Die Autoren möchten Dr. Nai-Sum Wong für die Bereitstellung des Hypoxie-Kammerapparates und Frau Alice Lui für die technische Unterstützung anerkennen.

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden in strikter Übereinstimmung mit dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von dem Ausschuss für die Verwendung von lebenden Tieren für Lehre und Forschung, Li Ka Shing Fakultät für Medizin, der Universität von Hongkong genehmigt. Menschliche Knochenmarkproben wurden aus dem Beckenkamm gesunder Spender erhalten, nachdem sie eine einverstandene Einwilligung erhalten hatten. Die Protokolle wurden vom Institutional Review Board, der University of Hong Kong, genehmigt. 1. Vorbereitung der Ratten-MSC-Kulturen <ol><li> Ernte von MSCs aus dem Femur <ol><li> Autoklavieren Sie alle Sektionswerkzeuge ( dh feines Sezierschere , Stumpfschneidschere und Zahnpinzette) bei 180 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie das MSC - Wachstumsmedium vor, das aus einer minimalen essentiellen Medium - Alpha - Modifikation (αMEM), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin / Streptomycin (P / S, 1% v / v). </li><li> Opfere junge männliche Sprague Dawley Ratten (200-250 g Körpergewicht) durch Pentobarbiton Überdosierung (240 mg / kg Körpergewicht, intraperitoneal). HINWEIS: Marrow-Proben von verschiedenen Ratten sollten separat verarbeitet werden. </li><li> Lege die geopferten Tiere in Rückenlage. Reinigen Sie den Bauch und die unteren Gliedmaßen gründlich mit 70% Ethanol. </li><li> Entfernen Sie die Haut und das subkutane Gewebe über die medialen Oberschenkel mit feinen Sezierscheren und Pinzetten. Entfernen Sie die Oberschenkelmuskeln in Umfangsrichtung, bis der Femur ausgesetzt ist. Setzen Sie diese proximal und distal fort, bis die Knie- und Hüftgelenke gesehen werden. Den Femur durch das Hüft- und Kniegelenk mit stumpfen Schneidscheren abtarchen. HINWEIS: Trense den Femur nicht, um die Markhöhle in diesem Stadium freizulegen. Übertragen Sie intakte Oberschenkel zu einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube für die weitere Verarbeitung. </li><li> Verwenden Sie stumpf gekippte Schneidscheren, um die distalen und proximalen Enden des Femurs durch die Metaphyse zu transectieren. </li><li> Legen Sie einen 70 μm Zellsieb über ein 50 mL konisches Rohr. Setzen Sie eine 21 G, 10 mL Spritze mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7,4) in den exponierten Femurkanal ein und spülen Sie den Markinhalt durch wiederholtes Spülen in das konische Röhrchen. HINWEIS: Etwa 20 ml PBS werden verwendet, um jeden Femur zu spülen. Wenn die Farbe des gespülten Inhalts blutverschmiert und trüb ist, kann ein größeres Volumen verwendet werden. </li><li> Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 480 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen. Das Zellpellet wird in 10 ml MSC-Wachstumsmedium resuspendiert. Die Zellen auf eine 10 cm lange Gewebekultur schichten. Die Gewebekulturschalen in einen Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ) geben. Notieren Sie den ersten Tag der Beschichtung als Tag 0. HINWEIS: In allen Schritten mit Zentrifugation die Bremse für maximale Verzögerung einstellen. </li></ol></li><li> Etablierung und Erweiterung der MSC-Kolonien HINWEIS: Dieses Protokoll rElies auf Gewebekultur plastische Adhärenz als Mittel, um für MSCs aus der Markhöhle 11 zu wählen. Der Knochenmarkgehalt darf 2 Tage lang an der Gewebekulturkunst haften. <ol><li> Am Tag 2 spülen Sie die Kulturplatten dreimal mit 10 ml PBS aus, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Ersetzen Sie das PBS mit 10 ml MSC-Wachstumsmedium nach dem Spülen. Waschen Sie die Zellen mit PBS und füllen Sie mit MSC Wachstumsmedium alle 3 Tage auf. ANMERKUNG: MSC-Kolonien sollten am Tag 6-7 sichtbar sein ( Abbildung 2A ). </li><li> Passage der Zellen bis zum Tag 10 durch Entfernen des Wachstumsmediums und Spülen der Zellen mit PBS. Zugabe von 1,5 ml rekombinantem enzymatischen Zelldissoziationsreagenz und inkubieren bei 37 ° C für 5 min. Füge 3 ml MSC-Wachstumsmedium hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Sammeln Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 250 xg für 5 min. </li><li> Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach einer geeigneten Verdünnung in PBS. </li><li> Samen passagierte Zellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen / cm 2 in eine 10-cm-Kulturplatte in MSC-Wachstumsmedium. HINWEIS: Ratten-MSCs sollten innerhalb von 2 Tagen nach Passage 80-90% Konfluenz erreichen (Abbildung 2B ). Zellen können wie in Schritt 1.2.2 für bis zu 8 Passagen beschrieben passagiert werden. MSCs können durch Immunzytochemie und ihre Fähigkeit zur Trilineage-Differenzierung charakterisiert werden (Abbildung 3 ) 12 . Nur MSC-Kulturen zwischen den Passagen 3 und 8 unterliegen einer nachfolgenden hypoxischen Vorkonditionierung und einer neuronalen Progenitoranreicherung. MSCs mit größerer Durchgangszahl nehmen eine abgeflachte Morphologie an (Abbildung 2C ) und produzieren nicht genügend neuronale Vorläufer. Diese Kulturen sollten verworfen werden. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung von menschlichen BMSC-Kulturen <ol><li> 1 ml humanes Knochenmark aspirieren mit 9 ml MSC Wachstumsmedium verdünnen und die Platte auftragenZellen auf einer 10-cm-Gewebekulturschale. Pflegen Sie die Kulturen in einem Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ). </li><li> Entfernen Sie das Medium nach 2 Tagen und spülen Sie die Kulturen dreimal mit 10 ml PBS ab, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Nach dem abschließenden Spülen das PBS entfernen und es mit 10 ml MSC-Wachstumsmedium ersetzen. Füllen Sie das Wachstumsmedium nach jeder 3 Tage Kultur nach dem PBS-Spülen auf. ANMERKUNG: MSC-Kolonien sollten am Tag 6-7 sichtbar sein. Die Anzahl der Kolonien kann zwischen den Fächern variieren. </li><li> Passage der Zellen am Tag 10, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben. Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach einer geeigneten Verdünnung in PBS. Die passierten Zellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen / cm 2 auf eine 10 cm-Kulturplatte im MSC-Wachstumsmedium absaugen. ANMERKUNG: Menschliche MSCs (Abbildung 2D ) zeigen eine ähnliche Morphologie gegenüber Ratten-MSCs und sollten ebenfalls innerhalb von 2 Tagen nach Passage 80-90% Konfluenz erreichen. Sie sollten chara seinDurch Immunzytochemie und ihre Fähigkeit zur Trilineage-Differenzierung 12 . Wie bei Ratten-MSCs sind menschliche MSCs, die zwischen Passage 3 und 8 liegen, einer nachfolgenden hypoxischen Vorkonditionierung und neuronaler Progenitoranreicherung unterworfen. </li></ol> 3. Hypoxische Vorkonditionierung <ol><li> Demontieren Sie die Hypoxiekammerkomponenten ( dh Basis, Deckel, Schalen) nach dem Lösen der Ringklemme und wischen Sie die Einzelteile mit 70% Ethanol ab. Legen Sie die Kammerkomponenten innerhalb einer laminaren Strömungsgewebekulturhaube zur Sterilisation unter UV-Licht für 15 min. </li><li> Vor der hypoxischen Vorkonditionierung, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Ratte und die menschlichen MSC-Kulturen (Abschnitte 1 und 2) mit 10 ml PBS. Ersetzen Sie das PBS durch 10 ml MSC-Wachstumsmedium, ergänzt mit 25 mM HEPES. ANMERKUNG: Die MSCs, die auf 10 cm Schalen gezüchtet wurden, sollten 80-90% Konfluenz erreicht haben, bevor sie einer hypoxischen Vorkonditionierung unterzogen werden. </li><li> Legen Sie die CulIn der Hypoxiekammer. Die Kammerteile wieder zusammenbauen und die Ringklemme festziehen. Spülen Sie ein Gasgemisch aus 99% N 2 /1% O 2 in die Kammer mit einer Durchflussrate von 10 l / min für 5 min. </li><li> Die Anschlussenden der Hypoxiekammer abdichten, um sicherzustellen, dass kein Gasaustritt besteht. Legen Sie die Kammer 16 Stunden lang in den Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ). </li><li> Nach Beendigung der hypoxischen Vorkonditionierung, entfernen Sie die Kulturen aus der Kammer in Vorbereitung für die nachfolgende neuronale Progenitor Anreicherung Kultur. </li></ol> 4. Neural Progenitor Anreicherung Kultur <ol><li> Bereiten Sie das neuronale Progenitor-Medium vor, das aus Dulbecco&#39;s modifiziertem Adlermedium / Ham-Nährstoffmischung F12 (DMEM / F12), ergänzt mit B27 (2% v / v), basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF, 20 ng / ml), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF, 20 ng / ml) und P / S (1% v / v). </li><li> Trennen Sie die hypoxisch vorkonditionierten Ratten / menschlichen MSCs, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben.Sammeln Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 250 xg für 5 min. Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach entsprechender Verdünnung in PBS. </li><li> Resuspendieren der Zellen in neuronalen Progenitor-Medium und Samen auf Low-Attachment, 6-Well-Platten mit einer Dichte von 6.000 Zellen / cm 2 . Legen Sie die Kultur in einen Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ) für 12 Tage. Füllen Sie 75% des neuronalen Vorläufermediums alle 3 Tage auf. HINWEIS: Größere, nicht adhärente Zellcluster sollten am Tag 6-7 beobachtet werden. Am Tag 10-12 können Neurosphären mit einem Durchmesser ≥ 100 μm beobachtet werden (Abbildung 4 ). Hypoxisch vorkonditionierte MSCs sollten mehr Neurosphären im Vergleich zu MSCs ergeben, die unter normoxischen Bedingungen kultiviert wurden 9 . </li><li> Sammeln Sie Neurosphären am Tag 12, indem Sie sie in eine 10-ml-Pipette absaugen und auf ein 15-ml-Kegelrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Neurosphären bei 250 xg für 5 min. HINWEIS: Neurosphären können seinCharakterisiert am Tag 12 für neuronale Vorläufer Marker, wie Nestin und GFAP 7 . </li></ol> 5. Erzeugung von Schicksal-engagierten Schwann-Zellen über Coculture mit DRG-Neuronen <ol><li> Vorbereitung von gereinigten Ratten-DRG-Neuronen <ol><li> Autoklavieren Sie alle Sektionswerkzeuge ( dh Dissektionsscheren , Pinzetten, zwei Mikrodissektionszangen und Mikrodissektionsscheren) bei 180 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Gebrauch. </li><li> Mantel 6-Well-Gewebekulturplatten mit Poly-D-lysin (PDL, 10 μg / ml in PBS) bei 4 ° C über Nacht. Entfernen Sie die PDL und spülen Sie mit 1,5 ml PBS pro Well. </li><li> Gehen Sie mit der Beschichtung der Platten mit Laminin (10 μg / ml in PBS) bei 37 ° C für 2 h vor. Spülen Sie die Platten mit 1,5 ml PBS pro Vertiefung ab. </li><li> Vorbereiten des DRG-Neuronen-Wartungsmediums, bestehend aus neurobasalem Medium, ergänzt mit B27 (2% v / v), L-Glutamin (1% v / v), Nervenwachstumsfaktor (NGF, 20 ng / ml) und P / S (1 % V / v). </li><li>Vorbereiten des DRG-Neuron-Reinigungsmediums, bestehend aus neurobasalem Medium, ergänzt mit B27 (2% v / v), L-Glutamin (1%), NGF (20 ng / ml), P / S (1%), Fluorodeoxyuridin (FDU, 10 Μg / ml) und Uridin (10 &amp; mgr; g / ml). </li><li> Opfer schwangere Ratten am Gestationstag 14-15 durch pentobarbital Überdosierung (240 mg / kg Körpergewicht, intraperitoneal). </li><li> Lege die geopferten Tiere in Rückenlage. Reinigen Sie den Bauch gründlich mit 70% Ethanol. </li><li> Schneide die untere Bauchwand des Tieres in Längsrichtung mit feiner Sezierschere und Pinzette. Identifizieren und entfernen Sie den Uterus mit Sektionsschere. Schneide die Uteruswand, um die Embryonen auszusetzen und zu extrahieren. Übertragen Sie die Embryos in eine sterile, 10 cm Kulturschale mit PBS gefüllt. Legen Sie die Kulturschale auf Eis. </li><li> Übertragen Sie den Embryo, der für die Sektion vorgesehen ist, in eine sterile, 10 cm große Kulturschale, die mit PBS (Raumtemperatur) gefüllt ist, und positionieren Sie sie unter einem Sektionsmikroskop. Haben Sie den Embryo in anfälliger Position. NICHTE: Das weißliche Rückenmark und die angehängten DRGs können über den dorsalen Aspekt des Embryos durch seine lichtdurchlässige Haut gesehen werden. </li><li> Setzen Sie die Mikrodissektionszange auf beiden Seiten des Rückenmarks ein und verwenden Sie die stumpfe Dissektion, um das Abtasten des abweichenden Weichgewebes zu trennen. Schneiden Sie das Rückenmark frei von dem Tier mit Mikrodissektion Pinzette entlang der Halsöffnung und Heck Stummel. Führen Sie weitere stumpfe Dissektion über den ventralen Aspekt der Schnur, um es von umgebenden Weichgewebe zu befreien. </li><li> Verwenden Sie Mikrodissektionszangen, um restliches Weichgewebe über den dorsalen Aspekt des befreiten Rückenmarks zu entfernen. HINWEIS: In diesem Stadium sollten nur das Rückenmark, Nervenwurzeln und angeschlossene DRG bleiben. </li><li> Trennen Sie einzelne DRGs von ihren verbindenden Nervenwurzeln mit Mikrodissektionszangen. Verwenden Sie einen Pipettenstift, der an einer 1-ml-Spitze befestigt ist, um die DRGs in ein 1,5 ml steriles Zentrifugenröhrchen zu bringen, das PBS enthält. HINWEIS: Für jede 1,5 mL Röhre, maximal100 DRGs können untergebracht werden. </li><li> Die DRGs bei 250 xg für 5 min zentrifugieren und in rekombinantem enzymatischen Zelldissoziationsreagenz (200 &amp; mgr; l pro Röhrchen) resuspendieren. Inkubieren (37 ° C, 5% CO 2 ) für 10 min. Die DRGs bei 250 xg für 5 min zentrifugieren, den Überstand entfernen und in DRG-Neuron-Wartungsmedium resuspendieren. Das Pellet wird durch sanftes Triturieren mit einer 200 μl Pipettenspitze abgetrennt. Die Zellen innerhalb des Pellets mit einem Hämocytometer nach einer geeigneten Verdünnung quantifizieren. </li><li> Die Zellen mit einer Dichte von 5.000 Zellen / cm 2 in PDL / Laminin-beschichtete 6-Well-Platten in 1,5 ml DRG-Neuron-Wartungsmedium pro Vertiefung absaugen. Nach zwei Tagen Kultur entfernen Sie das DRG-Neuron-Wartungsmedium, spülen mit PBS und ersetzen durch DRG-Neuron-Reinigungsmedium. HINWEIS: Für jeden Reinigungszyklus die DRG-Kulturen mit dem Reinigungsmedium für 2 Tage behandeln, gefolgt von einem Tag der Inkubation im Wartungsmedium. Nach 3-4 Reinigungszyklen, die remOval aller endogenen glia wird erwartet 7 Das dauert ca. 14 Tage. Gereinigte Kulturen testen positiv auf den neuronalen Marker TUJ1 und fehlen für die S100β-Expression (Abbildung 5 ). </li></ol></li><li> Erzeugung von Schwann-Zell-Zellen <ol><li> Bereiten Sie das Gliainduktionsmedium, bestehend aus αMEM, ergänzt mit β-Heregulin (100 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF-AA, 5 ng / ml), FBS (10%) und P / S (1% v / v). </li><li> Die in Abschnitt 4 hergestellten Neurosphären in PDL / Laminin-beschichteten 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5-10 Kugeln pro cm 2 in 1,5 ml Gliainduktionsmedium pro Well auftragen. Ersetzen Sie das Gliainduktionsmedium alle 2 Tage nach dem Spülen der Zellen mit PBS. ANMERKUNG: Zellen aus seedierten Neurosphären werden nach Tag 2 nach außen ausgewandert. Am Tag 7 haben die Migrationszellen ein verjüngtes Aussehen und sollten die Immunopositivität für die Schwann-Zelle nachweisenMarker p75 Neurotrophin Rezeptor (p75) und S100β 7 . Diese Zellen werden als SCLCs bezeichnet. </li></ol></li><li> Kokultur von SCLCs mit DRG-Neuronen <ol><li> Bereiten Sie das Kokulturmedium vor, das aus dem DRG-Neuron-Wartungsmedium (Schritt 5.1.4) und dem Gliainduktionsmedium (Schritt 5.2.1) im Verhältnis 1: 1 Volumen-zu-Volumen besteht. </li><li> Vorbereitung des Schwann-Zell-Wartungsmediums aus DMEM / F12, ergänzt mit FBS (5%), β-Heregulin (10 ng / ml) und P / S (1% v / v). </li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium von Tag 7 SCLCs, spülen Sie sie mit PBS und inkubieren Sie sie mit 0,5 ml / Vertiefung des rekombinanten enzymatischen Zelldissoziationsreagens bei 37 ° C für 5 min. Die SCLCs im Kokulturmedium resuspendieren. </li><li> Die Zellen mit einem Hämocytometer nach einer entsprechenden Verdünnung quantifizieren. </li><li> Die SCLCs auf gereinigte DRG-Neuron-Kulturen mit einer Dichte von 1.000 Zellen / cm 2 säen. Halten Sie die Cocultures für 14 Tage, mit Medium Ersatz alle 2 Tage. HINWEIS: Während der Kokultur haben SCLCs die spindelartige Morphologie erworben, die typisch für reife Schwann-Zellen ist (Abbildung 6 ). Diese Zellen bestehen nach dem Entzug von Wachstumsfaktoren in ihrem Phänotyp und sind in der Lage, Axone in vitro und in vivo 7 , 10 zu myelinieren. Die Positivität der Schwann-Zellmarker ( dh p75 und S100β) sollte durch Immunfluoreszenz überwacht werden. </li><li> Nach Beendigung der Kokultur, Passage-engagierte Schwann-Zellen, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben. Verwenden Sie 0,5 ml Dissoziationsreagenz pro Vertiefung. Die Zellen mit einem Hämocytometer nach einer entsprechenden Verdünnung quantifizieren. </li><li> Resuspendieren Sie Schicksal-engagierte Schwann-Zellen in Schwann-Zell-Wartungsmedium mit einer Dichte von 10.000 Zellen / cm 2 . Samenzellen in PDL / Laminin-beschichtete 6-Well-Platten für Immunfluoreszenz. ANMERKUNG: Cocultures enthalten zwangsläufig MSCs, die einen Fibroblasten angenommen habenZelle Schicksal 7 . Diese Zellen werden zusammen mit Schicksal-engagierten Schwann-Zellen nach der Fertigstellung der Kokultur passagiert. Schwann-Zellen, die oben auf diesem Fibroblasten-Substrat liegen, können nach dem Spülen mit &quot;kalten Strahlen&quot; von PBS (4 ° C), wie es an anderer Stelle beschrieben wurde, leicht abgelöst und weiter ausgebaut werden. Schicksal-engagierte Schwann-Zellen können im Wartungsmedium für 1 Monat erweitert werden. </li></ol></li></ol>

