Die Autoren erkennen des National Cancer Institute von der nationalen Institute der Gesundheit Weg zur Unabhängigkeit Award (K99CA201603).

Der neonatalen Ratte Herzzellen in diesem Protokoll verwendeten wurden isoliert von 2 Tage alten Sprague-Dawley Ratten nach einem etablierten Verfahren56 durch die institutionelle Animal Care and Use Committee am Brigham and Women es Hospital genehmigt.
1. Instrumente der Bioprinter
<ol>
	<li>Legen Sie eine kleinere stumpfe Nadel (z.B., 27 G, 1 Zoll) als Kern in der Mitte einer größeren stumpfen Nadel (z.B., 18 G, ½ Zoll) als die Hülle, die Dual-Layer-, konzentrische mikrofluidischen Druckkopf zu konstruieren; Stellen Sie sicher, dass die Kern-Nadel leicht hervorstehenden ist (~ 1 mm) länger als die äußere Hülle (Abb. 1A). Die Ausrichtung ist in der Regel manuell eingestellt, aber können wenn notwendig Abstandhalter der richtige Größen zeitlich zwischen der inneren/äußeren Nadeln auf die Spitze und die Lauf-Seiten gerne konzentrische Ausrichtung eingeklemmt werden. Versiegeln der Kreuzung der Fässer mit Epoxy-Kleber und die Ausrichtung Abstandhalter aus der Spitze Seite ggf. entfernen.</li>
	<li>Setzen Sie eine andere Nadel (23G) in den Lauf der zentralen Nadel in umgekehrter Richtung.  Dann erzeugen ein Loch seitlich auf dem Lauf der äußere Nadel und legen Sie einen Metallstecker der passenden Größe in das Loch, gefolgt von Versiegelung mit Epoxy-Kleber.</li>
	<li>Verbinden Sie die Eingänge des Druckkopfes auf eine Zweikanal-Spritzenpumpe für die Injektion der Bioink und der Vernetzung-Lösung individuell, durch zwei PVC-Rohre. Montieren Sie den Extruder auf den Kopf des einen Bioprinter mit einer Kunststoff-Halter von Poly(methyl methacrylate) (PMMA) gemacht. Hinweis: Bioprinter Auswahl richtet sich nach Verfügbarkeit. In unserem Fall haben wir dieses Setup auf mehreren im Handel erhältlichen Bioprinters erfolgreich getestet. Jedoch sollte jede Bioprinter, die einem X-y-Z motorisierten Stadium verfügt über im Prinzip Integration von diesem mikrofluidischen Druckkopf machen.</li>
</ol>
(2) Bioprinting Microfibrous vaskulären Bettes
<ol>
	<li>Machen die Bioink mit einer Mischung aus Alginat (4 w/v%, niedrige Viskosität), Gelatine Methacryloyl (GelMA, 1-2 w/v%)57,58und Photoinitiator Irgacure 2959 (0,2 - 0,5 wt.%) aufgelöst in 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) Piperazin-1-Yl] Ethan Sulfonsäure (HEPES-Puffer, pH 7.4) mit 10 vol.% fetalen bovine Serum (FBS).</li>
	<li>Machen Sie eine Lösung von 0,3 M CaCl2 in HEPES-Puffer mit 10 vol.% FBS als Trägerflüssigkeit Vernetzung.</li>
	<li>Unmittelbar vor Bioprinting menschliche Nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) aus den Kolben mit Behandlung von 0,05 w/v% Trypsin für ca. 5-10 min zu distanzieren und Aufschwemmen der Zellen in der Bioink in einer Konzentration von 5-10 × 106 Zellen/mL. Pipette die Suspension langsam 5 bis 10 Mal um homogene Verteilung zu gewährleisten.</li>
	<li>Starten Sie die Injektion von Bioink/Vernetzung Flüssigkeit mit einem Zweikanal-Spritzenpumpe an die gleiche Volumenströme von 5 µL/mL. Die Ströme können dürfen kontinuierlich für bis zu 1 min laufen lassen, bis sie stabilisieren. Anschließend starten Sie die Bewegung des Druckkopfes durch die Kontrolle der Bioprinter Abscheidung Geschwindigkeiten von ca. 4 mm/s (Abbildung 1B). Diese Geschwindigkeiten können feine müssen tuning mit jeder neuen Setup, um optimale Bioprinting zu gewährleisten. Der Bioprinting-Prozess erfolgt in der Regel bei Raumtemperatur (21-25 ° C), aber diese Temperatur kann verändert werden. Der Bioprinting Prozess sollte schnell Ionischen Gelierung der Alginat-Komponente und Ablagerung von ein Microfibrous Gerüst (Abbildung 1B) ermöglichen.</li>
	<li>Nachdem das Gerüst Bioprinted ist, erreichen Sie chemische Gelierung durch weitere Photocrosslinking der GelMA Komponente, auf etwa 5 bis 10 mW/cm2 von UV-Licht (360-480 nm) für 20-30 s (Abbildung 1C).</li>
	<li>Spülen Sie nach der Bioprinting und Vernetzung sanft das Gerüst mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die überschüssige CaCl2zu entfernen. Kultur das Mediumwechsel beladenen Microfibrous Gerüst in Endothelzellen Wachstumsmedium (EGM) in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 vol.% CO2 für bis zu um 16 Tage mit Medium verändert mindestens alle 2 Tage. Überwachen Sie die Morphologien Mediumwechsel unter dem Mikroskop während der Kulturdauer.</li>
</ol>
3. bauen die vaskularisierte Gewebe
<ol>
	<li>Sobald die Mediumwechsel auf den Peripherien von Mikrofasern in das Gerüst, um die Lumen-ähnliche Strukturen (Abbildung 1-D) bilden migriert haben, rufen Sie das Gerüst und legen Sie sie vorsichtig auf die Oberfläche einer hydrophoben Oberfläche (z.B. eine Platte aus Polymethylsiloxane [PDMS]). Verwenden Sie ein Stück des sterilen Filterpapiers, entfernen Sie vorsichtig das Medium aus dem interstitiellen Raum des Gerüstes mit Kapillare Kraft.</li>
	<li>Sofort Tropfen Sie einen (ca. 20-40 µL) Aussetzung der sekundären Zelltyp (z.B. Herzzellen) im Medium bei einer Dichte von 1-10 × 106 Zellen/mL auf das Gerüst, das die gesamte Zwischenraum des Gerüstes (Abbildung 1E) infiltrieren sollte. Inkubieren Sie eine solche Konfiguration in einem Inkubator (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95 % Relative Luftfeuchtigkeit) für 0,5 - 2 h damit die Zellen auf die einzelnen Mikrofasern halten. Überwachen Sie die Tropfengröße im Zeitraum um sicherzustellen, dass keine spürbaren Verdunstung beobachtet wird.</li>
	<li>Vorsichtig Waschen der Gerüste durch Schütteln in einem PBS-Bad, nicht-anhaftende Zellen und Kultur das Konstrukt im jeweiligen Medium zu entfernen, bis das gewünschte vaskularisierte Gewebe gebildet wird.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Bau der co-axial Druckkopf ist einen entscheidender Schritt in Richtung erfolgreiche mikrofluidische Bioprinting, um gleichzeitige Lieferung sowohl die Bioink aus dem Kern und der Vernetzungsmittel aus der Scheide zu ermöglichen. Während in diesem Protokoll mit einer 27G Nadel als Kern und einer 18G-Nadel als Shell ein Beispiel Druckkopf erstellt wurde, kann es leicht zu einer Vielzahl von Kombinationen mit verschiedenen Größen der Nadeln verlängert werden. Die Veränderung in der Nadel-Größen, die Ergebnisse in d...

