Die Forschung wird unterstützt durch die Tier-2-Förderung durch das Ministerium für Bildung in Singapur (ARC2 / 15: M4020238) und der Singapur Ministerium für Gesundheit National Medical Research Council (NMRC / OFIRG / 0005/2016: M4062012) gefördert. Die Autoren danken Herrn Chow Wai Hoong Bobby für den Maschinenladen helfen.

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Nanyang Technological University, Singapur (Tierprotokoll Nr. ARF-SBS / NIE-A0263) genehmigt wurden. 1. Systembeschreibung <ol><li> Montieren Sie die PLD in den kreisförmigen Scanner, wie in Abbildung 1a gezeigt . Verbinden Sie die PLD mit der Lasertreibereinheit (LDU). HINWEIS: Die PLD liefert ~ 136-ns-Impulse bei einer Wellenlänge von ~ 803 nm mit einer maximalen Pulsenergie von ~ 1,42 mJ und einer Wiederholrate bis zu 7 kHz. Die Laserantriebseinheit (LDU) umfasst: einen Temperaturregler, eine variable Stromversorgung, eine Stromversorgung (12 V) und einen Funktionsgenerator; Siehe die Tabelle der Materialien. Die variable Stromversorgung dient zur Steuerung der Laserleistung und der Funktionsgenerator dient zur Änderung der Wiederholrate der PLD. </li><li> Schalte den PLD-Laser ein. Setzen Sie die PLD-Wiederholrate auf &quot;7.000&quot; HZ mit dem Funktionsgenerator in der LDU. Erhöhen Sie die Pulsenergie auf 1,42 mJ, indem Sie die Spannung der variablen Stromversorgung auf &quot;3.1&quot; V einstellen. </li><li> Montieren Sie den optischen Diffusor (OD) vor dem PLD-Austrittsfenster, um den Ausgangsstrahl homogen zu machen, wie in Abbildung 1a gezeigt . HINWEIS: Verwenden Sie einen Diffusor mit einem feinen Korn ( dh 1,500-Korn-Polnisch). </li><li> Montieren Sie das fokussierte UST auf dem UST-Halter, so dass es dem Zentrum des Scanbereichs zugewandt ist, wie in Abbildung 1a gezeigt . HINWEIS: Die Mittenfrequenz des UST beträgt 2,25 MHz und die Brennweite beträgt 1,9 Zoll. </li><li> Legen Sie den Ultraschall-Detektor in den Acryl-Tank, wie in Abbildung 1a gezeigt . Füllen Sie den Tank mit Wasser, so dass die UST ist völlig eingetaucht. HINWEIS: Ein Wassermedium wird verwendet, um das photoakustische Signal vom Gehirn (Probe) an das UST zu koppeln. Ein Acryl-Wasser-Tank (WT, siehe die Tabelle der Materialien) war benutzerdefiniert-designed für kleine Tier-Bildgebung. Der Schaltplan des Wassertankentwurfs ist in Abbildung 1b dargestellt . </li><li> Überprüfen Sie das PA-Signal aus der Probe mit einer Pulser / Empfänger-Einheit (PRU, siehe Tabelle der Materialien ). HINWEIS: Diese Signale wurden durch eine 12-Bit-DAQ-Karte (siehe Tabelle der Materialien ) mit einer 100 MS / s-Abtastrate digitalisiert und auf einem Computer gespeichert. </li></ol> 2. Tiervorbereitung für Rattenhirnbildgebung HINWEIS: Das oben beschriebene PLD-PAT-System wurde für die Bildgebung von kleinen Tierhirn demonstriert. Für diese Experimente wurden gesunde weibliche Ratten (siehe Tabelle der Materialien ) verwendet. <ol><li> Anästhesieren des Tieres durch intraperitoneale Injektion eines Cocktails aus 2 ml Ketamin, 1 ml Xylazin und 1 ml Kochsalzlösung (Dosierung von 0,2 ml / 100 g). </li><li> Entfernen Sie das Fell auf der Kopfhaut des Tieres mit einem Haarschneider. Tragen Sie sanft Haare Entfernung Creme auf die rasierteBereich zur weiteren Erschöpfung des Fells <ol><li> Entfernen Sie die aufgetragene Creme nach 4-5 min mit einem Wattestäbchen. </li><li> Tragen Sie künstliche Tränensalbe auf die Augen des Tieres, um die Trockenheit durch Anästhesie und Laserbeleuchtung zu verhindern. </li></ol></li><li> Montieren Sie den maßgeschneiderten Tierhalter (siehe die Tabelle der Materialien ), der mit einer Atemmaske (siehe Tabelle der Materialien ) auf einer