Wir beschreiben ein Protokoll zur Präparierung, Immunfärbung und Montage von larvalen und adulten Drosophila-Gehirnen mit besonderem Schwerpunkt auf den Sehlappen. Angesichts der komplexen dreidimensionalen Organisation des Sehlappens wird erwartet, dass das hier beschriebene Protokoll den Forschern ein besseres Verständnis der Beziehung zwischen der Montageorientierung und den visualisierten Strukturen des Sehlappens ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt drei Befestigungsstrategien sowohl für larvale als auch für adulte Sehlappen, von denen jede einen optimalen Winkel bietet, um eine bestimmte Sehlappenstruktur während der Bildgebung sichtbar zu machen.
Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, füllen Sie alle Vertiefungen einer Drei-Well-Platte mit 400 Mikrolitern PBS pro Well und wählen Sie mit einer Pinzette vorsichtig 15 wandernde Larven des dritten Stadiums aus, die auf der Innenseite eines Drosophila-Fläschchens oder einer Flasche kriechen. Legen Sie alle Larven in die erste Vertiefung der Drei-Vertiefung-Platte und setzen Sie eine Larve in die mittlere Vertiefung der Platte um. Halten Sie den Körper der Larve mit der nicht dominanten Hand am Boden der Vertiefung fest und greifen Sie mit der dominanten Hand vorsichtig nach dem Mundhaken der Larve.
Ziehe den Mundhaken vom Körper weg, um das Gehirn zu entfernen. Entfernen Sie anschließend das akzessorische Gewebe, einschließlich der Imaginalscheiben. Platzieren Sie dann das Gehirn in der dritten Vertiefung der Platte.
Wenn alle Gehirne präpariert wurden, verwenden Sie eine P200-Pipette, um das PBS vorsichtig aus der dritten Vertiefung zu entfernen, so dass gerade genug Lösung übrig bleibt, um das Gehirn unter Wasser zu halten. Geben Sie 500 Mikroliter frisch zubereitete kalte Fixierlösung in die Vertiefung. Rühren Sie die Lösung vorsichtig mit der Pinzette um, so dass das Gehirn in der Schale wirbelt, und bedecken Sie die Vertiefung mit einem Glasobjektträger.
Stellen Sie die Schüssel dann für 30 Minuten auf Eis, um das Taschentuch zu fixieren. Waschen Sie das Gehirn fünfmal mit 400 Mikrolitern frischem PBS plus Triton pro Waschgang. Die Gehirne sind nun bereit für die Inkubation mit primären Antikörpern.
Für die Sektion des Gehirns von Erwachsenen betäuben Sie 10 bis 15 erwachsene Fliegen und legen Sie sie auf ein Labortuch über Eis. