저자는 저산소 챔버 장치를 제공 한 Dr. Nai-Sum Wong과 기술 지원을 담당 한 Ms. Alice Lui를 인정하고자합니다.

동물을 포함한 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 NIH 지침에 따라 엄격히 수행되었으며, 홍콩 대학교 의과 대학 Li Ka Shing 학부의 교수 및 연구 실용 동물 사용위원회의 승인을 받았습니다. 인간 골수 샘플은 정보 제공자의 동의를 얻은 후 건강한 공여자의 장골 크레스트로부터 얻어졌다. 의정서는 홍콩 대학 (Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 1. 래트 MSC 배양 물의 제조 <ol><li> 대퇴골에서 MSCs 수확 <ol><li> 사용 전 적어도 2 시간 동안 180 ° C에서 모든 해부 툴 ( 즉, 잘게 깎은 가위, 무뚝뚝한 뾰족한 절단 가위 및 이빨 집게)을 고압 살균하십시오. </li><li> 15 % 태아 소 혈청 (FBS)과 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S, 1 % v / v)이 보충 된 최소 필수 중 알파 - 알파 변형 (αMEM)을 포함하는 MSC 성장 배지를 준비한다.). </li><li> 펜토 바르 비톤 과다 투여 (240 mg / kg 체중, 복강 내)하여 젊은 수컷 Sprague Dawley 쥐 (체중 200-250 g)를 희생시킨다. 참고 : 다른 쥐의 골수 샘플은 별도로 처리해야합니다. </li><li> 희생 된 동물을 앙와위로 두십시오. 70 % 에탄올로 복부와 팔다리를 깨끗이 닦으십시오. </li><li> 미세 해부 가위 및 포 셉를 사용하여 중간 허벅지를 통해 피부와 피하 조직을 제거합니다. 대퇴부가 노출 될 때까지 허벅지 근육을 원주 방향으로 제거합니다. 무릎 및 엉덩이 관절이 보일 때까지이 근위 및 원위로 계속하십시오. 뾰족한 뾰족한 절단 가위를 사용하여 둔부와 무릎 관절을 통해 대퇴골을 분리하십시오. 참고 :이 단계에서 골수강을 노출시키기 위해 대퇴골을 가로 지르지 마십시오. 손상되지 않은 대퇴골을 층류 조직 배양 후드로 옮겨 추가 처리합니다. </li><li> metaphysis를 통해 대퇴골의 원위 및 근위 끝을 transect하는 무딘 팁 절단 가위를 사용. </li><li> 50 ML 원추형 튜브 위에 70 μm의 셀 스트레이너를 놓으십시오. 인산염 완충 식염수 (PBS, 10 MM Na 2 HPO 4 , 산도 7.4)가 들어있는 21G, 10mL 주사기를 노출 된 대퇴부에 삽입하고 플러시를 반복하여 원뿔 튜브에 골수 내용물을 플러시하십시오. 참고 : 각 대퇴부를 세척하기 위해 약 20 mL의 PBS를 사용합니다. 플러시 된 내용의 색이 혈액 염색 및 탁한 상태로 유지되면 더 큰 볼륨을 사용할 수 있습니다. </li><li> 5 분 480 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 뜨는 물을 버린다. MSC 성장 매체 10 ML에 세포 펠렛을 Resuspend. 10cm 조직 배양 dish.Place 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에 조직 문화 요리에 세포를 플레이트. 0 일째로 도금 첫 날을 기록한다. 참고 : 원심 분리를 포함한 모든 단계에서 최대 감속을 위해 브레이크를 설정하십시오. </li></ol></li><li> MSC 식민지의 확립과 확장 참고 :이 프로토콜 r골수강 내에서 MSCs를 선택하는 수단으로서의 조직 배양 플라스틱 접착에 관한 연구 11 . 골수 양은 조직 배양 플라스틱에 2 일 동안 고착시킬 수 있습니다. <ol><li> 2 일째, 10 mL의 PBS로 배양 판을 3 회 씻어서 비 부착 성 세포를 제거합니다. 린스 후 MSC 성장 매체 10 ML와 PBS를 교체하십시오. PBS로 세포를 씻어서 매 3 일마다 MSC 성장 배지로 보충하십시오. 참고 : MSC 콜로니는 6-7 일까지 볼 수 있어야합니다 ( 그림 2A ). </li><li> 성장 매체를 제거하고 PBS로 세포를 씻어서 일 10까지 세포를 통과하십시오. 재조합 효소 세포 해리 시약 1.5 ML을 추가하고 37에서 품어 ° C 5 분. 반응을 중화시키기 위해 3 mL의 MSC 성장 배지를 첨가한다. 5 분 250 XG에서 원심 분리하여 분리 된 세포를 수집합니다. </li><li> PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. </li><li> 종자는 MSC 성장 배지에서 10-cm 배양 플레이트에 40,000 세포 / cm 2 의 밀도로 세포를 계대시켰다. 참고 : 랫 MSC는 계대 2 일 이내에 80-90 %의 합류에 도달해야합니다 ( 그림 2B ). 