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Alle Autoren dieses Manuskripts haben keine Offenbarungen.

Es ist wichtig, die &quot;Stämme&quot; von MSCs vor der Anreicherung von neuronalen Vorläufern durch hypoxische Vorkonditionierung und Neurosphären-Kultur zu bewahren. Aus unserer Erfahrung können multipotenten MSCs zuverlässig durch ihre langgestreckte fibroblastenartige Morphologie identifiziert werden. Im Gegensatz dazu nehmen MSCs, die eine abgeflachte, viereckige Morphologie mit prominenten zytoskeletalen Stressfasern angenommen haben, nicht leicht neurales Zellschicksal an und sollte verworfen werden. Im Allg...

Die Transplantation von neuronalen Vorläufern und deren Derivaten zeigt Versprechen als Behandlungsstrategie nach traumatischer Nervenverletzung 1 , 2 und Neurodegeneration 3 , 4 . Vor der klinischen Anwendung ist es wichtig, i) eine Methode für den Zugang und die Erweiterung einer autologen Quelle von Stamm- / Vorläuferzellen und ii) ein Mittel, um sie auf relevante, reife Zelltypen zu lenken, zu gewährleisten. Unser Interesse an der Zelltherapie bei Rückenmarksverletzungen führte uns dazu, eine robuste, autologe Zellquelle neuraler Vorläufer aus adulten Geweben zu suchen. Eine Subpopulation von MSCs stammt aus dem Neuralwappen und ist leicht aus der Markhöhle zugänglich. Diese Zellen sind neuronale Vorläufer, die Neuronen und Glia erzeugen können 5 . Tiermodelle der zerebralen Ischämie zeigen, dass Hypoxie die Prol<html> Iferation und multipotenz der neuronalen progenitoren im gehirn 6 Dies war die Grundlage für die Verwendung der hypoxischen Vorkonditionierung als Mittel zur Ausweitung auf margen-abgeleitete neuronale Vorläufer. Die Transplantation von Schwann-Zellen in das verletzte Rückenmark fördert die Regeneration 2 . SCLCs können aus MSCs mittels Supplementierung mit gliogenen Faktoren ( dh β-Heregulin, bFGF und PDGF-AA) erzeugt werden, zeigen aber phänotypische Instabilität. Nach dem Abzug der Wachstumsfaktoren kehren sie zu einem fibroblastenähnlichen Phänotyp 7 zurück . Phänotypische Instabilität ist bei der Zelltransplantation aufgrund des Risikos einer abweichenden Differenzierung und Karzinogenese unerwünscht. Da Schwann-Zellvorläufer mit Axonbündeln innerhalb des embryonalen peripheren Nervs 8 assoziiert sind, wurden wir zu kokulturen SCLCs mit gereinigten embryonalen DRG-Neuronen 7 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 9 Die resultierenden reifen Schwann-Zellen sind schicksalhaft engagiert und zeigen die Funktion in vitro 7 , 9 und in vivo 10 . Unser Protokoll für die Anreicherung von neuronalen Progenitoren aus MSCs ist einfach und effizient und führt zu einer Erhöhung der Zellzahl für nachfolgende Assays. Die Ableitung von Schicksal-engagierten Schwann-Zellen über die Coculture-Plattform ermöglicht die Untersuchung der Glia-Differenzierung und die Erzeugung von stabilen und funktionellen Schwann-Zellen für eine mögliche klinische Anwendung.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Sigmaaldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermofisher scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biosera</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher scientific</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)</td><td>Thermofisher scientific</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B/100UG</td><td></td></tr><tr><td>Nerve growth factor (NGF)&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin beta-3, EGF domain (&amp;beta;-Her)</td><td>Millipore</td><td>01-201</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigmaaldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluro-2&#039; - deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (PDL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P7886-1G</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermofisher scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin (P/S)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>10 cm plate for adherent culture</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Used for selection of MSCs by tissue culture adherence</td></tr><tr><td>6-well plate for adherent culture</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>Used for expansion of MSCs following passaging</td></tr><tr><td>UltraLow 6-well plate for non-adherent culture</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Used for neural progenitor enrichment</td></tr><tr><td>anti-human CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>555593</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>550256</td><td></td></tr><tr><td>anti-human/rat STRO-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1038</td><td></td></tr><tr><td>anti-human nestin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555480</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>554895</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>551123</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat nestin</td><td>BD Biosciences</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100&amp;beta;</td><td>Dako</td><td>Z031101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p75</td><td>Millipore</td><td>MAB5386</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Sigmaaldrich</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human nuclei</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia chamber</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