Laborbuchse ausgestattet ist. </li><li> Legen Sie das Tier in die anfällige Position auf den Halter. Sichern Sie es mit dem chirurgischen Band an den Halter, um eine Bewegung des Tieres während der Bildgebung zu vermeiden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Atemmaske die Nase und den Mund der Ratte bedeckt, um inhalierte Anästhesie zu liefern. </li></ol> 3. In vivo Ratte Brain Imaging <ol><li> Verbinden Sie die Atemmaske mit der Narkosemaschine. Schalten Sie die Anästhesie-Maschine ein und stellen Sie sie ein, um 1,0 l / min Sauerstoff mit 0,75% Isofluran zu liefern. <ol><li> Klemmen Sie das Pulsoximeter dazuS Schwanz zur Überwachung der physiologischen Zustand des Tieres. </li></ol></li><li> Tragen Sie eine Schicht aus farblosem Ultraschallgel auf die Kopfhaut der Ratte auf. Stellen Sie die Position des Labors in die Mitte des Scanners ein. Die Atemmaske ist auf das Bildgebungsfenster abgestimmt. 10% des handelsüblichen Nasenkonus geschnitten und dann mit einem Handschuh verbunden. <ol><li> Stellen Sie die Höhe der Laborbuchse manuell ein, so dass die Abbildungsebene im Fokus des UST steht. </li></ol></li><li> Setzen Sie die Parameter in der Datenerfassungssoftware (siehe Tabelle der Materialien) nach Bedarf ein. Führen Sie das Datenerfassungs-Softwareprogramm aus, um die Erfassung zu starten ( dh die Bildgebung). HINWEIS: Das Programm wird verwendet, um die UST zu drehen und A-line PA-Signale zu sammeln. Die gesammelten A-Linien werden auf dem Computer gespeichert. </li><li> Beobachten Sie das Tier während der gesamten Bildgebung und fahren Sie mit der PAT-Rekonstruktion fort, nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist. </li><li> Nachdem die Datenerfassung vorbei ist,Rekonstruieren Sie das Querschnitts-Hirnbild von den A-Linien mit dem Rekonstruktionssoftware-Programm. </li><li> Schalten Sie das Anästhesiesystem aus, entfernen Sie das Tier von der Bühne, bringen Sie es in den Käfig zurück und überwachen Sie es, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. HINWEIS: Wenn zum Beispiel der UST für 5 s gedreht wird, liefert der PLD 35.000 (= 5 x 7.000) Impulse und der UST sammelt 35.000 A-Linien. Die 35.000 A-Linien werden durch Mittelwertbildung über 70 Signale auf 500 reduziert (nach Mittelung von A-Linien = 35.000 / 70 = 500). Abbildung 1c zeigt die Beleuchtung der Laserpulse und der A-Zeilen-Sammlung. Es sollte ein Rekonstruktionsprogramm verwendet werden, das auf dem Verzögerungs-und-Summen-Rückprojektionsalgorithmus basiert. </li></ol><img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55811/55811fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematik des PLD-PAT-Systems. ( A ) Schema des PLD-PAT. PLD: gepulste Laserdiode, CSP: circuLDU: Lasertreiber-Einheit, PRU: Pulser / Empfänger-Einheit, UST: Ultraschall-Messumformer, WT: Wassertank, PF: Polymerfolie und DAQ: Datenerfassungskarte. ( B ) Schematik des Wassertanks, Draufsicht (1) und Querschnittsansicht (2) für in vivo kleine Tierhirnbildgebung. A: metrisch Schraube, B: Acryl Ringplatte, C: Silikon &quot;O&quot; Ring, D: 100 μm dicke, transparente Polyethylenabdeckung. Der Tank hatte an seinem Boden ein Loch von 9 cm Durchmesser und wurde mit einer ultraschall- und optisch transparenten 100 μm dicken Polyethylenmembran versiegelt. ( C ) Schema der Beleuchtung von Laserpulsen aus der PLD und A-Linie, Sammlung in einer 5 s kontinuierlichen Scan-Zeit. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55811/55811fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Die Autoren haben keine relevanten finanziellen Interessen im Manuskript und keine anderen potenziellen Interessenkonflikte zu offenbaren.