세포는 단계 1.2.2에서 설명한대로 8 계대까지 계대 할 수 있습니다. MSCs는 면역 세포 화학과 trilineage 분화 ( 그림 3 ) 12 에 대한 그들의 능력의 수단으로 특성 수 있습니다. 통로 3과 통로 8 사이의 MSC 배양 만이 후속 저산소증 전 조건화 및 신경 전구 조기 농축의 대상이됩니다. 더 큰 계통 번호의 MSC는 평평한 형태를 취하고 ( 그림 2C ) 충분한 수의 신경 전구 세포를 생성하지 않습니다. 이러한 문화는 폐기해야합니다. </li></ol></li></ol> 2. 인간 BMSC 배양 물의 제조 <ol><li> 인간 골수 1 mL를 MSC 성장 배지 9 mL로 희석하고 플레이트10cm 조직 배양 접시에있는 세포. 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에서 배양 물을 유지하십시오. </li><li> 2 일 후 배지를 제거하고 비 점착성 세포를 제거하기 위해 PBS 10 mL로 배양액을 3 회 부드럽게 씻어냅니다. 최종 린스 후 PBS를 제거하고 10 mL의 MSC 성장 배지로 교체하십시오. PBS 린스 후 배양 3 일마다 성장 배지를 보충하십시오. 참고 : MSC 콜로니는 6-7 일까지 볼 수 있어야합니다. 식민지의 수는 개체간에 다를 수 있습니다. </li><li> 단계 1.2.2에서 설명한대로 10 일째에 세포를 통과시킵니다. PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. MSC 성장 매체에서 10cm 문화 플레이트에 40,000 세포 / cm 2 의 밀도에서 계대 세포를 씨앗. 참고 : 인간 MSC ( 그림 2D )는 랫 MSC와 유사한 형태를 나타내며 마찬가지로 통과 2 일 이내에 80-90 %의 합류에 도달해야합니다. 그들은 chara이어야한다.immunocytochemistry 및 trilineage 차별화를위한 그들의 능력에 의해 cterized 12 . 쥐의 MSC와 마찬가지로, 3 ~ 8 단계의 인간 MSC는 후속 저산소 조건화 및 신경 전구 조기 농축의 대상이됩니다. </li></ol> 3. 저산소 사전 컨디셔닝 <ol><li> 링 클램프를 풀고 hypoxia 챔버 구성 요소 ( 즉, 베이스, 뚜껑, 쟁반)를 분해하고 70 % 에탄올로 각 부품을 깨끗이 닦아냅니다. 15 분 동안 자외선 아래 살균을위한 층류 조직 문화 후드 내에 챔버 구성 요소를 놓습니다. </li><li> hypoxic preconditioning하기 전에, 매체를 제거하고 10 ML의 PBS로 쥐와 인간 MSC 문화 (섹션 1과 2)을 씻어. 25 MM HEPES로 보충 MSC 성장 매체 10 ML와 PBS를 교체하십시오. 참고 : 10cm dish에서 배양 된 MSC는 저산소 조건화를 받기 전에 80-90 %의 confluency에 도달해야합니다. </li><li> 줄을 놓으십시오.저산소실에서 요리를합니다. 챔버 부품을 다시 조립하고 링 클램프를 조입니다. 99 % N 2 / 1 % O 2 의 가스 혼합물을 5 분 동안 10L / min의 유속으로 챔버로 흘려 보내십시오. </li><li> 가스 누설이 없도록 저산소 챔버의 연결 끝 부분을 밀봉하십시오. 16 시간 동안 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 ) 안에 챔버를 놓습니다. </li><li> hypoxic preconditioning 완료되면, 후속 신경 전구체 농축 문화에 대비하여 챔버에서 문화를 제거합니다. </li></ol> 4. 신경 전구 세포 농축 배양 <ol><li> B27 (2 % v / v), 염기성 섬유 모세포 성장 인자 (bFGF, 20 ng / ml), 상피 세포 성장 인자 (EGF, EGF)가 보충 된 Dulbecco &#39;s modified eagle medium / Ham의 영양 혼합물 F12 (DMEM / F12) 20 ng / mL) 및 P / S (1 % v / v)를 포함한다. </li><li> 단계 1.2.2에서 설명한대로 hypoxic preconditioned 쥐 / 인간 MSC를 분리합니다.5 분 250 XG에서 원심 분리하여 분리 된 세포를 수집합니다. PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. </li><li> 6,000 셀 / cm 2 의 밀도로 낮은 부착, 6 잘 접시에 신경 progenitor 매체와 종자에있는 세포를 Resuspend. 12 일 동안 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에 문화를 놓으십시오. 3 일마다 75 %의 신경 전구 세포를 보충하십시오. 참고 : 크기가 큰 비 부착 성 세포 클러스터는 6-7 일까지 관찰해야합니다. 10-12 일까지, 직경 ≥ 100 μm의 뉴로 필어를 관찰 할 수 있습니다 ( 그림 4 ). 