Das hier vorgestellte Protokoll verringert übermäßige hypoxische Schäden bei der Vorbereitung von hippocampuslen Scheiben der Erwachsenen und der alternden Maus, wodurch ein großes Hindernis für die Untersuchung der Funktion reifer und alternder neuronaler Schaltkreise beseitigt wird. Die Einführung der Hypothermie in natriumfreien Lösungen führt zu Hippocampusscheiben, die bis zu 10 Stunden nach dem Schneiden gesund sind und sowohl für die Langzeit-Feldaufnahmen als auch für Patch-Clamp-Studien geeignet sind. Diese Methode zur Herstellung von Hippocampus-Scheiben könnte besonders für Tiermodelle bei neurodegenerativen Erkrankungen relevant sein, die per definitionem eine alternde Gehirnpräparation erfordern.
Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Einführung von Hypothermie über transkardiale Profusion mit einer eiskalten Lösung. Mit einigen Praktiken werden Forscher in der Lage sein, diesen Schritt zuverlässig auszuführen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Liters einer CSF-Lösung für die Rückgewinnungskammer und nachfolgende Aufnahmen.
Dann bereiten 300 Milliliter NMDG-aCSF für die transkardialen Überfluss- und Schneidschritte vor. Legen Sie das vibrierende Mikrotom-Schneidtablett und die Montagescheibe in einen Gefrierschrank von minus 20 Grad Celsius. Um die Rückgewinnungskammer vorzubereiten, füllen Sie sie bis knapp über der Scheibe, die Mesh hält, und starten Sie die Blase, die die Kammer auf der Bank bei Raumtemperatur hält.
Kühlen Sie die gesamten 300 Milliliter NMDG-aCSF in einem Gefrierschrank ab, bis sich Eiskristalle an der Oberfläche und an den Wänden der Flasche zu bilden beginnen. Die Flasche mit gekühltem und NMDG-aCSF auf Eis legen und blasen, wobei die Lösung zwischen null und zwei Grad Celsius bleibt. Nehmen Sie die Gewebemontagescheibe aus dem Gefrierschrank und wischen Sie sie bei Bedarf trocken.
Schneiden Sie einen Block von 5%Agar über die Größe eines Mausgehirns aus und kleben Sie ihn in der Mitte der Scheibe mit einer dünnen Schicht Cyanoacrylatkleber. Legen Sie die Scheibe mit geklebtem Agar auf Eis und bedecken Sie sie mit Papiertüchern, bis sie einsatzbereit ist. Nehmen Sie die Schneidschale aus dem Gefrierschrank, legen Sie sie in das Mikrotom, dann umgeben Sie es mit Eis und laden Sie die Klinge.
Bereiten Sie alle Werkzeuge im Voraus für die Gehirnsektion vor. Richten Sie die peristaltische Pumpe für die transkardiale Perfusion ein. Legen Sie eine Seite des Pumpenschlauchs mit vereistem NMDG-aCSF in die Flasche ein und passen Sie die andere Seite mit einer 27-Spur-Nadel an.
Stellen Sie die Pumpendrehzahl auf ca. 3,5 Milliliter pro Minute ein. Bei dieser Geschwindigkeit ist der Abfluss eines NMDG-aCSF eine schnelle Fahrt, kein kontinuierlicher Fluss. Legen Sie die Maus auf den Rücken auf eine Windel.
Bevor Sie fortfahren, bestätigt, dass die Maus auf einer chirurgischen Ebene der Anästhesie durch die Durchführung einer Zehenprise. Die Maus sollte nicht ansprechbar sein, dann ihre Vorder- und Hinterbeine heruntergeklebt, so dass Brust und Bauch freigelegt werden. Schneiden Sie einen großen Fleck der Haut auf der Brust, von unterhalb des Brustbeins bis zum Hals.
Schnappen Sie sich das Brustbein mit Zange, heben Sie es sanft an und beginnen Sie, den Rippenkäfig auf beiden Seiten zu durchschneiden, bis die Brusthöhle freigelegt ist. Schneiden Sie durch das Zwerchfell, so dass die Klappe des Rippenkäfigs über ein dünnes Stück Muskel befestigt. Es sollte möglich sein, es beiseite zu legen, ohne dass es auf die exponierte Brusthöhle zurückfällt.
Überprüfen Sie, ob das Herz immer noch schlägt und stellen Sie sicher, dass der größte Teil der Leber sichtbar ist. Setzen Sie die Nadel in den linken Ventrikel ein, der farblich heller aussieht als der rechte. Um die Nadel zu stabilisieren, fahren Sie sie durch die verbleibenden Rippen auf der linken Seite des Körpers.
Suchen Sie das dunkelrot gefärbte rechte Atrium und schneiden Sie es mit einer kleinen Schere durch. Das Blut sollte zu fließen beginnen. Starten Sie die Pumpe und beobachten Sie die Leber, die Farbe von rot zu braun ändern wird.
Überwachen Sie die Leberfarbe und setzen Sie die Perfusion fort, bis die Leber blassbraun wird. Führen Sie die Pumpe noch ein paar Minuten aus. Die Körpertemperatur des Tieres sollte auf 28 bis 29 Grad Celsius sinken und seine Nase sollte kalt sein.