Diese Arbeit stellt ein Protokoll für die Durchführung in vivo Gehirn-Bildgebung auf Ratten mit einem PLD-PAT-System. Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung des Bildgebungssystems und dessen Ausrichtung sowie eine Darstellung der Gehirnabbildung an Ratten. Die vorhandenen OPO-basierten PAT-Systeme sind teuer und sperrig und können in 5-10 min ein Querschnittsbild liefern. Das PLD-PAT-System ist kompakt, portabel und kostengünstig und kann in 3 s qualitativ hochwertige Bilder liefern. Die Leis...

<html> Photoakustische Tomographie (PAT) ist eine hybride bildgebende Methode, die sowohl in der klinischen als auch in der präklinischen Studie 1 , 2 , 3 , 4 , 5 viele Anwendungen hat. In PAT bestrahlen Nanosekunden-Laserpulse biologisches Gewebe. Die Absorption von einfallendem Licht durch die Gewebe-Chromophore führt zu einem lokalen Temperaturanstieg, der dann Druckwellen ergibt, die in Form von Schallwellen emittiert werden. Ein Ultraschalldetektor sammelt die photoakustischen Signale an verschiedenen Positionen um die Probe herum. Die photoakustischen (PA) Signale werden unter Verwendung verschiedener Algorithmen (wie z. B. eines Verzögerungs- und Summenalgorithmus) 6 rekonstruiert, um das photoakustische Bild zu erzeugen. Diese Hybrid-Bildgebungsmodalität bietet eine hochauflösende, tiefgewebte Bildgebung und einen hohen optischen Absorptionskontrast 7 ,Class = &quot;xref&quot;&gt; 8 Vor kurzem wurde in Hühnerbrustgewebe mit Hilfe einer längeren Wellenlänge (~ 1.064 nm) und einem exogenen Kontrastmittel, Phosphorphthalocyanin genannt, eine ~ 12-cm-Bildtiefe 9 erreicht. Diese Tiefenempfindlichkeit ist viel höher als die Tiefenempfindlichkeit anderer optischer Methoden wie konfokale Fluoreszenzmikroskopie, Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie, 10 optische Kohärenztomographie, 11 etc. Mit mehr als einer Wellenlänge kann PAT strukturelle und funktionelle Veränderungen in den Organen nachweisen . Für viele menschliche Krankheiten sind Kleintiermodelle gut etabliert 12 , 13 , 14 , 15 . Für die Bildgebung von kleinen Tieren wurden mehrere Modalitäten nachgewiesen. Aus all diesen Ansätzen hat sich die PA-Bildgebung aufgrund der oben genannten Vorteile sehr schnell bemerkbar gemacht. PAT hat sein Potenzial für die Bildgebung von Blutgefäßen in den Geweben und Organen ( dh Herz, Lunge, Leber, Augen, Milz, Gehirn, Haut, Rückenmark, Niere usw. ) von kleinen Tieren 4 , 16 , 17 , 18 gezeigt . PAT ist eine etablierte Modalität für kleine Tier-Gehirn-Bildgebung. PA-Wellen werden aufgrund der Lichtabsorption durch die Chromophore erzeugt, so dass die Mehrfachwellenlänge PAT die Abbildung der Gesamt-Hämoglobinkonzentration (HbT) und der Sauerstoffsättigung (SO 2 ) 19 , 20 , 21 , 22 ermöglicht . Die Hirnneurovaskuläre Bildgebung wurde mit Hilfe exogener Kontrastmittel 12 , 23 , 24 erreicht . PA-Modalität kann dazu beitragen, ein besseres Verständnis der Gehirn Gesundheit durchBereitstellung von Informationen auf molekularer und genetischer Ebene. Für die Kleintier-Bildgebung werden Nd: YAG / OPO-Laser weithin als PAT-Anregungsquellen verwendet. Diese Laser liefern ~ 5 ns Nah-Infrarot-Impulse mit Energie (~ 100 mJ am OPO-Ausgangsfenster) bei einer ~ 10-Hz-Wiederholrate 25 . Das mit solchen Lasern ausgestattete PA-System ist kostspielig und sperrig und ermöglicht aufgrund der geringen Wiederholrate der Laserquelle eine Low-Speed-Bildgebung mit Einzelelement-Ultraschallwandlern (UST). Eine typische A-line-Erfassungszeit in solchen PA-Systemen beträgt ~ 5 min pro Querschnitt 25 . Ein Abbildungssystem mit einer so langen Messzeit ist für die Kleintier-Bildgebung nicht ideal, da es schwierig ist, die physiologischen Parameter für die Ganzkörper-Bildgebung, die zeitaufgelöste Funktionsabbildung usw. zu kontrollieren . Durch die Einführung mehrerer Einzelelement-USTs, Array -basierte USTs oder ein Laser mit hoher Wiederholrate, ist es möglich, die Abbildungsgeschwindigkeit von PA zu erhöhenSysteme Mit nur einem Einzelelement UST, um alle PA-Signale um die Probe zu sammeln, wird die Abbildungsgeschwindigkeit des Systems begrenzt. Mehrere Einzelelement-USTs, die in