저산소 상태의 전처리 된 MSC는 정상 산소 상태에서 배양 된 MSC와 비교하여 더 많은 신경 세포를 생성합니다 9 . </li><li> 12 일에 10-mL 피펫으로 흡입하고 15 mL 원뿔 튜브로 옮겨 neurospheres를 모으십시오. 5 분 250 XG에서 neurospheres를 원심 분리기. 참고 : Neurospheres 수 있습니다네 스틴 (nestin) 및 GFAP 7 과 같은 신경 전구 마커에 대해 12 일째에 특징 지워진다. </li></ol> 5. DRG 뉴런과 공동 배양을 통한 운명의 결정을받은 Schwann 세포의 생성 <ol><li> 정제 된 래트 DRG 뉴런의 제조 <ol><li> 사용하기 전에 적어도 2 시간 동안 180 ° C에서 모든 해부 도구 ( 즉, 해부 가위, 포셉, 두 microdissection 집게 및 microdissecting 가위)을 고압. </li><li> 하룻밤 동안 4 ℃에서 poly-D-lysine (PDL, PBS에 10 μg / mL)을 코팅 한 6- 웰 조직 배양 플레이트. PDL을 제거하고 잘 PBS 당 1.5 ML로 씻으십시오. </li><li> 37 ℃에서 2 시간 동안 라미닌 (PBS 중의 10㎍ / mL)으로 플레이트를 코팅하는 것으로 진행한다. 1 well 당 1.5 mL의 PBS로 플레이트를 헹군다. </li><li> B27 (2 % v / v), L- 글루타민 (1 % v / v), 신경 성장 인자 (NGF, 20 ng / mL) 및 P / S (1 % v / v)가 보충 된 신경근 배지로 구성된 DRG 뉴런 유지 배지를 준비한다. % v / v). </li><li>B27 (2 % v / v), L-glutamine (1 %), NGF (20 ng / mL), P / S (1 %), fluorodeoxyuridine (FDU, 10)을 보충 한 신경 섬유 배지로 구성된 DRG 뉴런 정화 배지 μg / mL), 우리 딘 (10μg / mL). </li><li> 임신 14- 15 일에 임신 한 쥐를 pentobarbital 과량 투여 (240 mg / kg bodyweight, intraperitoneal)하여 희생시킨다. </li><li> 희생 된 동물을 앙와위로 두십시오. 70 % 에탄올로 복부를 깨끗이 닦습니다. </li><li> 벌금 해부 가위와 포 셉를 사용하여 동물의 하복부 벽을 세로로 자르십시오. 해부 가위를 사용하여 자궁을 확인하고 제거하십시오. 자궁 벽을 잘라 배아를 노출시키고 추출하십시오. 배아를 PBS로 가득 찬 멸균 10 cm 문화 접시에 옮기십시오. 얼음에 문화 접시를 놓으십시오. </li><li> 해부를위한 배아를 PBS (실온)로 가득 찬 멸균 10 cm 문화 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 위치시킵니다. 배아가 엎드리는 자세에있게하십시오. 아니E : 희끄무레 한 척수와 부착 된 DRG는 반투명 한 피부를 통해 배아의 지느러미 측면에서 볼 수 있습니다. </li><li> 척수의 양쪽을 따라 microdissecting 집게를 삽입하고 주변 연조직에서 척수를 분리 시작하기 위해 무딘 절개를 사용합니다. 목 개방과 꼬리 스텁을 따라 microdissecting 집게를 사용하여 동물에서 척수를 무료로 잘라. 주변의 연조직에서 코드를 제거하기 위해 코드의 복부 측면에 대해 추가 무딘 절개를 수행하십시오. </li><li> microdissecting 집게를 사용하여 해제 척수의 지느러미 측면 이상의 잔여 연조직을 제거합니다. 참고 :이 단계에서는 척수, 신경 뿌리 및 부착 된 DRG 만 남아 있어야합니다. </li><li> microdissecting 집게를 사용하여 연결 신경 뿌리에서 개별 DRGs를 분리합니다. PBS가 포함 된 1.5 ML, 살균 원심 분리기 튜브에 DRG를 전송하는 1 ML 팁에 연결된 피펫 펜을 사용합니다. 참고 : 각 1.5 mL 튜브의 경우 최대100 개의 DRG를 수용 할 수 있습니다. </li><li> 5 분 250 XG에서 DRGs를 원심 분리기 및 재조합 효소 세포 해리 시약 (튜브 당 200 μL)에 그들을 resuspend. 10 분 동안 37 ℃, 5 % CO 2를 인큐베이션한다. 5 분 250 XG에서 DRG를 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 DRG 뉴런 유지 관리 매체에 resuspend. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 부드러운 마찰로 펠렛을 떼어. 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. </li><li> 잘 당 DRN 뉴런 유지 매체 1.5 ML PDL / laminin - 코팅 6 잘 판에 5,000 세포 / cm 2 의 밀도로 세포를 씨앗. 