Wir danken Dr. Devin Gary für seine Einsicht und Feedback danken für die Verwendung von GFK-Zellen.

Einführung In diesem Protokoll zeigen wir, wie zu extrahieren, wählen und Glia-Platte eingeschränkten Vorläufer (GFK) Zellen aus dem Rückenmark von E13 Maus-Föten. Diese Zellen sind frühe Vorläufer innerhalb der oligodendrocytic und astrozytären Zelllinien und zeichnen sich durch ihre Expression von A2B5 definiert. In der GFK-Medium mit FGF-2 ergänzt, werden die A2B5 + GRPs beginnen Ausdruck der frühen oligodendrocytic Linie Marker PDGFαR und NG2 1,2. Diese Linie Oligodendrozyten Zellen durchlaufen eine Reihe von unterschiedlichen phänotypischen Stufen, jede von ihnen durch morphologische Veränderungen, sowie Expression von Markern für bestimmte Entwicklungsstadien gekennzeichnet. Diese Vorläuferzellen werden derzeit als potentielle Quelle für Zell-basierte Therapieansätze bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems weißen Substanz, einschließlich Multiple Sklerose, Leukodystrophien und periventrikuläre Leukomalazie (PVL) 3,4,5,6 studierte </sbis&gt;. Studien an menschlichen Gehirns abgeleitet Oligodendrozyten-Vorläufer Abstammung haben erfolgreiche Remyelinisierung im Gehirn der Maus shiverer dysmyelination Modell als auch in demyelinisierte Rückenmark Nagermodellen 6,7,8,9 berichtet. Diese glialen Vorläuferzellen wurden auch in anderen Studien Erkrankung der weißen Substanz Modelle wie Rückenmarksverletzungen und amyotrophe Lateralsklerose 10,11,12,13 verwendet. Unser Labor hat einen frühen postnatalen Hypoxie-Ischämie Mausmodell, mit denen wir zur Beurteilung der Wirksamkeit dieser Rückenmark abgeleitet GFK-Zellen als eine restaurative Ansatz in PVL, die häufigste Ursache der Zerebralparese 14,15,16 entwickelt werden. Es gibt auch ein Nagetier Gehirn stammenden OPC-Modell, das in großem Maße für das Studium der weißen Substanz Verletzungen verwendet werden, da die GFK-Zellen eine Tendenz, in die Astrozyten-Weg 17 zu differenzieren. Die OPC-Phänotyp hat bereits die Oligodendrozyten Linie Weg, ein Phänomen, das irreve scheint eingegebenenrsible. Wir sind jedoch daran interessiert, die Beurteilung der Reaktion eines breiteren Spektrums von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen einschließlich GRPs und möglicherweise sogar den NEPs bei E10.5 abgeleitet. Aus diesem Grund haben wir das Rückenmark abgeleitet GFK-Modell für unsere Arbeit angenommen. Neben der Verwendung von GFK zur Zellersatztherapie, erlaubt die Ableitung dieser Zellen von Wildtyp und transgenen Nagetier-Modellen der weißen Substanz Krankheiten weitere Studie glialen Differenzierung unter normalen oder Krankheitszuständen in einem in vitro-Einstellung. Frühere Veröffentlichungen zeigen Beweise für selektive Anfälligkeit von oligodendrocytic Abstammung Vorläuferzellen zu verschiedenen externen Stressoren wie Reifung abhängig Glutamatexzitotoxizität, oxidativer Stress, und wählen Faktoren in Neuroinflammation 18,19 verwickelt. Unsere Studien haben auf das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen hinter der Entwicklung dieser weißen Substanz Verletzungen konzentriert, die Bewertung der Anfälligkeit von Zellen inder Oligodendrozyten-Linie Spektrum zu beleidigen sowie die Analyse putative therapeutische Ansätze. Materialien Alle Verfahren, die Tiere entsprechen den PHS-Politik und der JHU IACUC. Alle Verfahren sollte in einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt werden, um sterilem Zustand zu halten. Üblicherweise Sektionen in einer horizontalen Werkbank und in vitro Arbeit in einer vertikalen Strömung Abzug durchgeführt. Alle verwendeten Medien bei Dissektionen kalt. Die Mäuse in unserer Studie verwendeten sind ein Wildtyp-CD-1-Stamm und ein transgener GFP in einem C57/BL6 Hintergrund. Eine CD-1 Maus Staudamm liefert typischerweise 10 + Föten, die genug, um Samen 1-2 T25-Flaschen sind. Typischerweise werden zwei Dämme zu einer Zeit und fetalen Rückenmark gebündelt und in ein T25-Flasche pro Muttertier überzogen geopfert. Sobald Zellen abgeleitet wurden sie erweitert werden können und dadurch in vitro für nachfolgende Studien. 1. Vorbereitung der Medien und Flaschen <ul type="disc"><li> GFK-Lager; N2 (100x; Invitrogen) Ergänzungen und Rinderserumalbumin (BSA; 0,5% w / v) DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (Invitrogen 50x): Medium wird als die Dissektion Medium verwendet. </li><li> Dissoziation Medium: wie Dissektion Medium. </li><li> Kulturmedium: GFK-Aktie mittel + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) und Heparin (1 pg / ml, Sigma). </li><li> PLL / Laminin-beschichtete 75 cm 2 oder 25 cm 2-Kolben (T75 oder T25). </li><li> In destilliertem H 2 O bei 37 ° C für 1 Stunde inkubiert und dann aspiriert; Zellkulturflaschen (75 cm 2, Falcon) mit 15-20μg/ml Poly-L-Lysin (Sigma PLL) beschichtet ist. Die Kolben werden mit PBS 1X dann mit 15-20 ug / ml Laminin (Sigma) in PBS bei 37 ° C für 1 Stunde beschichtet, dann abgesaugt und frisches PBS oder Medium zugegeben, bis die Zellen bereit zu plattierenden sind gewaschen. Nach Beschichtung, sollten Flaschen nie trocknen gelassen werden, sondern kann in PBS oder Medium bei 4 ° C aufbewahrt werden für kurze Zeit vor dem Gebrauch. </li></ul> 2. Instrumente und Other Material <ul type="disc"><li> Petrischalen: 4 pro Muttertier: 3 Petrischalen für die Dissektion (75 mm), eine 20 mm-Schale zum Auffangen der geernteten Rückenmark. </li><li> Große Schere (43 mm Betriebstemperatur Schere, Roboz) und chirurgische Pinzette zum Öffnen der Damm s Bauch. </li><li> Kleinen Schere zum Präparieren der Gebärmutter und das Entfernen der Föten (15 mm Micro Präparierschere, Roboz). </li><li> Micro Dissecting Frühjahr Schere (6 mm) zu sezieren das Rückenmark der Feten. </li><li> Micro Dissecting abgewinkelte Pinzetten für die Verankerung des Damms und fetalen Körpers während der Operation und später das Entfernen des Rückenmarks einmal ausgesetzt. </li><li> 40 oder 70 Mikrometer Zellsieb zur Entfernung von Zelltrümmern vor dem Beschichten. </li><li> 0,05% Trypsin vorgewärmt auf 37 ° C </li><li> 10 mg / ml DNAse 1 (Sigma), als 100x Stocklösung hergestellt (1 g / ml). </li><li> Bio-Hazard-Tasche für Tierkadaver. </li><li> 15 und 50 ml Zentrifugenröhrchen für die Verarbeitung extrahiert Rückenmark. </li></ul> 3. Bestimmen Timed Pregnancy Schwangere Maus Dämme sind entweder aus kommerziellen Quellen angeben Lieferung am embryonalen Tag E12 oder E13 der Entwicklung des Fötus oder der Schwangerschaft im Haus bestimmt bestellt. Kurz gesagt, werden zwei Weibchen zusammen mit einem Männchen in den späten Nachmittag gelegt und über Nacht zusammen. Am nächsten Tag die Weibchen werden auf das Vorhandensein des vaginal entfernt Schleim Plug beobachtet. Der Schleim-Stecker ist nur ein Indiz dafür, dass so Paarung Tiere werden gewogen, anschließend täglich zu Rate der Gewichtszunahme überwachen aufgetreten. Der Tag der Schleim Plug beobachtet wird, wird als embryonaler Tag eins (E1) definiert. 4. Tissue Ableitung <ol><li> Die Arbeiten im Rahmen einer horizontalen Strömung Haube zu aseptischen Bedingungen aufrecht zu erhalten. </li><li> Sprühen Sie die Haube und Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. </li><li> Autoklav Instrumente oder Spray großzügig mit 70% Ethanol. </li><li> Bereiten Sie Instrumente, Medien und Mikroskop zum Einsatz. </li><li> Gießen Sie 20 ml kaltem Dissektion Medium in sterile Petri-dish. </li><li> Tier betäuben mit Chloralhydrat (500 mg / kg) intraperitoneal (IP) durch Genickbruch oder Enthauptung folgten. </li><li> Sprühen Sie den Bauchbereich des Dammes mit 70-90% Ethanol (Desinfektion) </li><li> Öffnen Bauch mit großen Scheren und Pinzetten. <ol type="a"><li> In CD1 und C57/BL6 Stämme: In der Regel 8 bis 14 Föten wird in der Gebärmutter sein. Die Zahl der Föten ist Belastung abhängig. </li></ol></li><li> Entpacken Sie die Maus Gebärmutter einschließlich der Welpen und in frischem, kaltem Dissektion Medium in einem sauberen Petrischale, um Blut und Gewebereste von Fötus zu waschen. </li><li> Extrahieren Sie jede Fötus aus dem Uterus-Horn und trennen sie von der embryonalen SAC und der Plazenta über die kleine Schere. Übertragen Sie die extrahierten Föten an die frische Dissektion Medium in eine neue Petrischale. <ol type="a"><li> Dissection Medium sollte bei niedriger Temperatur zu senken und metabolische Aktivität zu bewahren Lebensfähigkeit der Zellen abgeleitet sein. </li><li> Arbeiten Sie ab jetzt mit zwei Zangen undMikro Sezieren Feder-Schere. </li></ol></li><li> Das Arbeiten unter Dissektionsmikroskop, schneiden Sie die Haut entlang des Rückenmarks mit den Mikro-chirurgische Scheren und schälen Haut zurück, um das Rückenmark freizulegen. </li><li> Durchschneiden die mit dem Rückenmark mikrochirurgischen Schere zu C1 und zu Beginn des Schwanzes. </li><li> Entfernen Sie das Rückenmark mit stumpfen Pinzette, sicherzustellen, dass alle Knochen und Knorpel entfernt werden und Transfer zum 3 rd Petrischale zu sezieren Medium. </li><li> Um übermäßiges Wachstum von meningealen Gewebe in den folgenden Zellkulturen zu verhindern versuchen, so viel von den Hirnhäuten wie möglich aus dem Rückenmark zu entfernen. Aufgrund der im Entstehen begriffenen überstehenden peripheren Nerven ist dies schwieriger als das Entfernen meningealen Gewebe extrahiert aus Großhirn. </li><li> Sobald Hirnhäute entfernt worden sind, übertragen Rückenmark bis 20 mm Petrischale </li><li> Clean up durch gründliches Besprühen Sie den Bereich mit 70-90% Ethanol. </li><li> Die folgenden Schritte für die Dissoziation sollte schnell erfolgen, um zu halteneine hohe Rentabilität der abgeleiteten Gewebe des Rückenmarks. </li></ol> 5. Kultur Establishment <ol><li> Trypsin sollte für mindestens 30 min in einem 37 ° CH 2 O-Bad vorgewärmt werden. Ein geeignetes Aliquot sollte aus dem Bestand entfernt werden, um die Exposition der Lager gegenüber Temperaturschwankungen zu reduzieren. </li><li> Übertragen Sie die geernteten Rückenmark zu einem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml vorgewärmter Trypsin (0,05%; Qualität Biologicals) und 100 ul DNAse (10 mg / ml) und kurz verreiben. </li><li> Inkubieren bei 37 ° CH 2 O-Bad für 10 Minuten. </li><li> Verreiben und inkubieren Sie für weitere 10 min. </li><li> 5 ml Medium GFK (oben definiert) und Zentrifuge für 5 min bei 1000 RPM. </li><li> Absaugen des Überstandes und Pellet erneut mit 10 ml Medium GFK und fügen DNAse-1 (10 mg / ml, Sigma). </li><li> Inkubieren bei 37 ° CH 2 O-Bad für 10 Minuten. </li><li> Zentrifugieren 5 min bei 1000 RPM und Absaugen des Überstandes. </li><li> Pellet mit fresh GFK-Medium dann Filter Trümmer mit einem 40 - 70 um Zellsieb. </li><li> Plate auf PLL / Laminin beschichtete 25 cm 2-Kolben (T25) und Inkubation bei 37 ° C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2. </li><li> 100% ändern Medien auf folgenden Tages. </li><li> An dieser Stelle haben GRPs befestigt und begann sich Prozesse. </li></ol> 6. Immunopanning die GFK Bevölkerung <ol><li> Platte Rückenmark in PLL / Laminin beschichtete Kolben, bis Kolben ist 85-90% konfluent oder etwa eine Woche. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Abschaben Kolben mit einem Gummi-oder Polizist mit 0,05% Trypsin, gründlich, aber sanft verreiben, bei 1000 rpm für 5 min und gründlich Pellet mit 3 ml Medium GFK zentrifugieren. </li><li> Übertragen Sie jeweils 1 ml bis 3 T25-Flaschen oder 3 ml bis 1 T75-Flasche hinzu entsprechende Volumen des Mediums vollständig zu bedecken Zellen und ermöglichen Flaschen auf 80-90% Konfluenz erreichen. </li><li> Ändern Medien jeden zweiten Tag, früher, wenn Medium erschöpft schnell. </li><li> Coat Bakteriologische PeTri Gerichte (75 mm) über Nacht bei 4 ° C mit einem Anti-Maus-IgM-Antikörper (Southern Biotech), 10 pg / ml in PBS. </li><li> Absaugen des überschüssigen Puffer und waschen Sie die Petrischalen 3x mit PBS. </li><li> In A2B5-Antikörper (Millipore) bei einer Konzentration von 5 mg / ml in PBS und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur (RT) verdünnt. </li><li> Waschen Sie Platten erneut 3x mit PBS fügen Sie dann 8 ml GFK Medium zu verhindern Austrocknen der Platte. </li><li> Übertragen Sie 5 ml Medium aus GFK Petrischalen und Ernte GFK-Zellen durch Abschaben Kolben mit einem Gummi-Polizist, um alle Zellen zu lösen </li><li> Man reibt Zellsuspension kurz zu brechen Klumpen und übertragen 5ml Zellsuspension zu den A2B5 beschichteten bakteriologischen Petrischalen. </li><li> Inkubieren 1 Stunde bei Raumtemperatur ohne Schütteln. </li><li> Nach 1 Stunde absaugen Medien und Wäsche Platte 8x mit PBS. </li><li> Vorsichtig kratzen Zellen mit einem Gummiwischer in 2 ml GFK Medien dann auf PLL / Laminin beschichteten Platten oder Kolben übertragen mit entsprechenden Volumen von GFK-Medium. </li&gt; </ol> 7. Einfrieren und Lagern von abgeleiteten Zellen <ol><li> Die Zellen werden aus einer 85-90% konfluent T25 oder T75-Kolben mit 2 ml 0,05% Trypsin geerntet. </li><li> Trypsin wird verdünnt und mit 8 ml GFK Lager Medium inaktiviert und zentrifugiert bei 1000 UpM für 5 min. </li><li> Pellets aus T25-Flaschen werden in 1 ml GFK Einfriermedium, (GFK Lager-Medium mit 10% (v / v) DMSO und gegebenenfalls, 20% FBS), resuspendiert. Die größeren Pellets aus T75-Flaschen werden verdünnt zweifach. </li><li> Zellsuspensionen von 1,5 - 3 × 10 10,11,12,13 Zellen werden Kryoröhrchen (Nalgene) überführt und über Nacht in einem kryogenen Behälter (Nalgene), das Isopropanol bei -80 ° C bis langsam einfrieren über Nacht gelagert. </li><li> Nach über Nacht Einfrieren Zellen werden zu Tiefkühlboxen übertragen und dort gespeichert 6 Monate bis 1 Jahr bei -80 ° C oder längerfristig in N (l). Aufgetauten Zellen sind typischerweise 60-80% lebensfähig ist weitgehend abhängig von der Qualität des PLL / Laminin beschichtet. </li></ol&gt; 8. Repräsentative Ergebnisse CO 2 ist nicht für die Betäubung des Tieres wegen der möglichen nachgelagerten Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Föten und letztlich der abgeleiteten Zellen verwendet. Darüber hinaus wird es sehr schwierig sein, völlig entfernen Sie die Meningen aus dem Rückenmark bei der Ableitung Prozedur aber die Kombination von GfK mittel-und Immunopanning wird diese schnell wachsende Zellen zu eliminieren. In ähnlicher Weise wird die gesamte Wirbelsäule trotz einer größeren Konzentration des ventralen GFK Bevölkerung aufgrund seiner Ursprung in der ventralen Rückenmark und Migration dorsal 20 geerntet. Aber das GFK-Medium wählt für die GFK-Phänotyp und dass die Bevölkerung wird durch A2B5 Immunopanning maximiert. Nach dem Ausplattieren Rückenmarkgewebes, werden die in vitro-Kulturen für zwei Kanäle oder über eine Woche inkubiert. Nach 2 Tagen in Kultur, kann Zellen unterschiedlicher Morphologien in den Gewebekulturflaschen Angabe der Heteroatome beachtenHomogenität der Bevölkerung, sondern der GFK Medium wählt für die GFK-Phänotyp. Diese Zellen sind eine Kombination von A2B5 + GFK, E-NCAM + neuronalen eingeschränkten Vorstufen (NRP) und Nestin +, A2B5-Neuroepithelzellen und möglicherweise Fibronectin + meningealen Zellen. Darüber hinaus reiferen Phänotypen vorliegen können auszudrücken Marker einschließlich Doublecortin und Tuj1 für die neuronale Linie, GFAP für Astrozyten und PDGFaR und GalC für Oligo-Linie Um eine hoch angereicherte GFK Bevölkerung aus dem Ausgangsmaterial heterogener Pool (Abbildung 1A) zu maximieren, können Zellen sein Doppel-immunopanned zu wählen und die Beseitigung der E-NCAM +-Zellen durch Selektion auf dem A2B5 gefolgt + GFK Bevölkerung einmal Zelldichte zu etwa 85-90% Konfluenz in T75-Flaschen erhöht hat. Diese GFK Zellen ihre Fähigkeit, Astrozyten werden, obwohl er in einem Medium, das für die Oligodendrozyten Phänotyp selektiert so dass nachfolgende A2B5 Immunopanning kann notwendig sein, eine hoch angereichertes GFK Bevölkerung zu erhalten. Immunopanning GenerVerbündeter Ausbeuten von bis zu 95% A2B5 +-Zellen, jedoch für eine noch größere Ausbeute A2B5 konjugierten magnetische Kügelchen (Miltenyi Biotec GmbH) verwendet werden, um eine Ausbeute von bis zu 97% bereitzustellen. Wachsamkeit bei der Wartung GRP Kulturen wie zum Beispiel regelmäßige Medien-Änderungen werden minimiert die Verbreitung von nicht-GFK Zelltypen. Selbst in Abwesenheit von BMP-4 Astrozyten noch gefunden und erschöpft Medien Insbesondere scheint Differenzierung zu Astrozyten Phänotyp zu induzieren. Obwohl die B27 Ergänzung enthält Triiodthyronin Hormon (T3), gab es keine beobachteten Tendenz, in Oligodendrozyten im GFK Bevölkerung zu unterscheiden, nur dann, wenn höhere Konzentrationen von T3 zu dem Medium zugegeben dieses Phänomen auftritt. Jedoch kann ein T3 freien B27 Ergänzung substituiert, wenn es ein Problem für Kontamination durch reife Oligodendrozyten (1B) werden. Diese GFK-Zellen können leicht durch ihre Morphologie der kleinen Soma mit 2 oder 3 kurze Prozesse, sondern auf dem Bildschirm für andere Zelltypen, die vorhanden sein können, im identifiziert werdenmunocytochemistry kann zu dem zuvor benannten gemeinsamen Entwicklungs-und Zelltyp-spezifische Marker durchgeführt werden. Es wird üblicherweise eine kleine Population von persistenten A2B5-Zellen, die neuro-(NEP) und in der Lage zu entweder GFK oder NRP sind. Glücklicherweise sind die Zellen länger in der GFK-Medium, desto wahrscheinlicher, dass Medium wird für die GFK-Phänotyp wählen gepflegt. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" /> Abbildung 1. A) Plated Rückenmark Zellen der heterogenen Morphologie sind nach 2 Tagen in Kultur beobachtet. B) Immunopanning eine hoch angereicherte GFK Bevölkerung maximiert vom Ausgangspunkt heterogenen Pool.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-permeable+AMPA/kainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors.">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li><li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia.">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li><li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+white+matter:+clinical+and+pathophysiological+aspects.">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li><li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripotential+glial-restricted+precursor+(GRP)+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord:+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function.">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li><li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord.">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li><li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins.">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li><li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li><li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter.">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li><li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li></ol>

