Name: clock scan protocol for image analysis: imagej plugins
Uploaded: 2017-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
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Wir danken Dr. Tanja Maritzen und Dr. Fabian Feutlinske (Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie, Berlin, Deutschland), um mit uns ihre Version des Fuji ImageJ Clock Scan Plugins zu teilen und uns zu inspirieren, diese Version des Programms zu entwickeln. Wir danken Dr. Fritz Melchers (Abteilung für Lymphozytenentwicklung, Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie) für seine freundliche Erlaubnis, die Bilder aus der Datenbank seiner Abteilung zum Zwecke der Prüfung und Verbesserung des Plugins zu nutzen. Unterstützung: Zentrum für Translationsneurowissenschaften; NIH bewilligen: P30-GM110702-03.

1. Software-Installation <ol><li> Installieren Sie die neuesten Versionen von gebündeltem Java und entweder ImageJ oder Fiji ImageJ wie auf den jeweiligen Webseiten empfohlen (siehe Materialtabelle für Links zu den entsprechenden Websites). Im folgenden Text werden beide Programme als &quot;ImageJ&quot; bezeichnet. </li><li> Kopiere die Plugin-Dateien &quot;Clock_Scan-1.0.1. Jar&quot; und &quot;Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar&quot; mit dem in der Materialtabelle enthaltenen Link und füge sie in das ImageJ-Plugin-Verzeichnis ein. Alternativ verwenden Sie bitte die Option &quot;Plugins | Install Plugin&quot;, um diese Dateien zu installieren, nachdem sie auf der Festplatte des Computers gespeichert wurden. </li></ol> 2. Clock Scan Analyse <ol><li> Standard Clock Scan Plugin ( Abbildung 1 ): <ol><li> Verwenden Sie den Menübefehl ImageJ &quot;File | Open&quot;, um ein interessantes Bild zu öffnen. </li><li> Klicken Sie auf das Werkzeug &#39;Polygon&#39; oder &#39;segmentierte Zeilenauswahl&#39;Werkzeug, und zeichne dann auf das Bild, um den gesamten ROI oder ein Segment dieser Region zu skizzieren. Siehe Abbildung 1 A für ein Beispiel der Polygonauswahl (innere gestrichelte Kontur). HINWEIS: Andere Auswahlwerkzeuge, die in der Software (rechteckige, ovale und freihändige Zeilenauswahl) zur Verfügung stehen, können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Wählen Sie &quot;Plugins | Clock Scan&quot; aus dem Menü, um das Standard-Takt-Scan-Protokoll-Popup-Fenster zu öffnen. Beachten Sie, dass dieser Befehl auch das ROI Manager-Fenster öffnet, wobei die Gliederung automatisch hinzugefügt wird. </li><li> Verwenden Sie das Plugin-Optionsfenster, um Folgendes auszuführen. <ol><li> Überprüfen und ändern Sie die X- und Y-Koordinaten des ROI-Zentrums (automatisch als Koordinaten des physikalischen Massenzentrums berechnet), indem Sie Bildlaufleisten verwenden oder die Werte in den entsprechenden Eingabefeldern ändern. Siehe Abbildung 1 B. </li><li> Je nachdem, wie viel von der Hintergrundregion außerhalb des Objekts shoSollte durch das Scannen abgedeckt werden, die Scan-Limits anpassen, indem Sie die Scroll-Leiste &quot;Scan-Limit&quot; verwenden. Siehe Abbildung 1 A. HINWEIS: Scan-Limit ist die Bruchzahl, die angibt, wie weit der Scan über die Grenze der Objekte hinausgehen sollte. Der Standardwert ist 1,20, was anzeigt, dass die Scanlänge 20% länger als der Objektradius in Richtung des Scans ist; Siehe Abbildung 1 A , äußere gestrichelte Linie). </li><li> Ändern Sie die Ausgabe des Plugins mit &quot;Real Radius&quot;, &quot;Subtrahieren Hintergrund&quot;, &quot;Polare Transformation&quot; und / oder die &quot;Plot mit Standardabweichung&quot; Kontrollkästchen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um das Plugin auszuführen. Siehe Abbildung 1 C-H . HINWEIS: Beispiele für die Ausgabe des Protokolls mit &quot;Plot mit Standardabweichung&quot; und &quot;Polare Transformation&quot; oder &quot;Realradius&quot; und &quot;Polar TransfOrm &quot;-Optionen sind in Abbildung 1 C und 1D und Abbildung 1 E bzw. 1F dargestellt. Beachten Sie, dass die berechneten Standardabweichung (SD) die Veränderung zwischen einzelnen radialen Pixelintensitätsscans des Objekts darstellen. Beachten Sie auch die&quot; ROI-Auswahl &quot; Länge &quot;im Plugin-Fenster, die die Informationen über die ROI-Gliederungslänge