배양 2 일 후, DRG 뉴런 유지 매체를 제거하고 PBS로 헹구고 DRG 뉴런 정화 배지로 교체하십시오. 참고 : 각 정화 사이클에 대해 DRG 배양 물을 정화 배지로 2 일 동안 처리 한 다음 유지 관리 배지에서 1 일 배양합니다. 3-4 정화 사이클 후에, rem모든 내인성 glia의 타원형이 예상된다. 이것은 약 14 일 소요됩니다. 정제 된 문화는 연결 표지 TUJ1에 대해 양성이며 S100β 발현에는 결핍되어있다 ( 그림 5 ). </li></ol></li><li> 슈반 세포 - 유사 세포의 생성 <ol><li> β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (10 %), P / S (1 % v / v). </li><li> PDL / laminin - 코팅 6 - 웰 플레이트에서 웰당 1.5 ML의 glial 유도 매체 cm 2 당 5-10 구의 밀도에서 섹션 4에서 준비 neurospheres를 판다. PBS로 세포를 헹구어 glial 유도 매체를 2 일마다 교체하십시오. 참고 : 시드 neurospheres에서 세포가 2 일까지 바깥쪽으로 마이 그 레이션 것으로 나타났습니다. 7 일까지, 철근 모양이 테이퍼 모양과 Schwann 세포에 대한 immunoposivity을 보여야한다마커 p75 뉴로 트로 핀 수용체 (p75) 및 S100β 7 . 이러한 셀을 SCLC라고합니다. </li></ol></li><li> SCLC와 DRG 뉴런의 공동 배양 <ol><li> DRG 뉴런 유지 매체 (단계 5.1.4)와 glial 유도 매체 (단계 5.2.1)로 구성된 공동 배양 배지를 1 : 1 부피비로 준비합니다. </li><li> FBS (5 %), β- 헤레 구린 (10 ng / mL), P / S (1 % v / v)가 보충 된 DMEM / F12로 구성된 Schwann 세포 유지 배지를 준비한다. </li><li> 7 일 SCLC에서 배양 배지를 제거하고 PBS로 씻어 내고 37 ℃에서 0.5 mL / well의 재조합 효소 세포 해리 시약으로 5 분 동안 배양합니다. 공동 배양 배지에 SCLC를 재현 탁한다. </li><li> 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 세포를 정량. </li><li> 1,000 셀 / cm 2 의 밀도로 SCLC를 정화 DRG 뉴런 문화에 종자. 2 일 간격으로 배지 교환을 실시하여 14 일 동안 공동 배양 물을 유지하십시오. 참고 : 공동 배양하는 동안 SCLCs는 성숙 Schwann 세포의 전형적인 스핀들 모양의 형태를 획득했습니다 ( 그림 6 ). 이러한 세포는 성장 인자의 철수 후 그들의 표현형에서 유지하고 체외 및 생체 내 axons myelinate 수 있습니다 7 , 10 . Schwann 세포 마커 ( 즉, p75 및 S100β)의 양성 여부는 면역 형광법으로 모니터링해야합니다. </li><li> 공동 배양이 완료되면 단계 1.2.2에서 설명한대로 숙주가 수행 한 Schwann 세포를 통과시킨다. 1 웰 당 0.5 mL의 해리 시약을 사용한다. 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 세포를 정량. </li><li> Schwann 세포 유지 배지에서 10,000 세포 / cm 2 의 밀도로 운명의 결정을 한 Schwann 세포를 Resuspend하십시오. immunofluorescence위한 PDL / laminin - 코팅 6 잘 판에 세포를 시드. 참고 : 공동 배양은 필연적으로 섬유 아세포를 채택한 MSCs를 포함합니다세포 운명 7 . 이 세포들은 공동 배양의 완료시 운명 - 확약 Schwann 세포와 함께 계대된다. 이 fibroblast substratum의 꼭대기에있는 Schwann 세포는 PBS (4 ℃)의 &quot;콜드 제트 (cold jets)&quot;를 사용하여 헹구어 낸 후 쉽게 분리되어 추가로 팽창 될 수있다. 운명을 약속 한 Schwann 세포는 1 달 동안 유지 매체에서 확장 될 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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저산소 전처리 및 신경 구형 문화를 통해 신경 전구 세포를 풍부하게하기 전에 MSC의 &quot;줄기 (stemness)&quot;를 보존하는 것이 중요합니다. 우리의 경험으로부터 다 분화 MSC는 길쭉한 섬유 모세포와 같은 형태로 확실하게 확인 될 수 있습니다. 대조적으로, 현저한 세포 골격 스트레스 섬유를 갖는보다 편평한 사각 형태를 채택한 MSCs는 신경 세포의 운명을 쉽게 받아들이지 않으므로 버려야한다. 일?...