kreisförmiger oder halbkreisförmiger Geometrie angeordnet sind, werden für hochgeschwindigkeits-hochempfindliche bildgebende Verfahren demonstriert. Array-basierte USTs 26 , wie lineare, halbkreisförmige, kreisförmige und volumetrische Arrays, wurden erfolgreich für die Echtzeit-Bildgebung verwendet 1 . Diese Array-basierten USTs erhöhen die Abbildungsgeschwindigkeit und reduzieren die Messempfindlichkeit, aber sie sind teuer. Jedoch ist die Abbildungsgeschwindigkeit von PA-Systemen, die Array-basierte USTs verwenden, immer noch durch die Wiederholungsrate des Lasers begrenzt. Die gepulste Lasertechnologie wurde entwickelt, um hochauflösende gepulste Laserdioden (PLDs) herzustellen. 7.000 Frames / s B-scan photoacoustic Imaging wurde mit PLDs mit einer klinischen Ultraschallplattform 27 demonstriert. Solche PLDs können die Abbildungsgeschwindigkeit von th verbessernE PAT-System, auch mit Single-Element UST kreisförmigen Scan-Geometrie. Single-Element USTs sind weniger teuer und hochempfindlich, im Gegensatz zu Array-basierten USTs. Im Laufe des letzten Jahrzehnts wurde wenig Forschung über die Verwendung von hochauflösenden PLDs als Anregungsquelle für die PA-Bildgebung berichtet. Für die PA-Abbildung von Phantomen 28 wurde eine faserbasierte Nah-Infrarot-PLD nachgewiesen. Die in vivo- Bildgebung von Blutgefäßen in einer Tiefe von 1 mm unterhalb der menschlichen Haut wurde mit Niedrigenergie-PLDs 29 demonstriert. Es wurde ein PLD-basiertes optisches Auflösungs-Fotoakustikmikroskop (ORPAM) berichtet. Mit PLDs wurde eine 1,5 cm tiefe Bildgebung mit einer Bildrate von 0,43 Hz nachgewiesen. Vor kurzem wurde ein PLD-PAT-System berichtet, das Bilder in so kurz wie ~ 3 s und bei einer ~ 2 cm Bildtiefe im biologischen Gewebe 25 , 31 lieferte. Diese Studie zeigte, dass solch ein kostengünstiges, kompaktes System High-Qua liefern kannLity Bilder, auch bei hohen Geschwindigkeiten. Das PLD-PAT-System kann für hochauflösende (7000 fps) photoakustische Bildgebung, Surf-Blutgefäß-Bildgebung, Fingergelenk-Bildgebung, 2 cm tiefe Gewebe-Bildgebung, Klein-Tier-Gehirn-Bildgebung, etc. verwendet werden. Die Ein-Wellenlänge und Tiefpuls-Energie-Impulse von PLD begrenzen ihre Anwendung auf Multispektral- und Tiefgewebe-Bildgebung. Experimente wurden an kleinen Tieren mit demselben PLD-PAT-System durchgeführt, das für präklinische Anwendungen verwendet wurde. Der Zweck dieser Arbeit ist es, die visualisierte experimentelle Demonstration des PLD-PAT-Systems für die in vivo- 2D-Querschnitts-Gehirn-Bildgebung von kleinen Tieren bereitzustellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1212">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Pulsed laser diode</td>
			<td style="width:195px;">Quantel, France</td>
			<td style="width:327px;">QD-Q1910-SA-TEC</td>
			<td style="width:449px;">It is the excitation laser source with specifications 803 nm, 1.4mJ per pulse, 136 ns pulse, 7kHz maximum, dimentions : 11.0 x 6.0 x 3.6 cm, weight: ~150 gm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stepper motor with gearbox</td>
			<td style="width:195px;">LIN Engineering (Servo Dynamics)</td>
			<td style="width:327px;">Motor: CO-5718-01P, Gearbox: DPL64/1, I = 10 for NEMA 23; power supply PW100-48</td>
			<td style="width:449px;">To move the detector holder in a circular geometry. Torque: 2.08 N-m, Rotor inertia: 2.6 kg-cm2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ultrasonic pulser/receiver</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5072PR</td>
			<td style="width:449px;">To receive, filter and ampligy the PA signal from UST. Its bandwidth is 35MHz, and gain is &#177;59 dB.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ultrasound Transducer</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>V306-SU-NK-CF1.9IN/Q4200069</td>
			<td style="width:449px;">Ultrasonic sensors used for photoacoustic detection. Central freqency 2.25 MHz, 0.5 in, Cylindrical focus 1.9 inch</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCIe DAQ (Data acquisition) Card</td>
			<td>GaGe</td>
			<td>CSE4227/ A6000610/B0E00610</td>