anzeigt, die in Pixeln gemessen wird. </li></ol></li><li> In dem erzeugten &quot;Clock Scan Profile Plot&quot; verwenden Sie den Befehl &quot;List&quot;, um Werte anzuzeigen, die in zwei, X- und Y-Spalten von Daten für Graustufenbilder und in X- und vier Y-Spalten von Daten für RGB-Bilder dargestellt werden, von denen Y0, Y1, Y2 und Y3 werden mit integralen und individuellen (roten, grünen und blauen) Farbkanalpixelintensitätswerten gefüllt. </li></ol></li><li> Mehrere ROI Clock Scan Plugin - Arbeiten mit mehreren ROI ( <strongClass = &quot;xfig&quot;&gt; Abbildung 2 ): <ol><li> Öffnen Sie ein Bild mit mehreren ROI. </li><li> Öffnen Sie den ROI Manager, indem Sie auf &quot;Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager&quot; klicken. </li><li> Sequenziell skizzieren (siehe Schritt 2.1.2) und füge jeden ROI dem ROI Manager hinzu, indem du im ROI Manager-Fenster auf &quot;Hinzufügen&quot; klickst. Tu das für alle ROIs im Bild. Verwenden Sie den Befehl &quot;Analysieren | Messen&quot;, wenn ROI-Metriken von Interesse sind. <ol><li> Siehe Abbildung 2 A für ein Beispiel für mehrere segmentierte Zeilenauswahl und Abbildung 2 E für ein Beispiel für mehrere Polygonauswahl. </li></ol></li><li> Wählen Sie im Menü &quot;Plugins&quot; die Option &quot;Multi Clock Scan&quot;, um das Popup-Fenster für die Protokolloptionen zu öffnen. </li><li> Verwenden Sie das Protokolloptionsfenster, um Folgendes auszuführen. <ol><li> Falls erforderlich, setzen Sie den Scan-Grenzwert nach Schritt 2.1.4.2 zurück; Der Standardwert ist 1,20. </li><li> Wenn nötig, wählen Sie das optIonen, um das mittlere Takt-Scan-Profil mit SD-Balken zu markieren, indem man die &quot;Plot mit Standardabweichung&quot; -Kasten überprüft. Siehe Abbildung 2 C und D. HINWEIS: Die berechneten SD-Werte stellen eine Variation zwischen integrierten Taktsuchprofilen verschiedener Objekte dar. Beachten Sie auch die Zeile im Plugin-Fenster mit Informationen über die &quot;Anzahl ausgewählter ROIs&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um das Protokoll auszuführen. </li></ol></li><li> In der generierten &quot;Clock Scan Profile Plot&quot; verwenden Sie den Befehl &quot;List&quot;, um die im Fenster &quot;Plot Values&quot; angezeigten Werte darzustellen. Siehe &quot;Multi Clock Scan Profile Plot&quot; Fenster Legende für Spaltenbezeichnung nach Farbkanal. </li><li> Beachten Sie, dass die ROIs nummeriert sind und ihre Taktsuchprofile für einen beliebigen Farbkanal in der gleichen Reihenfolge aufgetragen sind, in der die ROIs skizziert und dem &quot;ROI Manager&quot; hinzugefügt wurden. </li></ol></li><li> MulTip ROI Clock Scan Plugin - Arbeiten mit einem Bildstack ( Abbildung 3 ): <ol><li> Öffne einen Bildstapel von Interesse. </li><li> Öffnen Sie den ROI Manager, indem Sie auf &quot;Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager&quot; klicken. </li><li> Planen Sie den ROI der Bilder im Stapel und fügen Sie ihn dem ROI-Manager hinzu, wie in den Schritten 2.1.2 und 2.2.3 beschrieben. Verwenden Sie den Befehl &quot;Analysieren | Messen&quot;, wenn die ROI-Metriken von Interesse sind. </li><li> Wählen Sie im Menü &quot;Plugins&quot; die Option &quot;Multi Clock Scan&quot;, um das Popup-Fenster für die Protokolloptionen zu öffnen. </li><li> Verwenden Sie das Protokolloptionsfenster, um Folgendes auszuführen. <ol><li> Setzen Sie die Scan-Grenze wie in Schritt 2.1.4.2 beschrieben zurück; Der Standardwert ist 1,20. </li><li> Wählen Sie die Option, um das mittlere Takt-Scan-Profil mit SD-Balken zu markieren, indem Sie das Feld &#39;Plot mit Standardabweichung&#39; markieren. HINWEIS: Die berechneten SD-Werte stellen eine Variation zwischen verschiedenen Instanzen des im Bild sta markierten Objekts darCk Beachten Sie auch die Zeile im Plugin-Fenster mit Informationen über die &quot;Anzahl der Bilder im Stack&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um das Protokoll auszuführen. </li></ol></li><li> Im Fenster &quot;Clock Scan Profile Plot&quot; klicken Sie auf &quot;List&quot;, um die im Fenster &quot;Plot Values&quot; angezeigten Werte darzustellen, wobei die Y-Spaltennummer die Bildposition innerhalb des Stacks darstellt - 1. </li></ol></li></ol>

