Diese Arbeit wurde von der Universität Basel, Departement Biomedizin, und dem Schweizerischen Nationalfonds (31003A_141007) unterstützt. Markus Saxer leistete technische Unterstützung.

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie vom 22. September 2010 des Rates durchgeführt (2010/63 / EU) und wurden überprüft und durch die Schweizer Behörden zugelassen. 1. Einrichten Organotypische Entorhino-Hippocampus-Schnittkulturen <ol><li> Bereiten entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen (EHOSCs) von postnatalen Tag 4 (P4) Maus Welpen mit der statischen Methode Inkubation 4,11. Hier verwenden C57Bl6 und CB6F1 Mäusen. <ol><li> Nehmen Sie etwa 30 min pro Maus Welpen zur Herstellung von Schnittkulturen, dh 3 Stunden für einen Wurf von 6 Welpen Maus. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Werkbank mit sterilisierten chirurgischen Instrumenten. </li><li> Um eine mögliche Störung von der Position der Scheibe entlang der Zeitachse-septo zu vermeiden, nur Hippocampus des medialen Hälfte. Wenn nicht anders angegeben, führen alle Schritte bei RT. </li></ol></li><li> Abgeschnitten ter Kopf eines P4 Maus Welpe mit chirurgischer Schere. Keine Betäubung für diesen Schritt erforderlich. <ol><li> Entfernen Sie den Schädel rund um das Gehirn und Identifizierung der Riss zwischen dem kaudalen Ende der Großhirnhemisphären und des Mittelhirns. Den Teil des Gehirns, rostral sorgfältig zu entfernen, um das Mittelhirn aus dem Schädel und legen Sie sie in eiskaltem Präparationsmedium, bestehend aus MEM mit einer stabilisierten Form von L-Glutamin. </li></ol></li><li> Fahren Sie mit der Präparation unter einem Stereomikroskop mit dem Gehirn in der eiskalten Herstellungsmedium eingetaucht. Entfernen Sie verbleibende Hirnhäute aus den kortikalen Hemisphären. Identifizierung der Hippocampus auf der medialen Schwanzfläche der Halbkugel und trennen sie zusammen mit dem benachbarten entorhinalen Kortex vom Rest des Gehirns. <ol><li> Übertragen Sie das Gewebe bis zu einer Gewebe Chopper und geschnitten 400 um dicke Scheiben unter aseptischen Bedingungen quer zur septo-zeitliche Achse des Hippocampus. </li></ol></li><li> Legen Sie die Scheiben auf cell Kultureinsätzen (ca. 6 Scheiben pro Platte) und inkubieren sie in 6-Well-Platten mit 1 ml pro Vertiefung Inkubationsmedium (47 ml MEM, 25 ml Eagle-Medium, 25 ml Pferdeserum, 1 ml Glutamax I, 1 ml einer sterile 10% Glucose-Lösung, pH 7,3) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C aufweist. Ändern Sie den nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag bis zu 1 Woche das Medium. </li></ol> 2. In-vitro-Hypoxie und Sauerstoff-Glukose-Entzug mit Reperfusion <ol><li> Siehe Tabelle 1 für eine genaue Zeitplan des Verfahrens. Kultur EHOSCs für 5 Tage (DIV5) vor der Einwirkung von Hypoxie oder OGD. Zu diesem Zeitpunkt schaltet das Medium vom Inkubationsmedium, enthaltend 25% Pferdeserum-freiem Medium mit der folgenden Zusammensetzung Serum: Neurobasalmedium mit 2% B27 Supplement, 1% Glutamax und zusätzlich 0,1% Glucose. </li><li> Bereiten Sie die OGD Medium wie in Referenz 7 .Der endgültigen Konzentrationen der Komponenten detailliert beschrieben wird, die folgenden: 0.3mM CaCl 2, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO 3, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4 und 10 mM Saccharose bei pH 6,8. 