Tissue engineering Ziele Funktionsgewebe Ersatzstoffe zu generieren, die verwendet werden können, um zu ersetzen, wiederherstellen oder ergänzen diese verletzten oder erkrankten in den menschlichen Körper1,2,3,4, oft durch eine Kombination der gewünschten Zelltypen, bioaktive Moleküle5,6und Biomaterialien7,8,9,10. Vor kurzem haben Gewebe-engineering-Technologien auch zunehmend angenommen, um in-vitro- Gewebe und Organ Modelle generieren, die wichtigen Funktionen von ihren Kollegen in Vivo für Anwendungen wie die Medikamentenentwicklung, Ersatz von konventionellen vereinfachenden planar Zelle Kulturen11,12,13,14,15,16,17,18,19zu imitieren. In beiden Situationen die Fähigkeit, komplexe Mikroarchitektur und hierarchische Struktur der menschlichen Gewebe rekapitulieren ist entscheidend in die Lage versetzen Funktionalität der technischen Gewebe10, und Möglichkeiten, um den technischen Geweben eine vaskuläre Netzwerk integrieren sind insbesondere der Nachfrage da Vaskularisierung eine der größten Herausforderungen auf dem Feld20,21,22,23 stellt.
Bis heute eine Vielzahl von Ansätzen wurden entwickelt in diesem Zusammenhang in einem Versuch, Blutgefäß Strukturen in veränderter Gewebe Konstrukte mit unterschiedlichem Erfolg8zu bauen. Beispielsweise können Selbstmontage von Endothelzellen zur Erzeugung von mikrovaskulären Netze24; Lieferung von angiogene Wachstumsfaktoren induziert nachhaltige Neovaskularisation25,26; Verwenden von vaskulären Vorläuferzellen und Perizyten erleichtert endothelial Zelle Wachstum und Montage24,27; Gestaltung von Gerüst Eigenschaften ermöglicht präzise Modulation der Vaskularisierung28,29; und Blatt-Zelltechnologie ermöglicht die bequeme Manipulation von vaskulären Schichtung30. Dennoch diese Strategien nicht die Fähigkeit zur Steuerung der räumlichen Strukturierung des Gefäßsystems, führt häufig zu zufälligen Verteilung der Blutgefäße innerhalb ein veränderter Gewebe Konstrukt und damit begrenzte Reproduzierbarkeit verleihen. In den letzten Jahren hat eine Klasse von Basistechnologien zur Lösung so eine Herausforderung, durch ihre unvergleichliche Vielseitigkeit der Hinterlegung komplexe Gewebe Muster am High Fidelity und Reproduzierbarkeit in eine automatisierte oder halbautomatisierte Weise31,32,33Bioprinting entwickelt. Opfer Bioprinting34,35,36,37,38, eingebettete Bioprinting39,40,41und hohlen Struktur Bioprinting/Biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 haben alle bewiesen die Machbarkeit Gefäß- oder vaskularisierte Gewebe zu erzeugen.
Alternativ eine mikrofluidischen Bioprinting Strategie, Microfibrous Gerüste zu fabrizieren vor kurzem entwickelt worden, wo ein Hybrid-Bioink bestehend aus Alginat und Gelatine Methacryloyl (GelMA) wurde durch den Kern einer konzentrischen Druckkopf und einen Kalzium-Chlorid (CaCl2) Lösung geliefert erfolgte durch den Außenmantel Fluss der Druckkopf54,55. Die Co-Extrusion der zwei Ströme durfte für sofortige physikalische Vernetzung der Alginat Komponente Mikrofaser Bildung zu ermöglichen, während spätere Photocrosslinking dauerhafte Stabilisierung der mehrschichtigen Microfibrous Gerüst gewährleistet. Der Hinweis fanden sich Endothelzellen gekapselt innerhalb der Bioprinted-Mikrofasern zu vermehren und migrieren zu den Peripherien der Mikrofasern vorausgesetzt Lumen-ähnliche Strukturen, die die vaskuläre Bett54,55nachgeahmt. Diese Bioprinted endothelialized vaskuläre Betten konnte anschließend gefüllt mit gewünschten weiterführenden Zelltypen, vaskularisierte Gewebe55weiter zu bauen. Dieses Protokoll bietet somit ein detailliertes Verfahren einer solchen mikrofluidische Bioprinting Strategie durch die konzentrische Düse Design, sorgt für bequeme Herstellung von vaskularisierte Gewebe für potenzielle Anwendungen in der Gewebetechnik und organoide Modellierung ermöglicht.

<table width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Alginic acid sodium salt from brown algae</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">A0682</td>
			<td style="width:480px;">BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Gelatin type A from porcine skin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">G2500</td>
			<td>Gel strength 300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">410896</td>
			<td>98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">H0887</td>
			<td>1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">10438026</td>
			<td>Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">C5080</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">10010023</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Human umbilical vein endothelial cells</td>
			<td style="width:160px;">Angio-Proteomie</td>
			<td style="width:163px;">cAP-0001</td>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells</td>
			<td style="width:160px;">Angio-Proteomie</td>
			<td style="width:163px;">cAP-0001GFP</td>
			<td>GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Endothelial cell growth medium</td>
			<td style="width:160px;">Lonza</td>
			<td style="width:163px;">CC-3162</td>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">12430054</td>
			<td>High glucose, HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:160px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:163px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Clear 0.5 kg Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">UV curing lamp system</td>
			<td style="width:160px;">Excelitas Technologies</td>
			<td style="width:163px;">OmniCure S2000</td>
			<td>Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic bioprinting for engineering vascularized tissues and organoids

Vaskularisierte Gewebe-Engineering konstruiert und Organellen wurde historisch schwierig. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode basiert auf mikrofluidische Bioprinting um ein Gerüst mit mehrschichtigen interlacing Hydrogel Mikrofasern zu generieren. Um glatt zu erreichen war Bioprinting, ein Kern-Mantel mikrofluidischen Druckkopf enthält eine zusammengesetzte Bioink Formulierung aus den Kernfluss und die Vernetzung Lösung durchgeführt durch die Scheide-Fluss, extrudiert entworfen und auf die Bioprinter ausgestattet. Durch das Mischen Gelatine Methacryloyl (GelMA) mit Alginat, ein Polysaccharid, das momentane ionische Vernetzung in Anwesenheit von erfährt wählen Sie zweiwertige Ionen, gefolgt von einer sekundären Photocrosslinking der GelMA Komponente zur dauerhaften Stabilisierung zu erreichen, ein Microfibrous Gerüst konnte mit dieser Strategie der Bioprinting abgerufen werden. Wichtig ist, können die Endothelzellen gekapselt im Inneren der Bioprinted Mikrofasern die Lumen-ähnliche Strukturen wie das Gefäßsystem im Laufe der Kultur für 16 Tage bilden. Das endothelialized Microfibrous Gerüst kann als vaskuläre Bett weiterverwendet werden, um eine vaskularisierte Gewebe durch anschließende Aussaat des sekundären Zelltyps in den interstitiellen Raum der die Mikrofasern zu konstruieren. Mikrofluidische Bioprinting bietet eine allgemeine Strategie bequem Engineering vaskularisierte Gewebe bei High Fidelity.

Mikrofluidische Bioprinting Strategie ermöglicht Direktextrusion Bioprinting Microfibrous Gerüste mit dünnflüssigen Bioinks54,55. Wie in Abbildung 2A, ein Gerüst mit einer Größe von 6 × 6 × 6 mm mit3 &#62; 30 Schichten aus Mikrofasern Bioprinted innerhalb von 10 min werden könnte. Die sofortige ionische Vernetzung der Alginat-Komponente mit CaCl2 erlaub...

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Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Wir bieten ein generalisiertes Protokoll basiert auf einer mikrofluidische Bioprinting Strategie für engineering-ein Microfibrous Kreislauf Bett, wo eine sekundäre Zelle Art weiter in den interstitiellen Raum dieser Microfibrous Struktur, vaskularisierte Gewebe und Organellen zu generieren ausgesät werden konnte.

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

microfluidic-bioprinting-for-engineering-vascularized-tissues

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.6K Aufrufe.  Harvard Medical School. Wir bieten ein generalisiertes Protokoll basiert auf einer mikrofluidische Bioprinting Strategie für engineering-ein Microfibrous Kreislauf Bett, wo eine sekundäre Zelle Art weiter in den interstitiellen Raum dieser Microfibrous Struktur, vaskularisierte Gewebe und Organellen zu generieren ausgesät werden konnte.

Serie: Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Mikrofluidischen Mischern für ein Studium Proteinfaltung

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Forschung

Biotechnik

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Mikrofluidische Herstellung von Polymer- und Biohybridfasern mit vorgefertigter Größe und Form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic properties, enable bio imaging and control cell phenotype. A critical yet inadequately addressed issue is the significant number of particles that remain unbound after cell labeling which cannot be readily removed by conventional centrifugation. This leads to an increase in bio imaging background noise and can impart transformative effects onto neighboring non-target cells. In this protocol, we present an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy termed as Dean Flow Fractionation (DFF) to efficiently separate labeled cells from free NPs in a high throughput manner. The developed spiral microdevice facilitates continuous collection (&#62;90% cell recovery) of purified cells (THP-1 and MSCs) suspended in new buffer solution, while achieving &#62;95% depletion of unbound fluorescent dye or dye-loaded NPs (silica or PLGA). This single-step, size-based cell purification strategy enables high cell processing throughput (106 cells/min) and is highly useful for large-volume cell purification of micro/nanoparticle engineered cells to achieve interference-free clinical application.

This protocol describes the use of an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy to purify micro/nanoparticle engineered cells with efficient depletion of unbound particles.

Mikrofluidik-Pufferaustausch für einen störungsfreien Micro / Nanoparticle Zelltechnik

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

Die arteriovenöse (AV) Loop in einem Kleintiermodell zur Untersuchung Angiogenesis und Vaskularisierte Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Zwei Methoden zur Decellularization von Pflanzengewebe für Tissue-Engineering-Anwendungen

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the initial stage varies dramatically from the following process of neovascularization. Although there are plenty of models to simulate different stages of neovascularization, an in vitro 3D model that capitulates the initial process of neovascularization under the corresponding stimulations of normal vasculature microenvironments is still lacking. Here, we reconstructed an in vitro 3D model that mimics the initial event of neovascularization (MIEN). The MIEN model contains a microfluidic sprouting chip and an automatic control, highly efficient circulation system. A functional, perfusable microchannel coated with endothelium was formed and the process of sprouting was simulated in the microfluidic sprouting chip. The initially physiological microenvironment of neovascularization was recapitulated with the microfluidic control system, by which ECs would be exposed to high luminal shear stress, physiological transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distributions simultaneously. The MIEN model can be readily applied to the study of neovascularization mechanism and holds a potential promise as a low-cost platform for drug screening and toxicology applications.

Here, we provide a microfluidic chip and an automatically controlled, highly efficient circulation microfluidic system that recapitulates the initial microenvironment of neovascularization, allowing endothelial cells (ECs) to be stimulated by high luminal shear stress, physiological level of transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distribution simultaneously.

Mikrofluidisches Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...