신경 progenitors과 그 유도체의 이식은 외상성 신경 손상 1 , 2 및 neurodegeneration 3 , 4 후 치료 전략으로 약속을 보여줍니다. 임상 적용 전에, i) 줄기 / 전구 세포의자가 공급원에 접근하고 확대하기위한 방법과 ii) 관련성이 있고 성숙한 세포 유형으로 그들을 안내하는 수단 3)을 보장하는 것이 필수적이다. 척수 손상에 대한 세포 치료에 대한 우리의 관심은 성인 조직으로부터의 강력한 신경 전구 세포 공급원을 찾기 위해 노력했다. MSCs의 subpopulation은 신경 볏에서 유래하고 쉽게 골수강에서 접근 가능합니다. 이 세포들은 뉴런과 glia 5 를 생성 할 수있는 신경 전구 세포입니다. 뇌 허혈의 동물 모델은 저산소증이 prol<html> 뇌 내부의 신경 progenitors의 iferation 및 multipotency 6 . 이것은 골수 유래 신경 전구 세포를 확장시키는 수단으로서 저산소 전처리를 이용하는 기초였다. 손상된 척수에 Schwann 세포를 이식하면 재생이 촉진됩니다 2 . SCLCs는 gliogenic 요인 ( ie, β-Heregulin, bFGF, 및 PDGF-AA)에 보충 교재에 의하여 MSCs에서 생성 할 수 있고 그러나 표현형 불안정성을 설명 할 수있다. 성장 인자를 제거하면 섬유 아세포 유사 표현형으로 되돌아 간다. 표현형의 불안정성은 세포 이식에서 바람직하지 않은데, 이는 분화 및 발암의 위험이 있기 때문이다. Schwann 세포 전구체는 배아 말초 신경 8 내의 축삭 번들과 관련이 있기 때문에, 우리는 정화 배아 DRG 뉴런과 함께 공동 배양 SCLCs 7 ,ass = &quot;xref&quot;&gt; 9. 결과 성숙 Schwann 세포는 운명 - 약혼 및 시험관 기능 7 , 9 및 생체 내 10 기능을 보여 줍니다. MSCs에서 신경 progenitors의 농축에 대한 우리의 프로토콜은 간단하고 효율적이며 이후의 assays에 대한 세포 번호의 증가 결과입니다. coculture 플랫폼을 통한 운명을 결정한 Schwann 세포의 유도는 glial differentiation의 연구와 잠재적 인 임상 적용을위한 안정되고 기능적인 Schwann 세포의 생성을 가능하게합니다.

