Die Fähigkeit, große Datenmengen aus Kalzium-Bildgebungsexperimenten zu erfassen, hat sich drastisch verbessert, insbesondere bei Gewebebildversuchen. Unsere Protokolle beschreiben geeignete Analysetechniken zur Quantifizierung und Beschreibung dieser Datensätze. Unsere Protokolle erzeugen eine Reihe von räumlichen, zeitlichen und Intensitätswerten, die der Kalziumsignalisierung in ganzen Geweben innewohnen, und dies kann in einer rudimentäreren Analyse verloren gehen.
Eine Stunde vor der Bildgebung transferiert ein Dünndarm von einer Maus mit interstitiellen Zellen von Cajal oder ICC geerntet, die speziell einen genetisch kodierten Kalzium-Indikator auf das Stadium eines Spinnscheibe konfokalen Mikroskops ausdrücken. Und durchdringen Sie kontinuierlich das Gewebe mit 37 Grad Celsius Krebs-Ringer Bicarbonat oder KRB-Lösung. Mit einer 60 bis 100 X Vergrößerung lokalisieren Sie den stellatförmigen myenterischen Plexus ICC oder ICC-MY zwischen den kreisförmigen und längsglatten Muskelschichten des Dünndarms.
Dann lokalisieren Sie den spindelförmigen tiefen Muskelplexus ICC oder ICC-DMP in einer einzigen Ebene zwischen der kreisförmigen glatten Muskelschicht und dem submucosalen Plexus und speichern Sie die Filme als Stapel von TIFF-Bildern. Um raumzeitliche Karten oder STMs der ICC-DMP-Calciumaktivität zu erstellen, öffnen Sie den Bildstapel in ImageJ, und klicken Sie auf Bild, Typ und 32-Bit, um die Bildqualität zu ändern. Um einen Zeilenscan zu erstellen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Linienauswahlwerkzeug, und wählen Sie die segmentierte Linie aus.
Zeichnen Sie mit einzelnen Linken klickt eine Linie entlang des mittleren Zugriffs eines einzelnen ICC-DMP, indem Sie doppelklicken, wenn die gesamte Zelle umrissen wurde. Wählen Sie Bild, Stapel und Reslice. Es wird ein Popupfenster angezeigt.
Wählen Sie Um90 Grad drehen, um den Linienscan von links nach rechts auszurichten, damit er kalibriert und gegen die Zeit auf der x-Achse mit Leerzeichen auf der y-Achse gelesen werden kann, und klicken Sie auf OK. Die raumzeitliche Karte wird angezeigt. Um die Amplitude der Kalziumsignale aus der Karte genau zu messen, wählen Sie die rechteckige Auswahl aus und zeichnen Sie einen Bereich von Interesse um das Gebiet innerhalb des STM, der den gleichmäßigsten und am wenigsten intensiven Fluoreszenzbereich anzeigt. Klicken Sie auf Analysieren und Histogramm, um einen Mittelwert der Intensität innerhalb des ausgewählten Interessenbereichs zu erhalten, und klicken Sie auf Bearbeiten, Auswahl, Alle auswählen, um den gesamten STM auszuwählen.
Klicken Sie als Nächstes auf Prozess, Mathe und Divide, und geben Sie den Mittelwert der Intensität mit der ausgewählten STM-Region ein, die von Interesse ist, in das Pop-up-Feld. Der STM wird schwarz. Korrigieren Sie dies, indem Sie im Popup-Fenster auf Bild, Anpassen, Helligkeit/Kontrast und Auto klicken.
Der Linienscan wird nun für die Amplitude mit der Intensität der Fluoreszenz kalibriert, ausgedrückt als Fluoreszenz geteilt durch die Nullfluoreszenz. Der STM zeigt die Anzahl der Frames im TIFF-Stack auf der x-Achse und die Anzahl der Pixel an, die die Länge der Zelle auf der y-Achse darstellen. Um die zeitlichen und räumlichen Daten aus den Calciumsignalen zu quantifizieren, klicken Sie auf Bild und Eigenschaften und geben Sie die entsprechenden Werte ein, um den STM vollständig auf Raum und Zeit im Pop-up-Fenster zu kalibrieren.
Um die einzelnen Calciumereignisse zu analysieren, klicken Sie auf Gerade Linie, und klicken und ziehen Sie auf den STM, um eine gerade horizontale Linie durch die Mitte eines Calciumereignisses parallel zur x-Achse zu zeichnen. Klicken Sie dann auf Analysieren und Plotprofil. Es wird ein Feld angezeigt, das das Diagrammprofil des Kalziumereignisses anzeigt.
Für die partikelbasierte Analyse der ICC-MY Calcium-Signaldaten öffnen Sie die Filmdatei in Volumetry und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um STK-Filter, Differenzieren auszuwählen. Klicken Sie erneut mit der rechten Maustaste, um einen zu differenzierenden Wert einzugeben. Drücken Sie die Eingabetaste, und klicken Sie mit der linken Maustaste, um die Differenzierung zu initiieren.
Um Partikel zu erstellen, scrollen Sie mit der mittleren Maustaste durch den Film, um einen 20 bis 40 Frame-Abschnitt auszuwählen, der eine Ruhezeit enthält, gefolgt vom Auftreten eines kalziumtransienten Clusters und 20 bis 40 Frames, die direkt nach dem Cluster folgen. Wenn alle Frames mit der rechten Maustaste im Filmfenster ausgewählt wurden, um auf STK OPS Ramp DS-Partikelinformationen zuzugreifen, klicken Sie auf eine Partikelanalyseroutine, die den Schwellenwert schrittweise von der maximalen auf die minimale Intensität hochleitet. Um eine erfolgreiche Partikelanalyse sicherzustellen, stellen Sie sicher, dass Sie so viel präkalziumtransiente Cluster-Nichtaktivität und so viel post-Calcium transientCluster-Nichtaktivität wie möglich integrieren.