			<td style="width:449px;">12 bit, 100 Ms/s, 2 channels, 1 Gs on board memory, PCIe x16 interface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Rats</td>
			<td>In Vivos Pte Ltd, Singapore</td>
			<td style="width:327px;">NTac:SD, Sprague Dawley / SD</td>
			<td>Female, weight 100&#177;10g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Acrylic water tank </td>
			<td style="width:195px;">NTU workshop</td>
			<td style="width:327px;">Custom-made</td>
			<td style="width:449px;">It contains the water that acts as an acoustic coupling medium between brain and detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Circular Scanner </td>
			<td style="width:195px;">NTU workshop</td>
			<td style="width:327px;">Custom-made</td>
			<td>Scanner is made out of Alluminum </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Anesthetic Machine</td>
			<td>medical plus pte ltd</td>
			<td style="width:327px;">Non-Rebreathing Anaesthesia machine with oxygen concentrator.</td>
			<td>Supplies oxygen and isoflurane to animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Pulse Oxymeter portable</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td style="width:327px;">PM10N with veterinary sensor</td>
			<td>Monitors the pulse oxymetry of the animal</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:195px;">Progress/parker acquasonic gel</td>
			<td>PA-GEL-CLEA-5000</td>
			<td>Clear ultrasound gel</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Data acqusison software</td>
			<td style="width:195px;">National Instruments Corporation,Austin,TX,USA)</td>
			<td style="width:327px;">NI LabVIEW 2015 SP1</td>
			<td style="width:449px;">LabVIEW based program was developed in our laboratory for controlling the stepper motor and acquring the PA singnals from the detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Data processing software</td>
			<td style="width:195px;">Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA)</td>
			<td style="width:327px;">Matlab R2012b</td>
			<td style="width:449px;">Matlab code for reconstruction of PA images was developed in our lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Temperature controller </td>
			<td>LaridTech, MO,USA</td>
			<td>MTTC1410</td>
			<td>It will constantly control temperature of the PLD </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 V power supply </td>
			<td>Voltcraft </td>
			<td style="width:327px;">PPS-11810</td>
			<td>To supply operating voltage for PLD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Variable power supply </td>
			<td>BASETech</td>
			<td>BT-153</td>
			<td>To change the laser output power</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Funtion generator </td>
			<td style="width:195px;">Funktionsgenerator</td>
			<td>FG250D</td>
			<td style="width:449px;">To change the repetetion rate of the PLD. It will provide TTL signal to synchronize the DAQ with the laser excitation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Animal distributor</td>
			<td style="width:195px;">In Vivos Pte Ltd, Singapore</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Animal distributor that supplies small animals for research purpose.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Animal holder</td>
			<td style="width:195px;">NTU workshop</td>
			<td style="width:327px;">Custom-made</td>
			<td>Used for holding the animal on its abdomen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Breathing mask</td>
			<td style="width:195px;">NTU workshop</td>
			<td style="width:327px;">Custom-made</td>
			<td>Used along with animal holder to supply anesthesia mixture to the animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:195px;">Valabarb</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Used for euthanizing the animal after the expeirment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Optical diffuser</td>
			<td style="width:195px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:327px;">DG10-1500</td>
			<td>Used to to make the laser beam homogeneous</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-performance compact photoacoustic tomography system for in vivo small-animal brain imaging

