Diese Methode ermöglicht es, zu manipulieren und zu quantifizieren, wie die Zellen kollektiv organisieren. Dies ist wichtig, da wir Muster in vitro modellieren und in vivo eng gekoppelte Cues entwirren können. Die Technik erfordert minimale Spezialausrüstung, so dass sie in einem Standard-Biologielabor etabliert werden kann, und sie ist quantitativ, was die Entdeckung subvisueller Musterereignisse ermöglicht.
Diese Methode kann leicht auf jedes Zellsystem angewendet werden, in dem Muster entstehen könnten, und um nicht zufällige Muster der Differenzierung, Proliferation und Zell-zu-Zell-Konkurrenz zu entdecken. Die Hauptsache bei dieser Methode ist die systematische Optimierung von Mikromusterparametern für neue Zelltypen. Beispiel: Mustergröße und -form, Matrixtyp und Zellhaftungszeit.
Tragen Sie Handschuhe, legen Sie ein Stück Laborfolie in den Boden einer 10-Zentimeter-Quadrat-Petrischale. Verwenden Sie einen 12-Millimeter-Lochstempel, um hydrophobe Kunststoffschlitten zu schneiden, um 12-Millimeter-Abdeckungs-Slips zu erstellen, und legen Sie die Deckelscheine in eine neue Petrischale. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Schutzfolie vorsichtig von den Deckschscheinen zu entfernen.
Legen Sie die Fotomaske auf eine saubere und stabile Oberfläche, Verchromung seite oben, und fügen Sie einen Zwei-Mikroliter-Tropfen doppeldestilliertes Wasser an der Position des gewünschten Chip-Designs hinzu. Drücken Sie vorsichtig einen Deckelschlupf auf den Tropfen und legen Sie den Halter auf die Kunststoffschlitten. Befestigen Sie dieses Sandwich sorgfältig mit Klammern, um die Kunststoffteile in Kontakt mit der Fotomaske zu halten.
Stellen Sie die Baugruppe in eine ultraviolette Ozonlampe etwa zwei Zentimeter von der Lichtquelle für eine 10-minütige Beleuchtung. Greifen Sie am Ende der Beleuchtungszeit das Sandwich mit der Fotomaske an der Unterseite und entfernen Sie vorsichtig die Klemmen, während Sie den Druck mit einer Hand beibehalten, um zu verhindern, dass sich die Dias beim Zerlegen des Sandwiches bewegen. Wenn alle Klemmen entfernt wurden, entfernen Sie den Halter, wobei Sie darauf achten, dass alle Kunststoffteile noch auf der Maske sind und nicht an der Halterung kleben, und fügen Sie den Chips doppelt destilliertes Wasser hinzu, um die Späne vorsichtig von der Fotomaske zu lösen.
Legen Sie die fotogemusterten Späne in die Matrix-Abscheidungskammer, leuchtete die Seite nach oben, und fügen Sie 200 Mikroliter Beschichtungslösung auf jeden Chip. Dann fügen Sie eine drei Zentimeter lange Petrischale, gefüllt mit doppelt destilliertem Wasser, in die Kammer, um die Verdunstung über Nacht bei vier Grad Celsius zu begrenzen. Für die Aussaat embryonaler Zellen auf die Chips, waschen Sie die Chips mit zwei mindestens fünfminütigen Wäschen in frischen, sterilen PBS pro Wäsche, bevor Sie ein mal zehn bis fünf bis fünf Zellen in 200 Mikroliter des entsprechenden Zellkulturmediums auf jeden Chip ausgibt.
Schließen Sie dann die Säkammer. Eine Stunde lang inkubieren, damit die Zellen an den Chips haften können. Wenn die Zellen befestigt haben, füllen Sie die Brunnen einer Multiwell-Platte mit 500 Mikroliter warmes Medium pro Brunnen, und verwenden Sie sterile Pinzette, um die Chips in einzelne Plattenbrunnen zu übertragen.
Schütteln Sie die Platte kräftig, um alle nicht haftenden Zellen zu lösen, und ersetzen Sie den Überstand sofort durch frisches, warmes Medium. Überprüfen Sie dann unter dem Mikroskop, ob die Musterung sichtbar ist. 48 Stunden nach ihrer Beschichtung sollten die Zellen dichte Kolonien bilden, die streng der Form der Muster folgen.
Lassen Sie die Chips in der Platte, entfernen Sie alle, aber gerade genug Medium, um das Trocknen der Chips zu verhindern, und fügen Sie mindestens 500 Mikroliter Paraformaldehyd oder PFA-basierte Fixierlösung pro Brunnen hinzu. Nach zehn Minuten die Brunnen dreimal mit Waschlösung kurz waschen, gefolgt von einer Wäsche mit 50-Millimolar-Ammoniumchlorid, das in Waschlösung verdünnt wird, um die verbleibende PFA-Vernetzungsaktivität zu löschen. Nach der letzten Wäsche die Proben mindestens 30 Minuten mit einer Blockierlösung behandeln.
Zur Immunfärbung der Chipkulturen die Chips in eine Färbekammerzellseite nach oben übertragen und sofort 100 Mikroliter der primären Antikörperlösung hinzufügen, die für jeden Chip von Interesse ist. Nach einer Stunde auf einer rotierenden Plattform bei Raumtemperatur die Chips dreimal mit Waschlösung waschen, wie gezeigt, und die Chips mit den entsprechenden Sekundärantikörpern für eine Stunde auf der rotierenden Plattform inkubieren. Am Ende der Sekundärantikörper-Inkubation die Chips dreimal in Waschlösung waschen und den Chip auf einem Mikroskopschlitten mit 20 Mikrolitern eines beliebigen Standard-Montagemediums montieren.