Dies wird dazu beitragen, das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Die Analyse wird im Plotfenster grafisch als Rauschendiagramm und im Ablaufverfolgungsfenster als drei Farbspuren dargestellt, wobei die grüne Spur die Anzahl der Partikel, die rote Spur, die die durchschnittliche Partikelgröße darstellt, und die blaue Spur, die den Schwellenwert für die absolute Intensität darstellt, darstellt. Um das Histogramm auszugleichen, drücken Sie die Darstellung des Partikelrauschens H auf der Tastatur.
Drücken Sie dann die rechte Klammertaste, um Farbschemata zu durchlaufen, bis der Hintergrund weiß ist und die Farbspuren oben sind. Drücken Sie einmal F auf der Tastatur, um ein Messwerkzeug aufzurufen. Drücken Sie dann ein zweites Mal F, um eine einzelne vertikale Linie in der Bildlaufleiste des Diagrammfensters auf dem Diagramm an der Kreuzung zu markieren, an der sich die farbigen Diagramme auf die rechte Seite verschieben.
Verwenden Sie im Ablaufverfolgungsfenster die mittlere Maustaste, um vom Wendepunkt der roten Spur zur markierten weißen vertikalen Linie zu scrollen. Nachdem Sie den angezeigten Y-Durchschnitt notiert haben, klicken Sie erneut auf die mittlere Maustaste im Ablaufverfolgungsfenster, um die Blaue Spur zu deaktivieren. Klicken Sie im Filmfenster auf C, um ein Farbrad aufzuführen, und D, um den Schwellenwert anzupassen.
Gültige Partikel werden nun rot angezeigt, und diejenigen, die gesättigt sind, werden weiß sein. Verwenden Sie die linke Maustaste, um zu scrollen, bis die weißen Bereiche entfernt sind, und verwenden Sie die mittlere Maustaste, um den gelben numerischen Wert im Farbrad an den Y-Durchschnittswert anzupassen, um alles in Rot als aktives transientes Kalziumpartikel am festgelegten Schwellenwert zuzuweisen. Um die Daten als koordinatenbasierte Partikeldatei zu speichern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf STK 3D, speichern Sie Partikel Null, und klicken Sie mit der linken Maustaste, um die Datei zu speichern.
Um Partikelaktivitäts-Heatmaps zu erstellen, öffnen Sie die gespeicherte Partikeldatei und klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Filmfenster, um auf Partikel STKops, StatMap Flag zuzugreifen und Flagzuweisungen einzugeben, um sie zu analysieren. Klicken Sie hierauf, um die Analyse und eine Heatmap anzuwenden, in der die Gesamtpartikel für die gesamte Aufzeichnungslänge mit unterschiedlichen Farben angezeigt werden, die das prozentuale Vorkommen während der Aufzeichnung darstellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Heatmap als TIFF-Datei zu speichern.
Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste in das Filmfenster, um auf partikelmess, Partikelwerte STK gleich zu greifen, und geben Sie eine Flagzuweisung für die Analyse ein. Im Ablaufverfolgungsfenster wird eine Reihe von Ablaufverfolgungen generiert. Die STM-Analyse bietet die Möglichkeit, die räumlichen Merkmale der Calciumsignalisierung zu überwachen und aufzuzeichnen, wie z. B. die räumliche Ausbreitung und Ausbreitungsgeschwindigkeit.
Diese Informationen können angesammelt werden, um eine ziemlich vollständige Ansicht des Kalziumsignalverhaltens innerhalb von Zellen in ihren nativen Umgebungen zu bieten. Mittels Partikelanalyse können quantitative Informationen über die Kalziumsignalisierung durch Messung der Partikelfläche und der Partikelzahl berechnet werden, die zusammen verwendet werden können, um die räumlichen Bereiche der Calciumsignalaktivierung innerhalb eines bestimmten Sichtfeldes zu bestimmen. Die Partikelanalyse ermöglicht auch die eingehende Quantifizierung der subzellulären Calciumsignalisierung durch Untersuchung der Standort- und Brennwahrscheinlichkeiten von Kalziumbrennstellen.
Durch die Zuordnung der Partikel in verschiedene Flaggen basierend auf ihren zeitlichen Eigenschaften können die anrichtenden Teilchen genau abgebildet werden. Und eine Fülle von harten Daten über die Anzahl der Initiationsstandorte, die Größe des Standorts in Pixeln und Mikrometern, die Wahrscheinlichkeit, dass jede Initiationsstelle während jedes Kalzium-Transientenclusters ein- oder mehrmals ausgelöst wird, und der Prozentsatz der Brennstellen, die während jedes Kalziumtransienten-Cluster-Zyklus feuern, kann ermittelt werden. Konsistenz ist der Schlüssel zum Erfolg in diesem Protokoll.
Alle Datensätze und alle Filme müssen exakt gleich behandelt werden, um zuverlässige, wiederholbare Ergebnisse zu gewährleisten. Dies gilt insbesondere für den Umgang mit Partikeldateien. Unsere Protokolle ermöglichen eine tiefe Charakterisierung der Kalziumsignalisierung vor Ort, und eine Reihe statistischer Methoden kann bei sachgemäßer Verwendung Unterschiede zwischen einem Bereich räumlicher und zeitlicher Parameter bewerten.
Diese Analysetechniken in unserem Protokoll haben es Forschern ermöglicht, zuvor unadressierbare Fragen im Zusammenhang mit der Darmpacemaking und Darminnervation sowie der neuronalen Kontrolle der unteren Harnwege zu stellen und zu beantworten.
