sind im Teil der Lunge entfernt , die mit anderen Verfahren nicht erreicht werden können, darunter Aufnahmen von sezierten arterielle Segmenten oder Analyse von subpleural Gefäßen 16. Unser Labor hat PCLS zu visualisieren Immunzellortung in lebenden Lungengeweben in einem stabilen Zustand und nach einem In - vivo - Entzündungsreiz eingesetzt. Die Verfahren haben wir dafür entwickelt wurden, sind wie folgt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1-TdTomato transgenic mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>018128</td>
			<td>B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>004194, 006617</td>
			<td>B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rag1 knock-out mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>002216</td>
			<td>B6.129S7-Rag1tm1Mom/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin, Low Endo, Purified</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft</td>
			<td>BD Diagnostic Systems</td>
			<td>427421</td>
			<td>0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3112-125</td>
			<td>2% solution dissolved in PBS at 70 &#176;C and held at 40 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome VF-300</td>
			<td>Precisionary Instruments, Inc.</td>
			<td>VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td>Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue All Purpose Instant Gel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>500033-484</td>
			<td>Commonly available for $3/tube in local drugstores&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>012-000-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>015-000-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Buffer</td>
			<td>Made in House</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)</td>
			<td>Made in House</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b eFluor 450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0112-80</td>
			<td>Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101237</td>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c Phycoerythrin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0114-82</td>
			<td>PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c Allophycocyanin</td>
			<td>BD Phamingen</td>
			<td>550261</td>
			<td>APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD88 Phycoerythrin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>135806</td>
			<td>PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD103 Allophycocyanin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1031-82</td>
			<td>Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0902-82</td>
			<td>Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1721-82</td>
			<td>Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564188</td>
			<td>BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>53-3249-82</td>
			<td>Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>51-3249-82</td>
			<td>Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass</td>
			<td>MatTek Corperation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155411PK&#160;</td>
			<td>Pack of 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness</td>
			<td>MatTek Corperation</td>
			<td>PCS-1.5-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bare Platinum Wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PTP201</td>
			<td>0.020&#34; (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an &#34;L&#34; shape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Keep at 4 &#176;C, warm to room tempterature before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420650-9901-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells

Inhalation von Allergenen und Krankheitserregern entlockt mehrere Änderungen in einer Vielzahl von Immunzelltypen in der Lunge. Die Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik für die quantitative Analyse von Zelloberflächenproteinen auf Immunzellen, aber es gibt keine Informationen über die Lokalisierung und Migrationsmuster dieser Zellen in der Lunge. In ähnlicher Weise kann Chemotaxis - Assays durchgeführt werden , um das Potenzial der Zellen zu untersuchen , um chemotaktische Faktoren in vitro zu reagieren, aber diese Tests nicht die komplexe Umgebung des intakten Lunge reproduzieren. Im Gegensatz zu diesen oben genannten Techniken kann die Lage der einzelnen Zelltypen innerhalb der Lunge leicht durch Erzeugen von präzisionsgeschliffenen Lung Slices (PCLS), Anfärben sie mit handelsüblichen, fluoreszenzmarkierten Antikörpern und Visualisierungen der Abschnitte durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht werden. PCLS kann für beide verwendet werden, leben und Lungengewebe fixiert ist, und die Scheiben Bereiche so groß wie ein Querschnitt einer gesamten Lappen umfassen kann. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um erfolgreich die Position eine Vielzahl von Zelltypen in der Lunge, einschließlich verschiedenen Arten von dendritischen Zellen sichtbar zu machen, Makrophagen, Neutrophile, T-Zellen und B-Zellen, sowie Strukturzellen wie Lymph-, endotheliale und Epithelzellen. Die Fähigkeit, zelluläre Interaktionen sichtbar zu machen, wie die zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen, live, dreidimensionalen Lungengeweben kann zeigen, wie Zellen in der Lunge bewegen und miteinander in einem stabilen Zustand und während der Entzündung in Wechselwirkung treten. Somit wird, wenn in Kombination mit anderen Verfahren, wie Durchflusszytometrie und quantitative PCR verwendet wird, kann PCLS zu einem umfassenden Verständnis von zellulären Ereignissen beitragen, die allergischen und entzündlichen Erkrankungen der Lunge zu Grunde liegen.

Um die Position von zwei DC - Untergruppen, CD11b hallo cDCs und CD103 + cDCs, PCLS von C57BL / 6 - Mäusen wurden geschnitten und gefärbt mit monoklonalen Antikörpern (mAb) , spezifisch für CD11c, CD88, CD103 und CD324 (E-Cadherin) zu identifizieren. Antikörper gegen CD324 stain Atemwegsepithelzellen und CD88 auf Makrophagen und Neutrophile angezeigt, aber nicht mehr als 8 cDCs. Dies ermöglichte es uns cDCs von CD11c + Makrop...

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Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von Precision-cut Lung Slices (PCLS) und immunostaining sie die Lokalisierung verschiedenen Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Unser Protokoll kann erweitert werden, um die Position und Funktion vieler verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu visualisieren.

Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Aufrufe.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH.  Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von Precision-cut Lung Slices (PCLS) und immunostaining sie die Lokalisierung verschiedenen Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Unser Protokoll kann erweitert werden, um die Position und Funktion vieler verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu visualisieren. 

Serie: Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

Rechtsventrikulären systolischen Druck Messungen in Kombination mit Harvest of Lung and Immune Gewebeproben in Mäuse

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Menschliche Lunge Dendritische Zellen: Räumliche Verteilung und phänotypische Identifizierung in Endobronchial Biopsien mittels Immunhistochemie und Durchflusszytometrie

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorische Wirkung von Substanzen im menschlichen Precision-Cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...