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	<li>Dobretsov, M., Romanovsky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Clock-scan"+protocol+for+image+analysis.">"Clock-scan" protocol for image analysis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).</li><li>Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stonin1+mediates+endocytosis+of+the+proteoglycan+NG2+and+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+motility.">Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility.</a> Nat Commun. 6, 8535 (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniform+expression+of+alpha+subunit+isoforms+of+the+Na+/K++pump+in+rat+dorsal+root+ganglia+neurons.">Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons.</a> Brain Res. 821, 212-217 (1999).</li><li>Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+patch+clamp+recording+and+calcium+imaging+of+neurons+in+the+intact+dorsal+root+ganglion+in+rats.">An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats.</a> J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).</li><li>Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+model+to+selectively+identify+alpha3+Na,K-ATPase+expressing+cells+in+the+nervous+system.">Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system.</a> Society for Neuroscience. , 1 (2015).</li><li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+decline+in+density+of+human+nerve+and+spinal+ganglia+neurons+expressing+the+alpha3+isoform+of+Na/K-ATPase.">Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase.</a> Neuroscience. 310, 342-353 (2015).</li><li>Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+selective+photoconductive+stimulation+of+live+neurons.">Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons.</a> Front Cell Neurosci. 8, 142 (2014).</li><li>Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Calcium+Imaging+of+Evoked+Calcium+Waves+in+the+Embryonic+Cortex.">In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex.</a> Front Cell Neurosci. 9, 500 (2015).</li><li>Qiao, M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Method+for+Labeling+Electrically+Coupled+Cells:+Application+to+Retina.">Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina.</a> Front Mol Neurosci. 8, 81 (2015).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte haben.

Clock Scan Protocol: Das Clock Scan Protokoll ist ein schnelles und einfaches Werkzeug der Bildanalyse. Die Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu bestehenden gemeinsamen Ansätzen der Bildanalyse (wie z. B. lineare Pixelintensitätsscans oder Berechnung der mittleren Pixelintensität des ROI) wurden in den vorangegangenen Publikationen 1 , 9 ausführlich beschrieben. Kurz gesagt ermöglicht dieses Protokoll die Erzeugung von integralen radi...

Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein Clock Scan-Protokoll zu präsentieren, das plattformfrei und frei verfügbar für jeden Forscher ist, der an dieser Art von Bildanalyse interessiert ist. Das Clock Scan-Protokoll wurde ursprünglich im Jahr 2006 entwickelt, mit dem Ziel, bestehende Methoden der Pixelintensitätsquantifizierung in konvex-förmigen Regionen von Interesse (ROI) zu verbessern, ein Verfahren, das eine bessere Integrationsfähigkeit und eine verbesserte räumliche Auflösung aufweist. Während der Erfassung sammelt das Protokoll sequentiell mehrere radiale Pixelintensitätsprofile, die vom ROI-Zentrum bis zu seinem Rand abgetastet werden, oder auf eine vorbestimmte Distanz außerhalb des ROI zum Zwecke der Messung der &quot;Hintergrund&quot; -Pixelintensität. Das Protokoll skaliert diese Profile nach dem Zellenradius, gemessen in Richtung des Scans. Somit ist der Abstand von der Mitte zur ROI-Grenze jedes einzelnen radialen Scans immer 100% der X-Skala. Schließlich übertrifft das Programm diese IndividuenAl-Profilen zu einem integralen radialen Pixel-Intensitäts-Profil. Wegen der Skalierung hängt das mittlere Pixel-Intensitätsprofil, das durch das &quot;Clock Scan&quot; -Protokoll erzeugt wird, weder von der ROI-Größe noch von vernünftigen Grenzen auf die ROI-Form ab. Diese Methode ermöglicht einen direkten Vergleich oder, falls erforderlich, Mittelwertbildung oder Subtraktion von Profilen unterschiedlicher ROIs. Das Protokoll erlaubt auch eine Korrektur der integralen Pixelintensitätsprofile, eines beliebigen Objekts für Hintergrundrauschen, durch eine einfache Subtraktion der durchschnittlichen Intensität von Pixeln, die sich außerhalb des Objekts befinden. Obwohl es nur in biologischen Proben getestet wurde, bietet unser Protokoll eine wertvolle Ergänzung zu anderen vorhandenen Bildanalyse-Werkzeugen, die in Studien von Bildern von physikalischen oder chemischen Prozessen verwendet werden, die um einen Ursprungsort herum angeordnet sind (wie die Diffusion von Substanzen aus einer Punktquelle ) 1 . Allerdings war die Hauptbeschränkung der ursprünglichen Bildanalyse Methode, dass das Protokoll dev warAls ein Visual Basic 6 (VB6) (Code, und daher war es plattformabhängig und schwer zu verteilen (erfordern VB6). Um dieses Problem zu lösen und um ähnliche jüngsten Bemühungen von anderen Forschern 2 beitreten, konvertierten wir die VB6 Clock Scan Programmcode in zwei Java-basierte Plugins, kompatibel mit den NIH-geförderten und frei verfügbaren Open-Source- und plattformunabhängigen Bildanalyseprogrammen, ImageJ 3 und Fiji ImageJ 4. Darüber hinaus haben diese Plugins nun mehrere neue Funktionen, die die Leistungsfähigkeit erweitern Des ursprünglichen Protokolls, um mehrere ROIs und Bildstapel zu verarbeiten Viele Bildanalyseanwendungen sind nicht benutzerfreundlich, was die statistische Auswertung mehrerer Objekte anbelangt und so werden oft nur repräsentative Daten angezeigt. Mit dem Multi Clock Scan ImageJ Plugin, Es ist möglich, die Analyse mehrerer Objekte gleichzeitig zu erleichtern. Eine robuste statistische Auswertung von Mikroskopiedaten,In Bezug auf die Signalintensitätsverteilung in einzelnen Zellen / Objekten ist nun mit dieser Plugin-Erweiterung möglich. Hier beschreiben wir die Clock Scan Plugins und zeigen Beispiele für ihre Anwendungen in der Bildanalyse.

<table><tbody><tr><td>Computer</td><td>Any</td><td></td><td>compatible with software listed below</td></tr><tr><td>ImageJ or Fiji ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/</td><td>bundled with Java 1.8 or higher</td></tr><tr><td>Clock-scan plugins</td><td>freeware</td><td>https://sourceforge.net/projects/clockscan/</td><td>Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar</td></tr><tr><td>Origin 9.0</td><td>OriginLab</td><td>Northampton, MA, USA</td><td>This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function</td></tr></tbody></table>