1 ml der OGD Medium zu jeder Vertiefung von zwei 6-Well-Gewebekulturplatten. <ol><li> Versorgen die OGD-Medium mit N 2 für 1 Stunde in einem Hypoxie Kammer und dann versiegeln und zu halten O / N in einem Brutschrank bei 37 ° C. </li><li> Verwenden anaeroben Streifen als hypoxischen Indikatoren. Betrachten des Mediums, um sauerstofffrei sein, wenn die Farbe der Streifen geändert von rosa bis weiß. </li><li> Für die Induktion von Hypoxie, verwenden Serum-freiem Medium mit Glukose statt OGD Medium. Vor der Verwendung zur Perfusion des Mediums mit N 2 in einer Hypoxie Kammer wie oben für OGD Medium beschrieben. </li></ol></li><li> Bevor die Scheiben auf OGD ausgesetzt ist, versorgen die OGD Medium wieder mit N 2 für 30 min. Add 2 ul einer 1 mg / ml Propidiumiodid (PI)-Lösung pro Vertiefung (bei einer Endkonzentration von 2 ug / ml) mit den Scheiben für 30 min und wählennur gesunde Scheiben für Experimente wie die geringen Zahlen der PI-positiven Zellen angegeben. </li><li> Verwenden Sie den Zeitplan für die OGD-Exposition und Reperfusion in Abbildung 1 angegeben. Berauben Scheiben entweder Sauerstoff nur (Hypoxie) oder Sauerstoff und Glukose (OGD) für 15 min. <ol><li> Für die Induktion der Hypoxie oder OGD, übertragen Scheiben in OGD Medium und halten Sie für 15 Minuten in der Kammer Hypoxie. Sicherstellen, dass alle Flüssigkeiten, die an den Seiten des Einsatzes bleiben weg abgesaugt wenn die Kulturen von normalen Medium OGD Medium und zurück geschaltet. </li><li> Nach Hypoxie oder OGD, ersetzen Sie die OGD Medium mit sauerstoff Serum-freiem Medium und Kulturen dürfen für 3, 24 oder 48 Stunden in Serum-freiem Medium in der regulären Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 zu erholen. PI hinzuzufügen wieder vor der Fixierung für die Bestimmung von Zelltod. </li></ol></li></ol> 3. pharmakologische Behandlungen von Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen <ol><li> CulturE EHOSCs für 5 Tage (DIV5) in Inkubationsmedium vor der Belichtung mit pharmakologischen Behandlungen. Starten pharmakologische Behandlungen entweder während oder unmittelbar nach der OGD OGD, wenn Scheiben, um Serum freien Medium übertragen. </li><li> Behandlungen zum Schutz vor OGD. <ol><li> Mit 100 uM 6-Cyano-7-nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX) und 1 uM Tetrodotoxin (TTX) zu dem Kulturmedium während der Induktions OGD (für 15 min) oder unmittelbar nach OGD Induktion für 30 min. Dann, Inkubation in normoxischen Serum freien Medium für 48 Stunden vor der Fixierung. </li></ol></li><li> Behandlungen für die Induktion von exzitotoxische Tod. <ol><li> Nach 5 Tagen in Inkubationsmedium Schalter Kulturen freien Medium, das 100 um (RS) -α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) 30 min Serum. </li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium mit AMPA durch Aspiration (Vorsicht, um restliche Medium, auf Einsätze zu entfernen), dann übertragen Sie die Scheiben auf frische Platten mit normalen Serum-freiem Medium undhalten sie für 48 Stunden, bis Fixierung. </li></ol></li></ol> 4. Fixierung und Immunfärbung von Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen <ol><li> Propidiumiodid (PI)-Färbung. <ol><li> Hinzufügen PI für 30 min in das Kulturmedium von lebenden Scheiben in einer Konzentration von 2 ug / ml. Live-View-Kulturen, die mit einem inversen Mikroskop mit Fluoreszenz-Optik ausgestattet und wählen Scheiben für weitere Behandlungen. Für eine PI-Färbung in Kombination mit Immunhistochemie, fügen PI-Lösung 30 min vor der Fixierung der Kulturen. </li></ol></li><li> Fixierung der Scheiben. <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium aus der 6-Well-Platte und 3 ml frisch zubereiteten 4% Paraformaldehyd (PFA) in jede Vertiefung. Dann legen Sie die 6-Well-Platte in einem Kühlschrank und fixieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die PFA-Lösung am nächsten Tag und waschen die Scheiben 3-4 mal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). </li></ol></li><li> Entfernen der Scheiben aus dem Zellkultur insert und Blockierverfahren für die Immunhistochemie von frei schwebenden Abschnitte. <ol><li> Vorsichtig lösen und entfernen Sie die Scheiben von den Kulturplatten mit Hilfe eines Kunst Pinsel der Größe 0 oder kleiner. Übertragen jedes einzelne Stück