Um die Chips abzubilden, passen Sie zunächst die Scangeschwindigkeit, die Bildauflösung, die Bildmittelung und die Detektorgewinne an, um ein Optimum zwischen Bildqualität und Bildzeit zu ermitteln. Dann erfassen Sie Bilder von jedem Chip. Wenn alle Images erworben wurden, installieren und führen Sie PickCells gemäß der online verfügbaren Dokumentation aus, erstellen Sie ein neues Experiment, und importieren Sie die Images in das Programm.
Verwenden Sie das Nessys-Modul, um die Kerne basierend auf dem nuklearen Umschlagsignal zu segmentieren. Verwenden Sie das grundlegende Segmentierungsmodul, um das Autofluoreszenzsignal des Musters zu identifizieren. Klicken Sie dann auf Fertig stellen" und warten Sie, bis alle Bilder verarbeitet werden.
Um Kerneobjekte zu erstellen und grundlegende Objektfeatures zu berechnen, starten Sie das Modul "Intrinsische Features" über die Taskleiste, und schließen Sie die Bedienfelder Ellipsoid Fitter und Surface Extractor, um nur das Bedienfeld "Grundlegende Funktionen" offen zu halten. Wählen Sie nucleus" als Objekttyp aus, und wählen Sie das bereitgestellte Präfix für die segmentierten Bilder aus. Klicken Sie dann auf Berechnen" und warten Sie, bis alle Bilder verarbeitet wurden.
In diesem Stadium müssen zusätzliche Funktionen in Kerne geschrieben werden, bevor die Daten für unsere Analyse exportiert werden. Um beispielsweise den Namen des Bildes zu speichern, zu dem jeder Kern als Nucleus-Attribut gehört, klicken Sie im Popup-Dialog auf Daten"und Neues Attribut"und wählen Sie den Kern aus. Klicken Sie auf OK"Wählen Sie Daten von anderen Objekten sammeln, die mit dem Knoten verbunden sind, und klicken Sie auf Weiter"Im linken Bereich wählen Sie Bild aus, und doppelklicken Sie auf die Abfragemarkierung, um den Bildknoten als Ziel des Pfads festzulegen.
Erweitern Sie den Bereich Reduzierungsvorgang, und wählen Sie Get One"Erweitern Sie den Bereich Verfügbares Attribut, und wählen Sie das Attribut Name aus. Klicken Sie dann auf Ändern"und Weiter"Bildname eingeben, drücken Sie die Tabulatortaste, und klicken Sie auf Fertig stellen"Dann exportieren Sie die Daten in eine datei mit registerkartengetrennten Werten. Für unsere Analyse werden die exportierten Daten in den Datenordner des R-Script-Ordners geloopt.
Öffnen Sie unser Studio"und öffnen Sie die binned Map-Vorlage R-Script"Dann legen Sie das Arbeitsverzeichnis auf den Speicherort der Quelldatei fest, und führen Sie das Skript aus, um Dichtezuordnungen zu generieren. Eine Stunde nach der Zellaussaat sind die einzelnen Zellkultur-Patten möglicherweise nicht vollständig konfluent, da sich die Zellen im Laufe der Zeit vermehren. Die Muster werden jedoch mit nur sehr wenigen Zellen außerhalb der Klebeflächen vollständig kolonisiert.
Muster, die bis zu zwei Stunden nach dem Seeding nicht klar sind, weisen auf einen Fehler der Prozedur hin. Die räumliche Einschließung embryonaler Stammzellen auf großen Scheiben oder Ringmikromustern leitet die Musterung einer Unterpopulation von Zellen, die den mesodermalen Brachyury-Marker exemittiert. Wenn beispielsweise die embryonalen Stammzellen der Maus auf Mikromustern mit großen Scheiben angebaut werden, werden die brachyury-positiven Zellen bevorzugt auf die Peripherie des Musters beschränkt, bei dem die lokale Zelldichte die niedrigste ist.
Diese Musterung wird durch die Karte der Gehirn-Brachyury-Intensität bestätigt. Diese Daten zeigen, dass die Methode subvisuelle Informationen offenbaren kann, da die Inspektion einer Kolonie nicht ausreicht, um irgendeine Form der räumlichen Organisation in der Marker-interessens-Expression zu identifizieren. Dies erklärt sich vor allem durch die wichtige Variabilität zwischen Kolonien und Kolonien.
Die Technik zeigt auch, dass es keine nachweisbare Musterung für den Inhibitor der DNA-Bindung gibt, die darauf hindeuten kann, dass die T-Musterung in diesem Zusammenhang nicht durch Knochenmorphogenetische Proteinsignalisierung angetrieben wird. Denken Sie immer daran, welche Seite des Deckbelegs eliminiert und beschichtet wurde, und achten Sie auch darauf, dass die Zellen richtig haften haben, bevor Sie die überschüssigen Zellen abwaschen. Diese Methode ermöglicht das Studium der Umwelthinweise, die bei der Steuerung der Selbstorganisation von Zellen wichtig sind, und kann auch mathematische Modelle informieren, die uns unter der rudimentalen Musterung besser helfen.