clock scan protocol for image analysis: imagej plugins

Das Taktabtastprotokoll für die Bildanalyse ist ein effizientes Werkzeug, um die durchschnittliche Pixelintensität innerhalb, an der Grenze und außerhalb (Hintergrund) eines geschlossenen oder segmentierten konvexen Bereichs von Interesse zu quantifizieren, was zur Erzeugung eines gemittelten integralen radialen Pixel- Intensitätsprofil. Dieses Protokoll wurde ursprünglich im Jahr 2006 als visuelles Basic 6-Skript entwickelt, aber als solches hatte es eine begrenzte Verteilung. Um dieses Problem zu lösen und ähnliche jüngsten Bemühungen von anderen zu verknüpfen, haben wir den ursprünglichen Taktsuchprotokollcode in zwei Java-basierte Plugins umgewandelt, die mit NIH-gesponserten und frei verfügbaren Bildanalyseprogrammen wie ImageJ oder Fiji ImageJ kompatibel sind. Darüber hinaus haben diese Plugins mehrere neue Funktionen, die den Umfang der Fähigkeiten des ursprünglichen Protokolls weiter ausbauen, wie etwa die Analyse mehrerer interessanter Bereiche und Bildstapel. Das letztere Merkmal des Programms ist besonders nützlich bei Anwendungen, bei denen es wichtig ist, Änderungen zu ermittelnZu Zeit und Ort. So kann die Taktsuchanalyse von Stapeln biologischer Bilder potentiell auf die Ausbreitung von Na + oder Ca ++ innerhalb einer einzelnen Zelle sowie auf die Analyse der Ausbreitungsaktivität ( z. B. Ca ++ - Wellen) in Populationen synaptisch angewendet werden Zusammengesetzte oder spaltübergreifende Zellen. Hier beschreiben wir diese neuen Uhren-Scan-Plugins und zeigen einige Beispiele für ihre Anwendungen in der Bildanalyse.

Die Bilder, die hier zur Veranschaulichung verwendet werden, stammen aus Datenbanken, die während unserer früheren Zelle und Gewebe biologischen Studien 5 , 6 , 7 und aus dem Allen Maus Gehirn Atlas 8 erstellt wurden . Beide Plugins wurden erfolgreich mit ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 und Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1...

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Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

In diesem Beitrag werden zwei neue ImageJ-Plugins für die &quot;Clock Scan&quot; -Bildanalyse beschrieben. Diese Plugins erweitern die Funktionalität des ursprünglichen Visual Basic 6 Programms und stellen vor allem das Programm einer großen Forschungsgemeinschaft zur Verfügung, indem sie es mit dem ImageJ Free Image Analysis Softwarepaket bündeln.

Clock Scan Protocol für Bildanalyse: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

clock-scan-protocol-for-image-analysis-imagej-plugins

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K Aufrufe.  University of Arkansas for Medical Sciences.  In diesem Beitrag werden zwei neue ImageJ-Plugins für die "Clock Scan" -Bildanalyse beschrieben. Diese Plugins erweitern die Funktionalität des ursprünglichen Visual Basic 6 Programms und stellen vor allem das Programm einer großen Forschungsgemeinschaft zur Verfügung, indem sie es mit dem ImageJ Free Image Analysis Softwarepaket bündeln. 

Serie: Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

Kartierung der Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells mit Mikromustern und quantitativer Bildgebung

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Outer-Boundary Assisted Segmentation and Quantification of Trabecular Bones by an Imagej Plugin

Micro-computed tomography (micro-CT) is routinely used to assess bone quantity and trabecular microstructural properties in small animals under different bone loss conditions. However, the standard approach for trabecular analysis of micro-CT images is slice-by-slice semi-automatic hand-contouring, which is labor intensive and error prone. Described here is an efficient method for automatic segmentation of trabecular bones according to the bone's outer boundaries, where trabecular bones can be identified and segmented automatically with accuracy with less operator bias when appropriate segmentation parameters are set. To profile satisfactory segmentation parameters, an image stack of segmentation results is displayed, where all possible combinations of the segmentation parameters are changed one by one in sequence, and segmentation results with associated parameters can easily be visually checked. As a quality-control feature of the plugin, simulated standard objects are quantified where the measured quantities can be compared with theoretical values. Layer-by-layer quantification of trabecular properties and trabecular thicknesses are reported by such a plugin, and the distributions of such properties within the selected regions can be profiled easily. Although layer-by-layer quantification retains more information about trabecular bones and facilitates further statistical analysis of structural changes, such measures are unavailable from the output of current commercial software, where only a single quantified value for each parameter is reported for each sample. Therefore, the described workflows are better approaches for analyzing trabecular bones with accuracy and efficiency.

We present a workflow for segmenting and quantifying trabecular bones for 2D and 3D images based on the bone&#39;s outer boundary using an ImageJ plugin. This approach is more efficient and accurate than the current manual hand-contouring approach, and provides layer-by-layer quantifications, which are not available in current commercial software.

Äußere Begrenzung unterstützt Segmentierung und Quantifizierung der trabekulären Knochen durch eine Imagej-Plugin

Micro-computed tomography (micro-CT) is routinely used to assess bone quantity and trabecular microstructural properties in small animals under different ...