in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit Blockierungspuffer (PBS mit 3% normalem Ziegenserum (NGS) und 2% Triton-X100) gefüllt. Halten der Scheiben in Blockierungspuffer für 2 h bei RT unter ständigem Rühren mit einem Orbitalschüttler. </li></ol></li><li> Immunfärbung der Schnittkulturen <ol><li> Für die Markierung der Blutgefäße verwenden polyklonalen Anti-Laminin in einer Verdünnung von 1: 200 in PBS mit 1% NGS und 0,5% Triton-X100. </li><li> Zur Markierung Neuronen verwenden anti-Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2) in einer Verdünnung von 1: 500 in PBS mit 1% NGS und 0,5% Triton-X100. </li><li> Die Scheiben mit primären Antikörpern für 48 Stunden Inkubieren bei 4 ° C unter konstantem Rühren. Nach der Inkubationszeit, waschen Sie sie in PBS mit 0,5% Triton-X100 für 3-4 mal. </li&gt; <li> Verdünnte sekundäre Antikörper 1: 500 in PBS, 1% NGS und 0,5% Triton-X100. Bebrüten die Scheiben für 2 h bei RT im Dunkeln mit den Alexa Fluorophor konjugiert Sekundärantikörper. Verwenden Sie die entsprechende Ziege-Anti-Kaninchen-oder Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper Alexa 350 oder 488 konjugiert. </li><li> Entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung und waschen die Scheiben dreimal mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS); montieren sie auf Glasobjektträger und Deckglas die Folien mit Mowiol. </li></ol></li><li> Mikroskopie der gefärbten Scheiben </li><li> Informieren Sie sich über die gefärbten Scheiben entweder auf einem Standardmikroskop mit Epifluoreszenz Ausrüstung oder mit einem konfokalen Mikroskop. Nehmen Sie Bilder mit einer geeigneten Kamera. Für einige Bilder, invertieren die Fluoreszenzkontrast, um dunkel gefärbte Gefäße auf einem hellen Hintergrund zu erhalten (5 und 6). </li></ol> 5. Bestimmung der regionalen Gefäßdichte in den Kulturen <ol><li> Quantifizierung der vessel Dichte basierend auf Schiff Gänge wie im Referenz 8 beschrieben. </li><li> Verwenden Scheiben für Laminin für diese Messungen gefärbt. Lagern aufgezeichneten Bilder der 10-facher Vergrößerung mit einem 6 x 6 Raster, wobei jedes Gitter gleich 100 x 100 um pro Quadratmeter, Gesamtfeld von 0,25 mm 2 ist. </li><li> Overlay drei solcher Netze in der CA1-Region, CA3, DG, und EG (Abbildung 2). Zählen Sie die Schiffe überqueren die Linien des Gitters. </li><li> Für den Erhalt einer guten Ergebnisse mit statistischer Relevanz, machen Messungen in mindestens 3 unabhängigen Experimenten, die jeweils Daten von drei Welpen Maus mit 3 Scheiben pro Maus Welpen. </li><li> Bestimmen Sie den Mittelwert des Schiffes Übergänge von den Gittern für jede Region und führen eine statistische Analyse durch ANOVA mit Bonferroni-Korrektur als Post-hoc-Test (p &lt;0,05 definiert als signifikant) mit entsprechenden Statistik-Software. </li></ol>

<ol>
	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures:+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors.">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li><li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4,+GDNF,+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase.">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li><li>Rytter, A., Cronberg, T., Aszt&#233;ly, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+&#8216;ischemia&#8217;+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose.">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro &#8216;ischemia&#8217; show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li><li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice:+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier.">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li><li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death.">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie vom 24. November 1986 (86/609 / EWG) durchgeführt und wurden von Schweizer Behörden überprüft und zugelassen. Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mit den hier vorgestellten Methoden kann Hippocampus organotypischen Schnittkulturen als vielseitiges Werkzeug zur plastischen Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu untersuchen. Während organotypischen Kulturen haben in der Vergangenheit für die Untersuchung der neuronalen Reaktionen nach Ischämie 6, 7 der neuen Aspekt der gleichzeitigen Untersuchung von Gefäßveränderungen verwendet wurde erheblich erweitert die Anwendungsmöglichkeiten dieser Methode. Die Induktion der OGD oder Hypoxie al...

Das Zentralnervensystem ist besonders empfindlich gegenüber einem Verlust oder Reduktion von Sauerstoff und Glucose durch die Gefäßversorgung. Selbst eine eher kurze Unterbrechung der Blutversorgung des Gehirns kann einen dauerhaften Verlust der Funktion der jeweiligen Hirngebiete, die zu den typischen Hub-Syndrome zu induzieren. Zusätzlich zu dem Verlust von Nervenzellen in den primären betroffenen Gebieten gibt es typischerweise zusätzliche verzögerten neuronalen Verlust durch Sekundärschäden. Leider bis jetzt keine neuroprotektive Behandlung zur Verringerung von Sekundär neuronalen Tod verfügbar war 1. Forschungsanstrengungen zur Untersuchung der Mechanismen der Sekundärschäden auf der Verwendung von Tiermodellen der zerebralen Ischämie wie mittleren Hirnarterie Okklusion und verschiedenen thrombotischen Verschluss Techniken beruhen (eine aktuelle Übersicht siehe 2). Parallel auch aufgrund von Einschränkungen und ethische Bedenken bei der Verwendung von Tiermodellen, organotypischen Kultur der verschiedenen ZNS-Gewebe verwendet wurden, die die stu ermöglichendy der neuronalen Reaktionen auf verschiedene Art der Verletzungen 3-5. Für die Untersuchung der neuronalen Reaktion unter Bedingungen, die ischämische Gehirnverletzung zu imitieren, ist das Modellsystem von Sauerstoff Glukose Deprivation (OGD) entwickelt. In diesem Modell werden die Schnittkulturen vorübergehend auf einem Medium, das Glucose mangelt und wurde mit Stickstoffgas in der Abwesenheit von Sauerstoff ausgesetzt, äquilibriert worden. Bei einer solchen Behandlung ist es möglich, neuronaler Verletzung und der Verlust der eher ähnlich dem nach ischämischer Verletzung in vivo 6, 7 beobachtet induzieren. Im Hippocampus, induziert eine derartige Behandlung neuronaler Verluste insbesondere in der CA1, aber nicht in der CA3-Bereich oder dem Gyrus dentatus des Hippocampus. Im Gegensatz dazu ist die Untersuchung des vaskulären Reaktionen in Schnittkulturen bisher nicht weit verbreitet durchgeführt. Ein offensichtlicher Grund ist der Mangel an Durchblutung und Gefäßdurchblutung in der Schnittkultur-Modell. Allerdings haben wir früher gezeigt haben, dass es möglich ist, b zu erhaltenlood Gefäße im ZNS Schnittkulturen für mehrere Tage 8, 9. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, um das Schicksal von Neuronen nach OGD nicht nur überwachen, sondern erstrecken sich die Studie mit dem Schicksal und den Umbau des Gefäßsystems, die ein wichtiger Teil der Schädigung Antwort ist. Bis jetzt solche Studien haben die Verwendung von Tierversuchen erforderlich (. De Jong et al, 1999; Cavaglia et al., 2001). In der hier vorgestellten Protokoll, werden wir detailliert, wie solche Studien können in entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen getan werden herausgefordert, entweder mit Hypoxie oder durch exzitotoxische Läsionen gefolgt von der Analyse der beiden neuronalen Überleben und Blutgefäßreaktionen. Dieses Protokoll basiert auf einer zuvor veröffentlichten Studie zu diesem Thema 10 und kann nützlich für jedes Labor interessiert neurovaskulären Wechselwirkungen im ZNS sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11012-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>stabilized form of L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millicell cell culture inserts</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Basal medium Eagle&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anaerobic strips</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">59886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AMPA</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td>0169-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CNQX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">0190/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TTX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">1078/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">polyclonal anti-laminin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab11267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Statistics software</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">GraphPad Prism</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hypoxia chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td style="width:119px;">MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

Ischämischen Hirnverletzung ist eine der häufigsten und schwersten Bedingungen Kompromisse ordnungsgemäße Funktion des Gehirns und führt zu anhaltenden funktionellen Defiziten in den betroffenen Patienten oft. Trotz intensiver Forschungsanstrengungen, gibt es noch keine wirksame Behandlungsmethode verfügbar, die neuronale Verletzung reduziert und schützt Neuronen in den ischämischen Bereichen von verzögerten Sekundär Tod. Forschung in diesem Bereich umfasst typischerweise die Verwendung von aufwendigen und problematischen Tiermodellen. Entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen mit Sauerstoff und Glukose Deprivation (OGD) in Frage gestellt werden in vitro Modelle, die zerebrale Ischämie imitieren etabliert. Der neuartige Aspekt der vorliegenden Studie ist, dass Veränderungen der Gehirnblutgefäße neben neuronalen Veränderungen und die Reaktion sowohl des neuronalen Raum und dem vaskulären Kompartiment untersucht verglichen und korreliert werden. Die in diesem Protokoll vorgestellten Verfahren die möglichen Anwendungen der wesentlichen verbreitern oderganotypic Schnittkultur-Ansatz. Die Induktion der OGD oder Hypoxie allein durch relativ einfache Mittel in organotypischen Kulturen angewendet werden und führt zu einer zuverlässigen und reproduzierbaren Schäden im Nervengewebe. Dies steht in krassem Gegensatz zu den komplizierten und problematischen Tierversuche Induktion Schlaganfall und Ischämie in vivo. Durch die Erweiterung der Analyse auf die Untersuchung der Reaktion des Gefäßsystems könnten neue Möglichkeiten auf, wie die Erhaltung und Wiederherstellung Hirnfunktionen bereitzustellen. Die Schnittkultur hier vorgestellte Ansatz könnte zu einem attraktiven und wichtigen Werkzeug für die Untersuchung der ischämischen Hirnschädigung entwickeln und könnte nützlich für die Prüfung potenzieller therapeutischer Maßnahmen auf die Neuroprotektion angestrebt werden.

Sauerstoff Glukose Deprivation und Hypoxie induzieren neuronalen Tod und Gefäßreduktion insbesondere im Hippocampus CA1-Region. OGD oder Sauerstoffentzug allein für 15 Minuten führte zu einer starken Induktion von Zelltod durch Propidiumiodid-Färbung spezifisch in der CA1-Region des Hippocampus (Figur 3) gesehen, ähnlich wie zuvor beschrieben 7. Mit den Markierungen von Blutgefässen zu visualisieren, wurde festgestellt, dass der Blutgefäßdichte und Organisation erschi...

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The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Aufrufe.  University of Basel.  Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren. 

Serie: The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...