In vivo spielt die Kleinbild-Bildgebung eine wichtige Rolle in präklinischen Studien. Photoakustische Tomographie (PAT) ist eine aufkommende Hybrid-Imaging-Modalität, die ein großes Potenzial für präklinische und klinische Anwendungen zeigt. Konventionelle optische parametrische Oszillator-basierte PAT (OPO-PAT) -Systeme sind sperrig und teuer und können keine Hochgeschwindigkeits-Bildgebung bereitstellen. In letzter Zeit wurden Pulslaserdioden (PLDs) als alternative Anregungsquelle für PAT erfolgreich nachgewiesen. Die Puls-Laserdiode PAT (PLD-PAT) wurde erfolgreich für die Hochgeschwindigkeits-Bildgebung auf photoakustischen Phantomen und biologischen Geweben demonstriert. Diese Arbeit liefert ein visualisiertes experimentelles Protokoll für die in vivo- Gehirn-Bildgebung mit PLD-PAT. Das Protokoll beinhaltet die kompakte PLD-PAT-Systemkonfiguration und deren Beschreibung, Tierpräparation für die Gehirn-Bildgebung und ein typisches experimentelles Verfahren für die 2D-Querschnittsrücken-Gehirn-Bildgebung. Das PLD-PAT-System ist kompakt und kostengünstigFective und kann High-Speed, qualitativ hochwertige Bildgebung. Gehirnbilder, die in vivo bei verschiedenen Scan-Geschwindigkeiten gesammelt wurden, werden präsentiert.