Biotechnik

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows across a large spatiotemporal range. However, its implementation typically requires the use of expensive and specialized instrumentation, which limits its broader utility. Moreover, within the field of bioengineering, in vitro flow visualization studies are also often further limited by the high cost of commercially sourced tissue phantoms that recapitulate desired anatomical structures, particularly for those that span the mesoscale regime (i.e., submillimeter to millimeter length scales). Herein, we present a simplified experimental protocol developed to address these limitations, the key elements of which include 1) a relatively low-cost method for fabricating mesoscale tissue phantoms using 3-D printing and silicone casting, and 2) an open-source image analysis and processing framework that reduces the demand upon the instrumentation for measuring mesoscale flows (i.e., velocities up to tens of millimeters/second). Collectively, this lowers the barrier to entry for nonexperts, by leveraging resources already at the disposal of many bioengineering researchers. We demonstratethe applicability of this protocol within the context of neurovascular flow characterization; however, it is expected to be relevant to a broader range of mesoscale applications in bioengineering and beyond.

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Here we present simplified methods for fabricating transparent neurovascular phantoms and characterizing the flow therein. We highlight several important parameters and demonstrate their relationship to field accuracy.

Mesoskaligen Partikel Image Velocimetry Studien des neurovaskulären fließt In-vitro-

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH / Flash Labeling und Bildanalyse von Tetracysteinmotiv Sensor Proteinen in Zellen

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Biologie

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and geometric&#160;deformation. Our understanding of the internal relationships between these events has been limited because we can neither &#39;see&#39; inside the muscle nor precisely track the spatio-temporal nature of excitation-contraction dynamics. To resolve these problems, we have constructed a device that combines a suite of imaging modalities. Specifically, it integrates a brightfield microscope to measure local changes of sarcomere length and tissue strain, a fluorescence microscope to visualize the Ca2+ transient, and an optical coherence tomograph to capture the tissue&#39;s geometric&#160;changes throughout the time-course of a cardiac cycle. We present here the imaging infrastructure and associated data collection framework. Data are collected from isolated rod-like tissue structures known as trabeculae carneae. In our instrument, a pair of position-controlled platinum hooks hold each end of an ex vivo muscle sample while it is continuously superfused with nutrient-rich saline solution. The hooks are under independent control, permitting real-time control of muscle length and force. Lengthwise translation enables the piecewise scanning of the sample, overcoming limitations associated with the relative size of the microscope imaging window (540 &#181;m by 540 &#181;m) and the length of a typical trabecula (&#62;2000 &#181;m). Platinum electrodes at either end of the muscle chamber stimulate the trabecula at a user-defined rate. We exploit the stimulation signal as a trigger for synchronizing the data from each imaging window to reconstruct the entire sample twitching under steady-state conditions. Applying image-processing techniques to these brightfield imaging data provides tissue displacement and sarcomere length maps. Such a collection of data, when incorporated into an experiment-modeling pipeline, will provide a deeper understanding of muscle contractile homogeneity and heterogeneity in physiology and pathophysiology.

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

This protocol presents a collection of sarcomere, calcium, and macroscopic geometric&#160;data from an actively contracting cardiac trabecula ex vivo. These simultaneous measurements are made possible by the integration of three imaging modalities.

Simultane Hellfeld-, Fluoreszenz- und optische Kohärenztomographische Bildgebung kontrahierender Herztrabekel Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

TACI: An ImageJ Plugin for 3D Calcium Imaging Analysis

Research in neuroscience has evolved to use complex imaging and computational tools to extract comprehensive information from data sets. Calcium imaging is a widely used technique that requires sophisticated software to obtain reliable results, but many laboratories struggle to adopt computational methods when updating protocols to meet modern standards. Difficulties arise due to a lack of programming knowledge and paywalls for software. In addition, cells of interest display movements in all directions during calcium imaging. Many approaches have been developed to correct the motion in the lateral (x/y) direction.
This paper describes a workflow using a new ImageJ plugin, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), to examine motion on the z-axis in 3D calcium imaging. This software identifies the maximum fluorescence value from all the z-positions a neuron appears in and uses it to represent the neuron&#39;s intensity at the corresponding t-position. Therefore, this tool can separate neurons overlapping in the lateral (x/y) direction but appearing&#160;on distinct z-planes. As an ImageJ plugin, TACI is a user-friendly, open-source computational tool for 3D calcium imaging analysis. We validated this workflow using fly larval thermosensitive neurons that displayed movements in all directions during temperature fluctuation and a 3D calcium imaging dataset acquired from the fly brain.