hypoxic preconditioning of marrow-derived progenitor cells as a source for the generation of mature schwann cells

Dieses Manuskript beschreibt ein Mittel, um neuronale Progenitoren aus der Pop-Pop-Pop-Population (MSC) zu bereichern und danach auf das reife Schwann-Zellschicksal zu lenken. Wir unterwarfen Ratten- und menschliche MSCs vorübergehenden hypoxischen Zuständen (1% Sauerstoff für 16 h), gefolgt von einer Expansion als Neurosphären auf Niedrig-Attachment-Substrate mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) / basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) -Anpassung. Neurosphären wurden auf Poly-D-Lysin / Laminin-beschichtete Gewebekultur-Plastik ausgesät und in einem gliogenen Cocktail mit β-Heregulin, bFGF und Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF) kultiviert, um Schwann-Zell-ähnliche Zellen (SCLCs) zu erzeugen. Die SCLCs wurden für 2 Wochen mit gereinigten Dorsalwurzelganglien (DRG) -Neuronen, die von E14-15-schwangeren Sprague-Dawley-Ratten erhalten wurden, über die Kokultur gerichtet. Reife Schwann-Zellen zeigen die Persistenz bei der S100β / p75-Expression und können Myelinsegmente bilden. Auf diese Weise erzeugte Zellen haben das Potential aAnwendungen in autologen Zelltransplantationen nach Rückenmarksverletzungen sowie bei der Krankheitsmodellierung.

