Diese Arbeit wurde von MRC, EU FP7, ARUK, Wellcome Trust und Parkinson UK unterstützt. Wir möchten auch Frau Johanna Buchler Danke für ihren Beitrag der konfokalen Bilder und den Mitgliedern des Labors für ihre konstruktiven Beiträge auf dem Manuskript und Methodik.

alle die Experimente mit Mäusen und Ratten wurden genehmigt und durchgeführt mit Anhang 1 Verfahren abgedeckt unter dem Innenministerium Tiere (wissenschaftliche Verfahren) Act 1986. Die künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) Rezept finden Sie in Tabelle 1.
 1. akute Hippocampal Slice Vorbereitung <ol><li>das Gehirn der Maus so schnell wie möglich, mit einem Spatel entfernen und einer scharfen Schere schneiden den Schädel, und legen Sie sie in eiskalten, Sauerstoff (95 % O 2, 5 % CO 2), hoch-Saccharose ACFS (~ 100 mL).</li>
	<li>Das Gehirn der Maus auf eine Petrischale platzieren und entfernen das Kleinhirn und einen kleinen Abschnitt des frontalen Kortex mit einem Skalpell vor Hemisecting hinunter die Mittellinie des Gehirns.</li>
	<li>Bringen die beiden Hemisphären auf der Seite, die gerade geschnitten wurde und kleben Sie jede Hemisphäre auf die Bühne ein Vibratome.</li>
	<li>Cut 200-300 µm dicken Teil der gesamten Region von Interesse. Im Falle der Hippocampus, ca. 3-4 Scheiben pro Hemisphäre gesammelt werden.</li>
	<li>Mit einem Kunststoff Pasteurpipette übertragen die Scheiben zu einer Kammer in sauerstoffreichem (95 % O 2, 5 % CO 2) getaucht ACFS. Halten bei 34 ° C für 30 min. 
	Hinweis: Die Behandlung von Scheiben mit pharmakologischen Wirkstoffen wie rekombinante Dkk1 Proteine kann in diesem Stadium durch Zugabe von den Agenten der Slice-Kammer durchgeführt werden.</li>
	<li>Der Scheiben aus der Kammer mit einem Pinsel zu entfernen, legen Sie sie in einer 24-Well-Platte und fix für 20 min bis 1 h in 4 % Paraformaldehyd (PFA)/4% Saccharose bei Raumtemperatur (RT). 
	Achtung: PFA ist giftig, geeignete Verschleißschutz.</li>
	<li>Der Scheiben dreimal waschen mit 1 X PBS-Puffer (10 min). 
	Hinweis: Das Protokoll kann angehalten werden hier für 1-2 Tage, so lange die Scheiben bei 4 ° C mit 1 X PBS-Puffer gehalten werden.</li>
</ol> 2. Immunfluoreszenz für synaptischen Marker Hinweis: die Rezepte alle Puffer verwendet, finden Sie in Tabelle 2.
<ol><li>Ersetzen die PBS mit Blockierung/permeabilizing-Puffer (Tabelle 2) in den Slice-Brunnen und Inkubation bei RT für 4-6 h.</li>
	<li>Verdünnen den polyklonalen Meerschweinchen Antikörper gegen vGlut1 bei einem 1:2,000 Verdünnung im Puffer blockiert/Permeabilisierung. 
	Hinweis: vGlut1 ist ein Marker für die präsynaptischen exzitatorischen terminal Visualisierung. Zur Identifizierung der postsynaptischen erregenden Synapse, verwenden einen polyklonalen Antikörper gegen PSD-95 und verdünnter 1: 500 in der gleichen Projektmappe. Verwenden Sie ein Mindestvolumen von 300 µL in jede Vertiefung. Um die anatomische Lage des Hippocampus zu identifizieren, verwenden Sie einen Antikörper, der auch die neuronale Struktur, z. B. MAP2 oder Tubulin identifizieren kann. Trainieren Sie die korrekte Konzentrationen von allen primären Antikörper für die synaptischen Marker der Wahl (prä- und postsynaptischen) und im frischen blockieren/permeabilizing Puffer verdünnen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Scheiben in der primären Antikörper-Lösung über Nacht (oder für 1-2 Tage) bei 4 ° C. Verwendung einer schütteln Plattform mit kräftigen Bewegung.</li>
	<li>Waschen die Scheiben dreimal mit PBS-Puffer (10 min).</li>
	<li>Verdünnen der entsprechenden sekundären Antikörper 1: 500 in blocking-Puffer. Beispielsweise bei Verwendung den vGlut1-Meerschweinchen-Antikörper gelten Sie einen sekundäre Antikörper, der die Meerschweinchen-Komponente (z. B. Esel anti-guinea-Pig) konjugiert zu einem bestimmten Fluorophore erkennt. Bei Verwendung den PSD-95-Kaninchen-Antikörper gelten einen sekundären Antikörper, die die Kaninchen-Komponente (z. B. Esel Anti-Kaninchen) zu einer anderen spezifischen Fluorophor konjugiert erkennt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Scheiben in dieser Lösung für 2-3 h bei RT. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben vor dem Licht geschützt sind, wie Sekundärantikörper lichtempfindlich sind.</li>
	<li>Waschen die Scheiben dreimal mit PBS-Puffer (10 min).</li>
	<li>Entfernen Sie die Scheiben von der 24-Well-Platte mit einem Pinsel sorgfältig und legen Sie sie gleichmäßig auf vorher beschrifteten Objektträger. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel auf jede Scheibe und dann legen Sie vorsichtig ein Glas Deckglas auf den Scheiben. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Achten Sie darauf, um genug Eindeckmedium (300-400 µL), zu verwenden, da eine unzureichende Menge Scheiben trocknen führen kann.</li>
	<li>Verlassen, um für ein Minimum von 1-2 Tage bei RT trocknen und halten die Folien vor Licht geschützt werden.</li>
	<li>Speichern die Folien bei 4 ° C, kurzfristig, aber für die langfristige Lagerung, halten sie bei-20 ° c</li>
</ol> 3. Konfokale Bildaufnahme und Analyse <ol><li>Imaging mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie.
	<ol><li>Identifizieren die Region des Hippocampus, abgebildet werden (z. B. die Cornu Ammonis 1 und 3 (CA1, CA3) oder dentate Gyrus (DG)) mittels eines 10 X oder 20 X Objektiv.</li>
		<li>Änderung auf einem 40 X oder 63 X Ölimmersion Ziel um sicherzustellen, dass die Slice-Anatomie ist intakt durch die kontinuierliche Neuriten Identifizierung und Struktur organisiert. Verwenden Sie einen neuronalen Marker, wie MAP2, als Referenz ( Abbildung 1A).</li>
		<li>Anschließend wechseln Sie in ein 60 x Ölimmersion Ziel (NA = ~1.3 - 1.4) und passen Sie die Einstellungen für jeden Kanal um optimales Signal und Kontrast zu erhalten. Stellen Sie die Intensität jeder Laser, die Sättigung der alle Pixel mit einem hohem / niedrigem Kontrast Option zu vermeiden. 
		Hinweis: Diese Einstellung wird auf das Mikroskop verwendet, sondern beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Laser-Energie-Einstellungen verwendet, die in Abbildung 2, Abbildung 3, und Abbildung 4. Verwenden Sie um beste Ergebnisse zu erzielen eine Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln. Die Einstellungen sollten über die unterschiedlichen Bedingungen des gleichen Experiments konstant bleiben. Zusätzliche Zoom kann bei Bedarf angewendet werden.</li>
		<li>Die Tiefe, wo die Färbung auch ist, zu bewerten und Bild Stapel von mindestens 8 äquidistant zu erwerben (250 nm) Flugzeuge. Dann nehmen Sie 3 angrenzenden repräsentative Bilder stapeln aus der gleichen Gegend pro Scheibe. 
		Hinweis: Die tiefe variieren von einem Stück zum anderen sollte aber immer ca. 2 bis 5 µm von der Oberfläche der Scheibe.</li>
		<li>Wiederholen, die Übernahme in mindestens 3 Scheiben pro Zustand und von 6-8 Tiere pro Behandlungsgruppe.</li>
	</ol></li> <li>Bildanalyse. 
	Hinweis: Verwenden Sie eine automatisierte Bildanalyse-Software (siehe die Tabelle der Materialien). Beachten Sie, dass einige Systeme eine Lizenz benötigen, während andere frei, wie ImageJ sind. Die verwendete Software muss die Bilder in 3D analysieren, indem Sie unter Berücksichtigung aller Ebenen des Stapels abgebildet. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Details der Software in der Bildanalyse ( Abbildung 1).
	<ol><li>Verwendung eines Custom-basierte Intensität Schwelle Protokolls zur Identifizierung aller synaptischen Puncta und neuronale Marker, die manuell optimiert und in der Software ausgewählt [siehe Tabelle der Materialien für die spezifische Software verwendet in diesem Protokoll]. 
		Hinweis: Die Software identifiziert eine minimale und maximale Intensität für jeden Fluorophor und ordnet einen Prozentsatz der Intensität für jeden anerkannten Objekt. Beachten Sie, dass der Anteil der Intensität nach der Fluorophor verwendet wird und der Antikörper gegen die synaptischen Marker.</li>
		<li>Für synaptischen Marker, sicherzustellen, dass Größe filtert (&#62; 0.1µm 3 und &#60; 0.8µm 3) in der Software ausgewählt und auf das Bild angewendet. Passen Sie die Parameter um sicherzustellen, dass die ausgewählten Objekte nicht überlappen. Ausgeschlossen werden alle Objekte, die zu groß oder zu klein, um synaptische Puncta anzusehen sind (siehe Abb. 2 b). 
		Hinweis: Sobald optimiert, die gleichen Grenzwerte dann gelten für alle Bilder innerhalb einer gegebenen Experiment.</li>
		<li>Zu quantifizieren, die mittlere Zahl, Intensität und Umfang der einzelnen synaptischen Puncta (Pre- oder Post-synaptic) mit der optimierten Schwelle Protokollen innerhalb der Software ausgewählt. Normalisieren Sie die Puncta Zahl, um die Lautstärke über das Bildfeld (etwa 16.928 µm 3 im hier verwendeten System). Die synaptischen Puncta Intensität auf die Intensität der Referenz neuronalen Marker zu normalisieren. 
		Hinweis: Synapsen sind definiert als die Co Lokalisierung zwischen Prä- und postsynaptischen Marker. Einmal die Schwelle Protokolle für Prä- und postsynaptischen Puncta hAve wurde gegründet, sollte die Software die Co Lokalisierung der synaptischen Puncta als die Überlappung von 1 Pixel oder mehr in einer Ebene identifizieren. 
		Hinweis: Für statistische Analysen bestätigen Sie, dass alle Arten von Proben Normalität und Homogenität der Varianz, folgen bzw. Lilliefords und χ2-Test bestimmt. Zeigt eine Normalverteilung und Homogenität der Varianz Proben sollten mit parametrischen Tests analysiert werden, wie unten beschrieben. Beispielsweise sollte exzitatorische synaptische Puncta Analyse durchgeführt werden, eine einfache ANOVA mit Blockierung und Replikation. Jedes einzelne Experiment sollte als ein Block betrachtet werden; in der Regel gibt es drei unabhängige Experimenten, jeweils mit 1-3 Mäuse aus jede Bedingung.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> Abbildung 1: Analyse der synaptischen Puncta mit der Bildanalyse Software (A) Screenshot der Intensität Schwelle Protokoll Anpassung. Das Beispiel ist für PSD-95, in dem die ausgewählten Puncta haben eine definierte Größe der &#62; 0,1 µm 3 und &#60; 0,8 µm 3 und gegenwärtigen minimiert sich überlappende Objekte. Beachten Sie, dass das dargestellte Bild einer konfokalen Ebene um die einfacher Visualisierung der synaptischen Puncta und genaue Parameter-Auswahl zu ermöglichen. (B) Screenshot der Analyse von der Software (nach der Auswahl des optimierten Protokolls) ausgegeben. Ein Beispiel für rohe synaptischen Puncta Anzahl Messungen basierend auf dem Volume. Diese Werte werden dann in einem Tabellenkalkulations-Software exportiert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> Abbildung 2: Qualitäts-Check von der Scheibe und Parameter-Einstellungen für synaptische Puncta. (A) repräsentative konfokale Bilder (40 X Objektiv) der Region von Interesse: CA1 Stratum Radiatum (sr) und Stratum Oriens (so) einer hippocampal Scheibe sind gekennzeichnet von MAP2 Färbung. Maßstabsleiste = 2 µm. (B) konfokale Bilder (60 x Ziel und eine zusätzliche 1,3 X Vergrößerung auf der Datenerfassungs-Software) von CA1 Stratum Radiatum, mit erregenden Marker-vGlut1 (grün) und PSD-95 (rot)-von hippocampal Scheiben. Beachten Sie die Kennung des klaren Prä- und postsynaptischen Puncta. Puncta größer als 0,8 µm 3 sind von der Quantifizierung (weisse Pfeile) ausgeschlossen. Maßstabsleiste = 2 µm (C) Confocal Bilder (60 x Ziel und eine zusätzliche 1,3 X Vergrößerung auf der Datenerfassungs-Software) von CA1 Stratum Radiatum, mit erregenden Marker-vGlut1 (grün)-von Kryostat-Schnitt hippocampal Abschnitte vom gesamten Gehirn in PFA behoben. Beachten Sie die Anwesenheit von großen Löchern und unregelmäßigen, aufgehäuften vGlut1 Färbung. Maßstabsleiste = 2 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<ol><li>Malenka, R. C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+and+LTD%3A+an+embarrassment+of+riches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LTP and LTD: an embarrassment of riches.</a> Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).</li>
<li>Arendt, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19390859">Synaptic degeneration in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).</li>
<li>Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic cell adhesion.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694(2012).</li>
<li>Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+an+excitatory+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The architecture of an excitatory synapse.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).</li>
<li>Dobie, F. A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+synapse+dynamics%3A+coordinated+presynaptic+and+postsynaptic+mobility+and+the+major+contribution+of+recycled+vesicles+to+new+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation.</a> J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).</li>
<li>Jackson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tau+increases+amyloid+beta+plaque+size+but+not+amyloid+beta-mediated+synapse+loss+in+a+novel+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease.</a> Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).</li>
<li>Heck, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+automated+3D+detection+of+synaptic+contacts+reveals+the+formation+of+cortico-striatal+synapses+upon+cocaine+treatment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).</li>
<li>Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+levels+of+PSD95+and+two+associated+proteins+and+increased+levels+of+BCl2+and+caspase+3+in+hippocampus+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment%3A+Insights+into+their+potential+roles+for+loss+of+synapses+and+memory%2C+accumulation+of+Abeta%2C+and+neurodegeneration+in+a+prodromal+stage+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).</li>
<li>Harwell, C. S., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptophysin+depletion+and+intraneuronal+Abeta+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+from+huAPP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 44(2016).</li>
<li>Marzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+Synapse+Degeneration+by+Restoring+Wnt+Signaling+in+the+Adult+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus.</a> Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysfunction+in+neurodevelopmental+disorders+associated+with+autism+and+intellectual+disabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).</li>
<li>Janezic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficits+in+dopaminergic+transmission+precede+neuron+loss+and+dysfunction+in+a+new+Parkinson+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).</li>
<li>Caricasole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Dickkopf-1%2C+a+negative+modulator+of+the+Wnt+pathway%2C+is+associated+with+neuronal+degeneration+in+Alzheimer%27s+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain.</a> J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).</li>
<li>De Ferrari, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+genetic+variation+within+the+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+6+and+late-onset+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).</li>
<li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+LRP6-mediated+Wnt+signaling+contributes+to+synaptic+abnormalities+and+amyloid+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease.</a> Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).</li>
<li>Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Secreted+Wnt+Antagonist+Dickkopf-1+Is+Required+for+Amyloid+beta-Mediated+Synaptic+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss.</a> J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).</li>
<li>Rosi, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Dickkopf-1+expression+in+transgenic+mouse+models+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease.</a> J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).</li>
<li>Budnik, V., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+during+synaptic+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling during synaptic development and plasticity.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).</li>
<li>Ciani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+tunes+neurotransmitter+release+by+directly+targeting+Synaptotagmin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1.</a> Nat Commun. 6, 8302(2015).</li>
<li>Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnts+in+action%3A+from+synapse+formation+to+synaptic+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance.</a> Front Cell Neurosci. 7, 162(2013).</li>
<li>Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+in+neuronal+differentiation+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling in neuronal differentiation and development.</a> Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).</li>
<li>Galli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+Wnt+signalling+triggers+striatal+synaptic+degeneration+and+impaired+motor+behaviour+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice.</a> Nat Commun. 5, 4992(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die genaue Auswertung der Synapse Anzahl gilt auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Hier zeigen wir, wie die Dichte der Synapsen im Großraum CA1 Stratum Radiatum der hippocampalen Scheiben als Modellsystem zu bewerten. Die Bedeutung in Bezug auf bestehende Methoden wird in unserem jüngsten Forschungsartikel über die Wirkung der Wnt-Mangel im Hippocampus und wo wir auch Synapse Zahl ausgewertet durch einteiligen EM10gezeigt. Das Ausmaß des Verlustes der Synapse sind ähnlich zwischen einteiligen EM und die Gehirn-Scheibe hier beschriebenen Methode10. So zeigt dieses Ergebnis, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Technik.
Wichtig ist, ist eine Einschränkung des einteiligen EM und Immunostaining Synapsen, wie hier vorgestellt, die Unfähigkeit, genau zu schätzen, die absolute Synapse-Anzahl für eine bestimmte Gehirnregion. In der Tat ist es wichtig, jede globale morphologischen Veränderungen zu identifizieren, wie Veränderungen im Gesamtvolumen synaptischen Anzahl auswirken könnte. Eine weitere Einschränkung ist, dass bestimmte Antikörper bei Färbung intakt Hirnregionen, teilweise aufgrund der extremen Dichte von synaptischen Verbindungen weniger effizient sind. Wir haben erlebt, hochwertigere Färbung des vGlut1 und Gephyrin mit diesem Stück Vorbereitung und anschließende PFA Fixierung für maximal 1 h, im Vergleich zur sofortigen Fixierung des gesamten Gehirns in PFA (Abbildung 2). Letzteres führte zu aufgehäuften synaptischen Färbung, mit Löchern im Gewebe. Dennoch beschränkt sich die vGlut1 Antikörper Penetration noch bei beiden Methoden (ein paar zehntausend von Mikron). Wir diese Einschränkung nicht überwinden, sogar mit erhöhten Antikörper Inkubationszeit, sondern die die Antikörper-Penetration ist größer als die Gesamttiefe, die abgebildet ist, sollte keinen Einfluss auf das Endergebnis. Darüber hinaus sollte besondere Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass die Färbung auch während der gesamten erworbenen Stack ist.
In unserer Studie wollten wir unterscheiden exzitatorischen von hemmenden Synapsen. Daher wählten wir vGlut1/PSD-95 und vGAT/Gephyrin, bzw. wie diese Proteine im Hippocampus erwachsener Mäuse sehr ausgedrückt werden und sind spezifisch für jede Synapse Subtyp4,5. Weitere exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Marker könnte verwendet werden können, um jedes jeweiligen Synapse, wie Rezeptoren, die an jeder Synapse, einschließlich NMDA und AMPA-Rezeptoren für bereichert identifizieren exzitatorischen und GABAA-Rezeptoren für die hemmenden Synapsen. Andere Neurotransmitter und Neuromodulatoren können auch identifiziert werden, mit unserem Protokoll, um sicherzustellen, dass spezifische Antikörper verfügbar sind, da für dopaminerge Synapsen im Striatum22gezeigt. Darüber hinaus überwinden reduziert die Dicke der einzelnen Segmente bis 120 µm teilweise die geringe Menge an Proben mit akuten Scheiben, die unbedingt für Studien in kleinen Gehirnstrukturen wie der Amygdala.
Zukünftige Anwendungen unseres Protokolls konnte in der Studie der verschiedenen Gehirnregionen und Störungen umgesetzt werden. Zum Beispiel im Striatum (eine Region des Gehirns verbunden mit Parkinson-Erkrankung), eine Kombination von vGlut2/PSD-95 oder vGlut1/PSD-95 ließe sich der exzitatorischen Synapsen von Afferenzen aus dem Kortex oder Thalamus unterscheiden, bzw.22.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, eine zuverlässige Methode, um die Anzahl der Synapsen im Gehirn Gewebe mit Prä- und postsynaptischen Marker definieren eine Synapse zu untersuchen. Wichtige Schritte sind die Vorbereitung gute hippocampal Scheiben einer Fixierzeit von bis zu 1 h in PFA, die Anwendung genügend Eindeckmedium, den Einsatz von zuverlässigen Antikörper, entsprechenden Bildeinstellungen Erwerb und strengen synaptischen Puncta Erkennung. Letztlich ist diese Methode ist relativ schnell und leicht reproduzierbar ist, indem alle Laboratorien, die Zugang zu einem confocal Mikroskop haben.

Das menschliche Gehirn besteht aus ca. 1014 Synapsen. Synapse ist eng in die Entwicklung und Reifung des zentralen Nervensystems (ZNS) geregelt. Während der gesamten Entwicklung Anzahl der Synapse moduliert von Synaptogenese und beschneiden, funktioneller neuronaler Netzwerke zu bilden. Lernen und Gedächtnis werden durch die Verordnung der Synapse Anzahl und Stärke, ein Prozeß bekannt als synaptische Potenzierung und Depression1unterstützt. Wichtig ist, ist die Stabilisierung der Reife Synapsen unerlässlich für die Aufrechterhaltung der neuronalen Netzwerk-Verbindungen. Darüber hinaus wurden Defizite in der Synapse Dichte in den frühen Stadien von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD)2gemeldet. Daher ist die Fähigkeit, genau zu identifizieren und zu bewerten Synapse Anzahl grundlegender Bedeutung für die Beurteilung der Gehirnphysiologie und Pathologie.
Die extreme Dichte und kompakte Art der Synapsen machen es schwierig, um ihre genaue Zahl in intakten Hirnareale zu schätzen. Chemische Synapsen im ZNS bestehen aus zwei Neuronen in enge Apposition, getrennt durch eine synaptic cleft3. Die präsynaptischen Terminal oder synaptische Bouton, ergibt sich aus einem Axon und besteht aus angesammelten Vesikel, die Neurotransmitter enthalten, die die Besonderheit einer Synapse zu definieren – nämlich, Glutamat und Gamma - Aminobuttersäure (GABA) für exzitatorische und hemmende Synapsen, beziehungsweise. Die Membranen der Vesikel enthalten vesikuläre Transporter spezifisch für jedes Neurotransmitter: vesikuläre Glutamat Transporter (vGlut) für Glutamat und vesikuläre GABA-Transporter (vGAT) für GABA. Die postsynaptischen Terminal ist eine sehr dichte Struktur, bestehend aus mehreren Proteinen, einschließlich Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle und Gerüst Proteine. In exzitatorischen Synapsen ist postsynaptischen Dichte-95 Protein (PSD-95) das am häufigsten vorkommende Gerüst Protein4, modulierenden erregenden N-methyl-D-aspartate(NMDA-) und α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Säure (AMPA)-Rezeptor funktionieren Sie, während Gephyrin inhibitorische Rezeptoren an der inhibitorischen postsynaptischen Klemme5verankert. Insgesamt, die Spezifität der Proteine zu prä- und postsynaptischen Fächer Beihilfen in der Differenzierung und Identifikation von Synapse-Subtypen.
Die Auswertung der Synapse Zahl kann mit verschiedenen Techniken durchgeführt werden. Am weitesten verbreitet ist der Einsatz der Elektronenmikroskopie (EM), die die Analyse der Synapse in kompakter und intakte Hirnareale mit hoher Vergrößerung und Auflösung ermöglicht. Aber diese Technik ist sehr teuer, erfordert komplizierte Probenvorbereitung und ist sehr zeitaufwendig. Andere Techniken umfassen die Verwendung von Array-Tomographie6, was einen großen Nachteil ist, dass es spezielle und teure Ausrüstung erfordert um die Analyse durchzuführen. Darüber hinaus transgene Linien mit dem Ausdruck spezifischer synaptischen Marker eignen sich Bewertung Synapse Nummer7, aber die Generation der neuen Linien kann restriktive und kostspielig sein, und die Überexpression von Proteinen kann zu unerwünschten Ziel führen Phänotypen.
Aufgrund dieser Einschränkungen und der Einfachheit halber bewerten viele Forscher Synapse Anzahl durch die Untersuchung insgesamt synaptischen Protein-Ebene. Synapse Verlust kann jedoch als strukturelle synaptischen Umbau Ergebnisse in die Zerstreuung der Pre- oder Post-synaptische Apposition, keine Verschlechterung der synaptischen Proteine vor erhebliche Änderungen im Protein, beobachtet werden. Darüber hinaus sind in AD, synaptischen Protein-Ebene reduzierten folgende Synapse Degeneration oder neuronalen Tod8,9. Die Quantifizierung der gesamten Ebenen ermöglicht es diese Unterscheidung nicht. So gibt es eine Notwendigkeit, eine zuverlässige, zugänglich und genaue Methode für die Bewertung der Anzahl der Synapsen im Gehirn zu entwickeln.
In diesem Artikel beschreiben wir wie Sie gründlich ermitteln und bestimmen Sie die Anzahl der Synapsen mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben. Die Synapsen sind durch die NS1 der Prä- und postsynaptischen Marker definiert, die in eine punktförmige Verteilung angezeigt. Wir zeigen die Gültigkeit dieser Technik durch das Studium der Wnt signalisieren in das Gehirn. Wnts sind wichtig für die Bildung, die Beseitigung und die Wartung von Synapsen sekretierten Proteine. Die in Vivo -Induktion des sekretierten Antagonisten der Wnt Kaskade, Dickkopf-1 (Dkk1), führt zu erregenden synaptischen Verlust unter Beibehaltung der hemmende Synapsen in der Hippocampus-10. Wir zeigen die Identifikation und Graf von erregenden und hemmenden Synapsen im Hippokampus Scheiben aus einer erwachsenen Maus mit dem Ausdruck Dkk1 und markieren Sie die Übertragbarkeit dieser Technik auf andere Arten von Gewebekultur/Vorbereitungen.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5905</td><td>vGlut1 (1:2000)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-046</td><td>PSD-95 (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>131 004</td><td>vGAT (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>147011</td><td>Gephyrin (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>MAP2 (1:10000)</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Jackson Laboratories</td><td>706-545-148</td><td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab175470</td><td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>SouthernBiotech</td><td>00-4958-02</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>PerkinElmer</td><td>NA</td><td>Volocity</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>203</td><td>No 11</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td>1446875</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BOC</td><td>NA</td><td>Cylinder</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Thermo</td><td>7107</td><td>08-1.0mm thick</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>iDkk1 mice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&amp;alpha; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&amp;alpha; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for solutions:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Ca&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Mg&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma</td><td>K3375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid</td><td>Sigma</td><td>107360</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Millipore</td><td>S30-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

Im Gehirn sind Synapsen spezialisierte Verbindungen zwischen den Neuronen, Bestimmung der Stärke und Ausbreitung der neuronalen Signalisierung. Die Anzahl der Synapsen ist während der Entwicklung und neuronale Reifung streng reguliert. Wichtig ist, können Defizite in der Synapse Anzahl zu kognitiven Dysfunktion führen. Daher ist die Bewertung der Synapse Anzahl Bestandteil der Neurobiologie. Wie Synapsen im intakten Gehirn klein und sehr kompakt sind, ist die Beurteilung der absoluten Zahl jedoch anspruchsvoll. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um leicht erkennen und bewerten Sie Synapsen im Hippokampus Nagetier Scheiben mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Freuen Sie sich auf eine drei-Schritt-Verfahren um Synapsen im konfokalen Mikroskopie qualitativ hochwertige Bilder zu bewerten, durch die Analyse der Co Lokalisierung der Prä- und postsynaptischen Proteine in hippocampal Scheiben. Es erklärt auch, wie die Analyse durchgeführt wird und repräsentative Beispiele von erregenden und hemmenden Synapsen. Dieses Protokoll stellt eine solide Grundlage für die Analyse von Synapsen und kann auf jede mögliche Forschung untersucht die Struktur und Funktion des Gehirns angewendet werden.

Synapse Verlust tritt früh bei neurodegenerativen Erkrankungen wie AD und der Parkinson-Krankheit2,11,12. Die molekularen Mechanismen, die diese Defizite bleiben jedoch schlecht verstanden. Mängel bei der Wnt Signalisierung wurden mit AD13,14,15,16,17. Wnts sind sekretierten Glykoproteine und spielen eine wesentliche Rolle bei der Bildung von Synapsen und die Modulation des synaptischen Übertragung18,19,20,21. Vor kurzem haben wir als wichtige Regulatoren der synaptischen Wartung in den Reifen Nervensystem10,22Wnts identifiziert. Um die Auswirkungen der Wnt signalisieren auf Synapsen im Hippocampus von genetisch veränderten Mäusen genau zu studieren, nutzten wir ein Gehirn Slice Vorbereitung und konfokalen Mikroskopie Veränderungen in Synapse zu bewerten. Wir identifizierten gesunde Scheiben, in denen die Struktur gut war, erhalten (Abbildung 2A). Darüber hinaus wurde die Auswahl der synaptischen Puncta sorgfältig definiert, mit Ausnahme von großen gefärbten Objekten, die wahrscheinlich die aggregierte Proteine (Abb. 2 b). Dieses Kriterium wurde auf alle Bilder mit den gleichen strengen Analyseparametern angewendet.
Wir verwendeten eine transgene Modellsystem, die den Ausdruck des sekretierten Wnt Antagonisten Dkk1 bei Erwachsenen induziert Mäuse (iDkk1) unter Tetracyclin kontrollieren (siehe die Tabelle der Materialien)10,22. Wir zeigten, dass die Blockade der Wnt signalisieren in den Erwachsenen Hippocampus exzitatorischen Synapse Verlust in der CA1 Stratum Radiatum Region (Abbildung 3) auslöst. Abbildung 3A zeigt repräsentative konfokale Bilder der exzitatorischen Prä- und postsynaptischen Marker (vGlut1 und PSD-95, beziehungsweise) gewonnenen hippocampal Scheiben iDkk1 Mäuse mit dem Ausdruck Dkk1 für zwei Wochen, sowie ihre jeweiligen Steuerelemente. Wir haben diese Bilder mit Volocity-Software analysiert und zeigte eine signifikante Verringerung der Zahl der exzitatorischen Synapsen, quantifiziert durch die Co Lokalisierung des vGlut1 - und PSD-95-Label Puncta in der CA1-Region des Hippocampus iDkk1 Mäusen nach der Induktion von Dkk1 für zwei Wochen (Abbildung 3 b, * p &#60; 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 6 Mäuse pro Genotyp). In CA1 Stratum Radiatum reduzierte sich die erregenden Synapse Puncta Anzahl pro 1.000 µm3 von 500 im Kontroll-Mäusen bis 300 bei iDkk1 Mäusen. Im Gegensatz dazu induzierte Dkk1 Ausdruck hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der hemmenden Synapsen (gekennzeichnet durch die Co Lokalisierung zwischen den Prä- und postsynaptischen Marker vGAT und Gephyrin, beziehungsweise), wie in Abbildung 4A-B gezeigt (p &#62; 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 3 Mäuse pro Genotyp).
Wichtig ist, führten wir eine statistische Aussagekraft-Analyse, um die entsprechende Anzahl von Scheiben und Tieren benötigt, um diese robuste Ergebnisse generieren zu schätzen. Mit R, wir berechnet, dass etwa 35 Scheiben pro Zustand benötigt wurden (3 Bilder X 3 Scheiben X 6 Tiere = 36), eine große Effektgröße zu erkennen (f = 0,4) mit 80 % Vertrauen (Kraft = 0,8) in eine einfache ANOVA mit Blockierung und Replikation, wie in beschrieben Schritt 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Verlust von exzitatorischen Synapsen in hippocampal Scheiben aus iDkk1 Mäuse. (A) repräsentative konfokale Bilder der CA1 Stratum Radiatum Show exzitatorischen Synapsen, identifiziert durch Co Lokalisierung zwischen vGlut1 und PSD-95 (weisse Pfeile). Der untere Bereich repräsentiert eine höhere Vergrößerung des markierten Rechtecks. Skalieren von Balken = 2 µm. (B) der Anteil der exzitatorischen Synapsen zwischen Kontrolle und iDkk1 wurde quantifiziert mit Software, die in Tabelle Materialien erwähnt (* p &#60; 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 6 Mäuse pro Genotyp). Die Daten sind vertreten ± SEM Diese Zahl wurde von Referenz10geändert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Abbildung 4: hemmende Synapsen sind unverändert im Hippokampus Scheiben aus iDkk1 Mäuse. (A) repräsentative konfokale Bilder von CA1 Stratum Radiatum hemmenden Synapsen durch die Co Lokalisierung zwischen vGAT und Gephyrin (weisse Pfeile) identifiziert. Der untere Bereich repräsentiert eine höhere Vergrößerung des markierten Rechtecks. Skalieren von Balken = 2 µm. (B) Prozentsatz der hemmenden Synapsen zwischen Kontrolle und iDkk1 Mäuse, wie quantifiziert mit Volocity Software (p &#62; 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 3 Mäuse pro Genotyp). Die Daten sind vertreten ± SEM Diese Zahl wurde von Referenz10geändert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hohen Saccharose ACFS Komponenten</td>
			<td>Konzentration</td>
			<td>Notizen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nahco33</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Säure</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brenztraubensäure Säure</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Nach Sauerstoffversorgung der Lösung hinzufügen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Nach Sauerstoffversorgung der Lösung hinzufügen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versunkene Kammer ACFS Komponenten</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nahco33</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Nach Sauerstoffversorgung der Lösung hinzufügen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Nach Sauerstoffversorgung der Lösung hinzufügen</td>
		
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tabelle 1: ACFS Zusammensetzung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blockierung/permeabilizing Puffer</td>
			<td>Konzentration</td>
			<td>Notizen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esel-serum</td>
			<td>10 %</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>0,50 %</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH auf 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1,37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % PFA/4% Saccharose</td>
			<td></td>
			<td>pH auf 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>Verdünnen von 10 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1,33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Puffer für immunofluorescent Färbung verwendet.

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Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K Aufrufe.  University College London. Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.

Serie: Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

<meta charset="utf8"></head><body>Messung der Glutamataufnahme mit radioaktiv markiertem L-[3H]-Glutamat in akuten Querschnitten aus dem von Nagetieren resezierten Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Messung der Glutamataufnahme mit radioaktiv markiertem L-[3H]-Glutamat in akuten Querschnitten aus dem von Nagetieren resezierten Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Biochemie

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Minimierung der Hypoxie in Hippocampal Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

<meta charset="utf8"></head><body>Vorbereitung von akuten Hirnschnitten aus dem dorsalen Pol des Hippocampus von erwachsenen Nagetieren

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Vorbereitung von akuten Hirnschnitten aus dem dorsalen Pol des Hippocampus von erwachsenen Nagetieren

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

Zusammenfassung

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Messung der Glutamataufnahme mit radioaktiv markiertem L-[³H]-Glutamat in akuten Querschnitten aus dem von Nagetieren resezierten Hippocampus

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Vorbereitung von akuten Hirnschnitten aus dem dorsalen Pol des Hippocampus von erwachsenen Nagetieren

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Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

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