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) is an open-source ImageJ plugin for 3D calcium imaging analysis that examines motion on the z-axis and identifies the maximum value of each z-stack to represent a cell's intensity at the corresponding time point. It can separate neurons overlapping in the lateral (x/y) direction but on different z-planes.

TACI: Ein ImageJ-Plugin für die 3D-Calcium-Imaging-Analyse

Research in neuroscience has evolved to use complex imaging and computational tools to extract comprehensive information from data sets. Calcium imaging ...

Neurowissenschaften

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis algorithms which can be used effectively to count various biological particles. When counting large numbers of cell samples, the hemocytometer presents a bottleneck with regards to time. Likewise, counting membranes from migration/invasion assays with the ImageJ plugin Cell Counter, although accurate, is exceptionally labor intensive, subjective, and infamous for causing wrist pain. To address this need, we developed two plugins within ImageJ for the sole task of automated hemocytometer (or known volume) and migration/invasion cell counting. Both plugins rely on the ability to acquire high quality micrographs with minimal background. They are easy to use and optimized for quick counting and analysis of large sample sizes with built-in analysis tools to help calibration of counts. By combining the core principles of Cell Counter with an automated counting algorithm and post-counting analysis, this greatly increases the ease with which migration assays can be processed without any loss of accuracy.

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Automatische Quantifizierung und Analyse von Zellzählung Schritte bei der Verwendung ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca2 + Signalisierung In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations of bacteria move over large distances in characteristic tendril-shaped communities over the course of hours. Swarming is sensitive to several factors including medium moisture, humidity, and nutrient content. In addition, the collective stress response, which is observed in P. aeruginosa that are stressed by antibiotics or bacteriophage (phage), repels swarms from approaching the area containing the stress. The methods described here address how to control the critical factors that affect swarming. We introduce a simple method to monitor swarming dynamics and the collective stress response with high temporal resolution using a flatbed document scanner, and describe how to compile and perform a quantitative analysis of swarms. This simple and cost-effective method provides precise and well-controlled quantification of swarming and may be extended to other types of plate-based growth assays and bacterial species.

We detail a simple method to produce high-resolution time-lapse movies of Pseudomonas aeruginosa swarms that respond to bacteriophage (phage) and antibiotic stress using a flatbed document scanner. This procedure is a fast and simple method for monitoring swarming dynamics and may be adapted to study the motility and growth of other bacterial species.

Zeitraffer-Bildgebung von Bakterienschwärmen und kollektive Stressreaktion

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying cellular and molecular mechanisms regulating lineage transitions of neural stem cells (NSCs) and eventual production of neurons and glia in the developing neuroepithelium remains unclear. Methods to trace NSC division patterns and map the lineage of clonally related cells have advanced dramatically. However, many contemporary lineage tracing techniques suffer from the lack of cellular resolution of progeny cell fate, which is essential for deciphering progenitor cell division patterns. Presented is a protocol using mosaic analysis with double markers (MADM) to perform in vivo clonal analysis. MADM concomitantly manipulates individual progenitor cells and visualizes precise division patterns and lineage progression at unprecedented single cell resolution. MADM-based interchromosomal recombination events during the G2-X phase of mitosis, together with temporally inducible CreERT2, provide exact information on the birth dates of clones and their division patterns. Thus, MADM lineage tracing provides unprecedented qualitative and quantitative optical readouts of the proliferation mode of stem cell progenitors at the single cell level. MADM also allows for examination of the mechanisms and functional requirements of candidate genes in NSC lineage progression. This method is unique in that comparative analysis of control and mutant subclones can be performed in the same tissue environment in vivo. Here, the protocol is described in detail, and experimental paradigms to employ MADM for clonal analysis and lineage tracing in the developing cerebral cortex are demonstrated. Importantly, this protocol can be adapted to perform MADM clonal analysis in any murine stem cell niche, as long as the CreERT2 driver is present.

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

A protocol to perform lineage tracing and functional genetic analysis of candidate genes at a single cell level using mosaic analysis with double markers (MADM) is presented. MADM clonal analysis provides a quantitative framework to measure the proliferative behavior, cellular output, and lineage relationship of individual progenitors and their daughter cells.

Lineage Tracing und Clonal Analysis bei der Entwicklung von Zerebralparese mit Mosaikanalyse mit Doppelmarkern (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...