Eine Übersicht über die wichtigsten Stufen in unserem Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Zusammenfassend werden Ratten- und menschliche MSCs durch die Einhaltung von Gewebekulturplastik ausgewählt. Expandierte MSCs sind mit Hypoxie vorkonditioniert und unterliegen dann Neurosphären-bildenden Bedingungen. Neurosphären sind plattiert und können in SCLCs differenzieren. SCLCs werden mit gereinigten DRG-Neuronen cocultured, um Schicksal-engagierte S...

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Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Marrow Stromazellen (MSCs) mit neuronalen Potenzial gibt es im Knochenmark. Unser Protokoll bereichert diese Population von Zellen durch hypoxische Vorkonditionierung und leitet sie dann zu reifen Schwann-Zellen.

Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

hypoxic-preconditioning-marrow-derived-progenitor-cells-as-source-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.3K Aufrufe.  The University of Hong Kong.  Marrow Stromazellen (MSCs) mit neuronalen Potenzial gibt es im Knochenmark. Unser Protokoll bereichert diese Population von Zellen durch hypoxische Vorkonditionierung und leitet sie dann zu reifen Schwann-Zellen. 

Serie: Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Forschung

Neurowissenschaften

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Biotechnik

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Immunologie und Infektion

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Biologie

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

<meta charset="utf8"></head><body>Osteo-Organoid-abgeleitete Zellen für eine effektive HSZT bei bestrahlten Mäusen

In Vivo Osteo-organoid Approach for Harvesting Therapeutic Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an adequate source of HSPCs, we developed an in vivo osteo-organoid by implanting scaffolds loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) into an internal muscle pouch near the femur in mice. After 12 weeks of implantation, we retrieved the in vivo osteo-organoids and conducted flow cytometry analysis on HPSCs, revealing a significant presence of HSPC subsets within the in vivo osteo-organoids.
We then established a sublethal model of hematopoietic/immune system injury in mice through radiation and performed hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) by injecting the extracted osteo-organoid-derived cells into the peripheral blood of radiated mice. The effect of hematopoietic recovery was evaluated through hematological, peripheral blood chimerism, and solid organ chimerism analyses. The results confirmed that in vivo osteo-organoid-derived cells can rapidly and efficiently reconstruct damaged peripheral and solid immune organs in irradiated mice. This approach holds potential as an alternative source of HSPCs for HSCT, offering benefits to a larger number of patients.

<meta charset="utf8"></head><body>In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Here, we established in vivo osteo-organoids triggered by bone morphogenetic protein-2-loaded gelatin scaffolds to harvest therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells for the reconstruction of a damaged hematopoietic and immune system. Overall, this approach can provide a promising cell source for cell therapies.

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an ...

<meta charset="utf8"></head><body>Intrafemorale Injektion für Knochenmarkstudie an lebenden Mäusen

Simplified Intrafemoral Injections Using Live Mice Allow for Continuous Bone Marrow Analysis

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. In murine models, this technique has been adapted to enhance the seeding efficiency of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This paper describes a detailed step-by-step technical procedure of IF injection and the following bone marrow (BM) aspiration in mice that allows for serial characterization of cells present in the BM. This method enables the transplantation of valuable samples with low cell numbers that are particularly difficult to engraft by intravenous injection. This procedure facilitates the creation of xenografts that are critical for pathological analysis. While it is easier to access peripheral blood (PB), the cellular composition of PB does not reflect the BM, which is the niche for HSPCs. Therefore, procedures providing access to the BM compartment are essential for studying hematopoiesis. IF injection and serial BM aspiration, as described here, allow for the prospective retrieval and characterization of cells enriched in the BM, such as HSPCs, without sacrificing the mice.

<meta charset="utf8"></head><body>Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

This protocol describes the intrafemoral injection of a few hematopoietic or leukemic stem cells, including gene-edited cells, in murine xenograft models, which will not only enable the quick and safe transplantation of cells but also serial analyses of the bone marrow.

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. ...

Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

Zusammenfassung

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Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse