Die Herstellung von röhrenförmigen Strukturen ist ein vielversprechender Ansatz für die Gewebetechnik von Gefäßnetzen, der nach wie vor eine der größten Herausforderungen bei der Herstellung von dickem Gewebe in-vitro ist. Der Hauptvorteil der Kern-/Schalentechnik ist die einfache Herstellung von Hohlfilamentgerüsten in einem einzigen Schritt, wodurch die Fertigungszeit reduziert wird und möglicherweise ein direktes Drucken mit Zellen möglich ist. Die Herstellung einer Hydrogelformulierung mit den entsprechenden viskoelastischen Eigenschaften und die Aufrechterhaltung eines kontinuierlichen ausgewogenen Flusses der Kern-/Schalenmaterialien ist für den 3D-Druck stabiler Gerüste von entscheidender Bedeutung.
Zunächst die sterile 5 ml Spritze mit frisch zubereitetem Hydrogel füllen. Füllen Sie eine zweite 5 ml Spritze, ausgestattet mit einer 27 Gauge stumpfen Nadel, mit frisch zubereiteter Vernetzungslösung. Montieren Sie die Kern-/Schalendüse.
Legen Sie eine G27-Stumpfnadel als Kernkomponente ein und befestigen Sie die Nadel mit der Schraube. Die Innennadel sollte ca. 1 mm aus der äußeren Kernschalendüse herausragen. Schließen Sie die Spritze mit der Vernetzungslösung an die G27-Nadel in der Düse an und laden Sie die Spritze in eine der Extruderhalterungen eines Ethanol-sterilisierten 3D-Druckers.
Montieren Sie die Spritze mit Hydrogel in den zweiten Extruder und schließen Sie sie an die Düse an. Verwenden Sie ein Luer-Schloss, um ein kurzes Rohr mit dem seitlichen Luer-Eingang der Kern-/Schalendüse zu verbinden. Passen Sie die Ausrichtung vorsichtig manuell an, bis die Düse die Oberfläche berührt, bevor sie die Düse in einen Abstand zurückzieht, der dem äußeren Düsendurchmesser entspricht.
Importieren Sie das generierte Gerüst g-Code und drücken Sie Play, um den Druckvorgang zu initiieren. Nach dem Drucken das Substrat mit dem bedruckten Gerüst vorsichtig entfernen und die sekundäre Vernetzungslösung über das gesamte Gerüst gießen. Bebrüten Sie das Gerüst für eine Minute bei Raumtemperatur.
Um das Gerüst vom Substrat zu lösen, ziehen Sie das Gerüst sanft seitlich. Wenn das Gerüst stark am Substrat haftet, legen Sie eine scharfe Kante zwischen beide Materialien ein, um sie zu trennen. Das Gerüst in einen frischen Behälter geben.
UV sterilisieren beide Seiten des Gerüstes für 30 Minuten pro Seite. Dann legen Sie das Gerüst in ein farbloses Zellkulturmedium und bebrüten das Gerüst bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für mindestens 24 Stunden. Am nächsten Tag, Ernte Huvex aus einer In-vitro-Kultur mit 0,25%Trypsin für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.
Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die enzymatische Reaktion mit 3 ml Frischzellenkulturmedium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Das Pellet in einem frischen Kulturmedium, das Phenolrot enthält, wieder aufsetzen und die Zellen auf 3,4 mal 10 bis zu den fünften Endothelzellen pro Milliliter Konzentration verdünnen. Laden Sie die Zellen in eine sterile 5 ml Spritze mit einer 27-Spur-Nadel und lokalisieren Sie einen Einstiegspunkt im Gerüst.
Richten Sie die Nadel mit dem geraden Abschnitt des Gerüstfadens aus, durchstechen Sie das Gerüst vorsichtig in einem niedrigen Winkel. Bestätigen Sie, dass sich die Nadel innerhalb des Hohlfilaments des Kanals befindet, und drücken Sie den Kolben sanft, um etwa 1-2 ml Zellsuspension in das Gerüst zu injizieren. Der Fluss der Suspension sollte durch das transluzente Gerüst sichtbar sein.
Wenn das gesamte Gerüst mit Zellaufhängung gefüllt ist, tauchen Sie das Gerüst in das Medium Frischzellenkultur ein und bringen Sie das Gerüst für bis zu 10 Tage an den Zellkultur-Inkubator zurück. Für live/tote Bildgebung am Ende der Inkubation, spülen Sie das Gerüst mit PBS, und verwenden Sie eine stumpfe-Ende-Nadel, um sorgfältig Leben /Tote Lösung in das Gerüst zu injizieren. Bestätigen Sie, dass die Lösung das gesamte Gerüst gefüllt hat, und stellen Sie das Gerüst 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation das Gerüst mit PBS abspülen und vorsichtig auf eine Glasrutsche übertragen. Die gefärbten Zellen können dann in den Gerüsten unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden. In diesem Querschnitt eines frisch bedruckten und nachbearbeiteten Gerüstes kann innerhalb des Filaments ein deutlich sichtbarer Hohlkanal beobachtet werden.
Auch nach 72 Stunden Inkubation im Zellkulturmedium bei 37 Grad Celsius, wie gezeigt, behält das Filament die Hohlstruktur über die gesamte Gerüstlänge. Hier wird ein repräsentativer Leben/Toter-Test von Endothelzellen nach 48 Stunden Kultur in einem Gerüst gezeigt. Die lebenden Zellen können durch ihr hellgrünes Fluoreszenzsignal identifiziert werden.
Diese Technik ist die Basis für die einstufige Fertigung von Hohlrohrgerüsten und kann durch Direktdruck mit Inzellen, die in die Biotinte integriert sind, aufgewertet werden.