Diese Studie wurde vom National Institute of Health [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), und R01NS028208 (MVJ)] und der Kinderneurologie Foundation finanziert. Der Inhalt dieses Berichts sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute of Health, DHHS. Die Autoren haben keine Interessenkonflikte relevant zu dieser Studie.

<p class="jove_content"&gt; Erkrankungen des zentralen Nervensystems weißen Substanz enthalten eine große Anzahl von Ursachen, darunter genetische, entzündliche, ischämische und toxische Ursachen<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Während Multiple Sklerose und Gefäßerkrankungen die häufigste Ursache für Erkrankung der weißen Substanz bei Erwachsenen sind, ist periventrikuläre Leukomalazie mit Frühgeburt verbundenen die häufigste Ursache von Verletzungen der weißen Substanz in der Kindheit Bevölkerung. Um weiter abzugrenzen Krankheitsmechanismen weitere Studie von Zellen ofoligodendrocytic Linie, die stark durch die perinatale Beleidigung betroffen sind, ist nicht erforderlich. GFK wurden aus dem Nagetier embryonalen Rückenmark isoliert und gezeigt, dass tripotential in der Natur, was zu Oligodendrozyten und Astrozyten zwei verschiedene Populationen, aber nicht in Neuronen differenzieren<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. Ebenso sind die Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) aus Ratte Sehnerv und späten embryonalen und frühen postnatalen Rattenhirn abgeleitet nachgewiesen, dass sie in funktionierende Oligodendrozyten in den entsprechenden Medien Bedingungen reifen<sup&gt; 27,28</sup&gt;. Zusätzlich haben fetalen oder adulten menschlichen OPC abgeleitet wurde weiter in reiferen Oligodendrozyten-Phänotypen manipuliert<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; GFK-Zellen haben sowohl das Rückenmark von E13.5 Ratten und E12-13.5 in Mäusen isoliert worden. In den Ratten Unterschiede zwischen dorsal-und ventral-abgeleiteten Zellen GFK wurde in ihrer Reaktion auf Bedingungen, die Generierung von Oligodendrozyten, Astrozyten oder mit ventral-derived GRPs zeigt eine größere Neigung, in den reiferen Phänotypen differenzieren fördern berichtet<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. Dies ist möglicherweise auf die ventral nach dorsal Migration der entstehenden GFK-Zellen, die weniger empfänglich für die Differenzierung Signale könnten. Immunopanning ermöglicht die Subpopulation, die A2B5 Ausdruck zu isoliert und gesammelt werden für die Wartung in der Kultur.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Unsere Maus GFK Kulturen wurden, werden vom Gewebe des Rückenmarks, die eine heterogene, Gesamtgruppe von Zellen, aus denen Zellen durch chemische GFK (mittel) und auf Antikörpern basierende Techniken ausgewählt werden ergibt abgeleitet. Während unsere Untersuchungen des Rückenmarks abgeleitet Maus GFK-Zellen genutzt haben, hat es in jüngerer Zeit wurde die Ableitung des Gehirns abgeleitet Maus Oligodendrozyten-Progenitorzellen, die auch fähig sind, die Entwicklung zu reifen Oligodendrozyten berichtet<sup&gt; 31</sup&gt;. Hier werden die abgeleiteten Zellen werden zunächst als oligospheres, dass unter Verwendung des geeigneten Kulturmedium in eine angereicherte PDGFαR +, OPC Bevölkerung manipuliert kultiviert<sup&gt; 31</sup&gt;. Unsere Studien haben auf die Wirkung von unserem Modell der hypoxisch-ischämischen Insult auf Zellen in der Oligodendrozyten-Linie Spektrum von A2B5 +, PDGFαR GFK-Vorstufen zu der Myelin basisches Protein exprimieren (MBP +) reifen Oligodendrozyten konzentriert. In der Tat unsere<em&gt; In-vitro-</em&gt; Charakterisierung hat gezeigt, dieser unreifen Zellen reifen zu GFK-MBP exprimierende Zellen entweder in Monokulturen oder in Co-Kulturen mit kortikalen Neuronen. Diese Zellen können in Kultur in spezifische Differenzierung Wege für die Erforschung der Mechanismen in der weißen Substanz perinatalen Verletzungen beteiligt manipuliert werden. Es gibt mehrere Mausmodelle von Erkrankungen der weißen Substanz mit Zellen der Oligodendrozyten-Linie und der Verfügbarkeit dieser Population ermöglicht gründliche Untersuchung der Mechanismen, die Verletzungen als auch um den Nutzen von möglichen Zelltherapie Möglichkeiten zu erkunden, zu verursachen.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> DMEM / F12 1.01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> rH-FGF-basic </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Trypsin (0,05%) EDTA </td><td> Quality Biological, Inc. </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25mg </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma </td><td> L2020-1MG </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