Die in vivo- Gehirn-Imaging-Ergebnisse, die die Fähigkeiten des beschriebenen PLD-PAT-Systems zeigen, werden in diesem Abschnitt gezeigt. Um die High-Speed-Imaging-Fähigkeiten des PLD-PAT-Systems zu demonstrieren, wurde die in vivo- Gehirn-Bildgebung von zwei verschiedenen gesunden Ratten durchgeführt. Fig. 2 zeigt die Gehirnbilder einer weiblichen Ratte (93 g) bei verschiedenen Abtastgeschwindigkeiten. Abbildung 2a<...

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A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

Ein kompaktes Puls-Laser-Dioden-basiertes photoakustisches Tomographie-System (PLD-PAT) für die Hochgeschwindigkeits- In-vivo- Gehirn-Bildgebung bei kleinen Tieren wird gezeigt.

Ein leistungsstarkes kompaktes Fotoakustik-Tomographie-System für<em&gt; In vivo</em&gt; Kleintier Gehirn Bildgebung

In vivo small-animal imaging has an important role to play in preclinical studies. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging hybrid imaging modality ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

10.4K Aufrufe.  Nanyang Technological University.  Ein kompaktes Puls-Laser-Dioden-basiertes photoakustisches Tomographie-System (PLD-PAT) für die Hochgeschwindigkeits- In-vivo- Gehirn-Bildgebung bei kleinen Tieren wird gezeigt. 

Serie: A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Integrierte Photoakustische Ophthalmoskopie und Spectral-Domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

A detailed understanding of the complexity and relative variability within the human cardiac venous system is crucial for the development of cardiac devices that require access to these vessels. For example, cardiac venous anatomy is known to be one of the key limitations for the proper delivery of cardiac resynchronization therapy (CRT)1 Therefore, the development of a database of anatomical parameters for human cardiac venous systems can aid in the design of CRT delivery devices to overcome such a limitation. In this research project, the anatomical parameters were obtained from 3D reconstructions of the venous system using contrast-computed tomography (CT) imaging and modeling software (Materialise, Leuven, Belgium). The following parameters were assessed for each vein: arc length, tortuousity, branching angle, distance to the coronary sinus ostium, and vessel diameter.
	CRT is a potential treatment for patients with electromechanical dyssynchrony. Approximately 10-20% of heart failure patients may benefit from CRT2. Electromechanical dyssynchrony implies that parts of the myocardium activate and contract earlier or later than the normal conduction pathway of the heart. In CRT, dyssynchronous areas of the myocardium are treated with electrical stimulation. CRT pacing typically involves pacing leads that stimulate the right atrium (RA), right ventricle (RV), and left ventricle (LV) to produce more resynchronized rhythms. The LV lead is typically implanted within a cardiac vein, with the aim to overlay it within the site of latest myocardial activation. 
	We believe that the models obtained and the analyses thereof will promote the anatomical education for patients, students, clinicians, and medical device designers. The methodologies employed here can also be utilized to study other anatomical features of our human heart specimens, such as the coronary arteries. To further encourage the educational value of this research, we have shared the venous models on our free access website: <a href="http://www.vhlab.umn.edu/atlas" target="_blank">www.vhlab.umn.edu/atlas</a>.

The objective of this research is to recreate and then access the anatomy of the human cardiac venous system using 3D reconstructions generated from contrast-computed tomography scans.

Anatomische Rekonstruktionen des menschlichen Cardiac Venensystem mit Kontrast-Computertomographie Perfusion-fixierten Proben

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

Die arteriovenöse (AV) Loop in einem Kleintiermodell zur Untersuchung Angiogenesis und Vaskularisierte Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the optical mean free path (~1 mm in skin) with high resolution. By combining optical absorption contrast with the high spatial resolution of ultrasound in a single modality, this technique can penetrate deep tissues. Photoacoustic microscopy systems can have either a low acoustic resolution and probe deeply or a high optical resolution and probe shallowly. It is challenging to achieve high spatial resolution and large depth penetration with a single system. This work presents an AR-OR-PAM system capable of both high-resolution imaging at shallow depths and low-resolution deep-tissue imaging of the same sample in vivo. A lateral resolution of 4 &#181;m with 1.4 mm imaging depth using optical focusing and a lateral resolution of 45 &#181;m with 7.8 mm imaging depth using acoustic focusing were successfully demonstrated using the combined system. Here,&#160;in vivo&#160;small-animal blood vasculature imaging is performed to demonstrate its biological imaging capability.

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Here a switchable acoustic resolution (AR) and optical resolution (OR) photoacoustic microscopy (AR-OR-PAM) system capable of both high resolution imaging at shallow depth and low resolution deep tissue imaging on the same sample in vivo is demonstrated.

Umschaltbare akustische und optische Auflösung Photoakustische Mikroskopie für<em&gt; In vivo</em&gt; Kleintier-Blut-Vaskulatur-Bildgebung

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Die richtige Positionierung und Zurückhaltung einer Ratte Hind Extremität für fokussierte hochauflösende Bildgebung von Knochen-Mikroarchitektur mit In Vivo Mikro-Computertomographie

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

Hand-Held klinische photoakustische Imaging-System für Echtzeit-nicht-invasive kleine Tier Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...