Enthaupten Sie die Maus mit einer großen Enthauptungsschere, dann verwenden Sie ein Skalpell mit einer Klinge der Zahl 10, um die Haut auf dem Schädel zu schneiden. Mit einer kleinen abgewinkelten Schere den Schädel an der Mittellinie schneiden. Als nächstes verwenden Sie die Nummer drei Zangen, um die rechte und linke Hälfte des Schädels wegzuhebeln, vorsichtig zu sein, um die Dura mit ihm wegzunehmen.
Entfernen Sie das Gehirn, das eine weiße Farbe sein sollte, indem Sie es mit einem Spachtel aushöhlen und in die NMDG-aCSF-Lösung auf Eis fallen lassen. Lassen Sie es dort für bis zu einer Minute. Nehmen Sie das Gehirn aus dem NMDG-aCSF und legen Sie es auf ein Stück Filterpapier.
Schneiden und entfernen Sie einen 60-Grad-Keil aus Gewebe mit einem 60-Grad-Werkzeug zentriert an der Mittellinie aus dem rostralen Ende des Vorderhirns. Verwenden Sie die geschnittenen Seiten der Montagefläche, da sie den richtigen Winkel für Hippocampusscheiben bietet. Trennen Sie die Halbkugeln an der Mittellinie mit dem Skalpell und kleben Sie sie auf die Montagescheibe.
Nehmen Sie die Montagescheibe vom Eis und wischen Sie sie bei Bedarf trocken. Dann kleben Sie jede Hemisphäre vor dem Agarblock, seitlich abschneiden. Stellen Sie sicher, dass die ventralen Seiten beider Hemisphären den Agarblock berühren und dass die Rückenseiten beider Hemisphären der Klinge zugewandt sind.
Wenn sie auf die geschnittene Seite geklebt wird, sollte jede Hemisphäre relativ zur Klinge so ausgerichtet sein, dass querscheibendes des dorsalen Hippocampus in situ gewährleistet wird. Untertauchen Sie die Scheibe mit den Hemisphären in eine Schneidkammer mit eiskaltem, kariertem NMDG-aCSF. Schneiden Sie einen 400-Mikrometer-Abschnitt, und verwenden Sie dann eine Einweg-Transferpipette mit einer Trennspitze, um die Scheibe in eine Rückgewinnungskammer mit kariertem NMDG-aCSF bei Raumtemperatur zu übertragen.
Schneiden Sie den Rest der Abschnitte weiter und übertragen Sie sie in die Rückgewinnungskammer, die nicht länger als 10 Minuten dauert, um insgesamt acht bis zehn Scheiben aus der dorsalen Hippocampus-Region zu schneiden. Inkubieren Sie die Scheiben bei Raumtemperatur für etwa zwei Stunden vor der Aufnahme. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Hippocampus-Scheiben von erwachsenen Mäusen zu erzeugen.
Eine große Anzahl von Pyramidenzellen im CA1-Feld und Subiculum erscheinen in geringem Kontrast, einem Kennzeichen gesunder Zellen, wenn sie unter infraroter Differentialkontrastmikroskopie beobachtet werden. Patch-Clamp-Aufnahmen können von CA1-Neuronen von Mäusen erhalten werden, die über sechs Monate alt sind. Im Beispielexperiment hier wurde die Häufigkeit der miniaturexzitatorischen postsynaptischen Ströme gemessen, nachdem NMDA-LTD relativ zu den Kontrollbedingungen induziert wurde.
Die Häufigkeit der miniaturexzitatorischen postsynaptischen Ströme war in Neuronen nach einer NMDA-LTD-Induktion niedriger, was auf aktivitätsabhängiges Belaufen von Synopsen in CA1 hindeutet. Änderungen der Amplitude wurden nicht erkannt. Während der mEPSC-Aufnahmen wurden auch CA1-Zellen mit Biocytin gefüllt und intakte dendritische Laube und ein gesunder Zellhabitus der pyramidenförmigen Neuronen sind hier zu sehen.
Eine robuste Verteilung des Fluoreszenzfarbstoffs in der Zelle ermöglicht die Analyse von Dendriten und dendritischen Stacheln unter verschiedenen Bedingungen. Es wurde eine Langfristige Potenzierung (LTP) von CA3-CA1-Synapsen von etwa 170 % beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Aufrechterhaltung der für LTP benötigten Signalkaskaden in Scheiben von erwachsenen Mäusen vorhanden ist. Ein robustes, auferregendes postsynaptisches Potenzialsignal deutet darauf hin, dass auch die Netzwerkkonnektivität erhalten blieb.
Zwei kritische Aspekte des Protokolls sind die transkardiale Profusion mit einer eiskalten Lösung zur Induzieren von Hypothermie und die Einführung eines NMDG als Natriumionenersatz in Lösungen zur Vorbeugung zytotoxischer Ödeme. Mit diesen Vorsichtsmaßnahmen können akute Scheiben aus jeder Hirnregion hergestellt werden. Darüber hinaus können auf diese Weise hergestellte Scheiben für die Kalzium- und Spannungsbildgebung mittels Zweiphotonen- oder Weitfeldmikroskopie verwendet werden.
Dieses Protokoll könnte als Grundlage für eine standardisierte Vorbereitung auf akute Hippocampusscheiben von alternden Tieren dienen und so Vergleiche zwischen Studien im Kontext neurodegenerativer Krankheitsmechanismen erleichtern.