derivation of glial restricted precursors from e13 mice

Dies ist ein Protokoll für die Ableitung von Gliazellen eingeschränkten Vorläufer (GFK) Zellen aus dem Rückenmark von E13 Maus-Föten. Diese Zellen sind in der frühen Vorläufer oligodendrocytic Zelllinie. In jüngster Zeit wurden diese Zellen als potentielle Quelle für die restaurative Therapien in der weißen Substanz Krankheiten untersucht worden. Periventrikuläre Leukomalazie (PVL) ist die führende Ursache für nicht-genetische Erkrankung der weißen Substanz in der Kindheit und betrifft bis zu 50% der extrem unreifen Frühgeborenen. Die Daten deuten auf eine erhöhte Anfälligkeit des sich entwickelnden Gehirns zu Hypoxie-Ischämie, oxidativen Stress und Exzitotoxizität, der selektiv auf entstehende weiße Substanz. Glial eingeschränkten Vorläufer (GFK), Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) und unreifen Oligodendrozyten (preOL) scheinen wichtige Akteure bei der Entwicklung von PVL sein und sind Gegenstand weiterer Untersuchungen. Darüber hinaus haben jüngste Untersuchungen eine Teilmenge von ZNS-Gewebe, die Empfindlichkeit erhöht hat, um Exzitotoxizität als Glutamat identifiziertsowie ein Entwicklungsmuster zu dieser Anfälligkeit. Unser Labor untersucht derzeit die Rolle der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen in PVL und Nutzung Zellen an der GFK-Stadium der Entwicklung. Wir verwenden diese abgeleitet GFK-Zellen in verschiedenen experimentellen Paradigmen, um ihre Reaktion auf Belastungen im Einklang mit PVL wählen zu testen. GFK-Zellen können in vitro in OPCs und preOL werden für die Transplantation Experimenten mit Maus PVL-Modelle und in vitro-Modelle von PVL-ähnliche Beleidigungen einschließlich Hypoxie-Ischämie manipuliert. Durch die Verwendung von kultivierten Zellen und in vitro Studien gäbe Variabilität zwischen Experimenten, die Interpretation der Daten erleichtert reduziert werden. Kultivierte Zellen ermöglicht auch für die Anreicherung des GRP Bevölkerung bei gleichzeitiger Minimierung der Auswirkungen von kontaminierenden Zellen von nicht-GFK-Phänotyp.

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Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Dieses Protokoll beschreibt die Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus fötalem Rückenmark und gehalten in vitro entweder für die Transplantation oder für die Untersuchung von oligodendrocytic Linie.

Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

derivation-of-glial-restricted-precursors-from-e13-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Aufrufe.  Johns Hopkins University. Dieses Protokoll beschreibt die Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus fötalem Rückenmark und gehalten in vitro entweder für die Transplantation oder für die Untersuchung von oligodendrocytic Linie.

Serie: Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Forschung

Neurowissenschaften

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Ableitung von Leptomeningen Explantation Kulturen von Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

Kanüle Implantation in die Cisterna Magna von Nagetieren

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

Aufzeichnung von räumlich eingeschränkt Schwingungen im Hippocampus Verhalten der Mäuse

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...