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			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:140px;">Sigmaaldrich</td>
			<td style="width:101px;">M4526</td>
			<td style="width:329px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1280/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>17504-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Basic fibroblast growth factor (bFGF)&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B/100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nerve growth factor (NGF)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heregulin beta-3, EGF domain (&#946;-Her)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>01-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Fluro-2&#39; - deoxyuridine (FDU)</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-D-lysine (PDL)</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P7886-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMAX</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin / streptomycin (P/S)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypLE Express</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 cm plate for adherent culture</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Used for selection of MSCs by tissue culture adherence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well plate for adherent culture</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>Used for expansion of MSCs following passaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UltraLow 6-well plate for non-adherent culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>Used for neural progenitor enrichment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-human CD90(Thy-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-human CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-human/rat STRO-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-human nestin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-human CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-rat CD90(Thy-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-rat CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-rat nestin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>MAB1259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-rat CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-S100&#946;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z031101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-p75</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Human nuclei</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hypoxia chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>H4034-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hypoxic preconditioning of marrow-derived progenitor cells as a source for the generation of mature schwann cells

이 원고는 골수 간질 세포 (MSC) 집단으로부터 신경 전구 세포를 풍부하게하고 나중에 성숙한 슈반 세포 운명으로 인도하는 방법을 설명합니다. 우리는 랫드 및 인간 MSC에 일과성 저산소 상태 (16 시간 동안 1 % 산소)를 투여 한 후 상피 세포 성장 인자 (EGF) / 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 보충과 함께 낮은 부착 기질에 신경근으로 확장시켰다. Neurospheres는 poly-D-lysine / laminin 코팅 조직 배양 플라스틱에 뿌리고 Schwann cell-like cells (SCLCs)를 생성하기 위해 β-Heregulin, bFGF 및 혈소판 유도 성장 인자 (PDGF)가 포함 된 gliogenic cocktail에서 배양 하였다. SCLC는 E14-15 임신 Sprague Dawley 쥐에서 얻은 정제 된 Dorsal root ganglia (DRG) 뉴런으로 2 주간 공동 배양을 통한 운명을 유도했다. 성숙한 Schwann 세포는 S100β / p75 발현에 지속성을 나타내며 미엘린 분절을 형성 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 생성 된 셀은 잠재적 인 a질병 모델링뿐만 아니라 척수 손상 후자가 세포 이식에서의 응용.

프로토콜의 핵심 단계에 대한 개요가 그림 1 에 나와 있습니다. 요약하면, 랫 및 인간 MSC는 조직 배양 플라스틱을 준수하여 선택됩니다. 확장 된 MSC는 저산소 상태로 전제 조건을 지키고 뉴로 스피어 형성 조건의 영향을받습니다. Neurospheres는 도금되어 SCLCs로 분화 할 수 있습니다. SCLC는 정제 된 DRG 뉴런과 함께 배양되어 운명의 ...

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Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

골수 내에서 골수 간질 세포 (MSC)가 존재합니다. 우리의 프로토콜은 hypoxic preconditioning을 통해 세포의 인구를 풍요롭게하고 이후 그들이 성숙한 Schwann 세포가되도록 지시합니다.

성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

hypoxic-preconditioning-marrow-derived-progenitor-cells-as-source-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.2K 조회수.  The University of Hong Kong.  골수 내에서 골수 간질 세포 (MSC)가 존재합니다. 우리의 프로토콜은 hypoxic preconditioning을 통해 세포의 인구를 풍요롭게하고 이후 그들이 성숙한 Schwann 세포가되도록 지시합니다. 

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

연구

발생학

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...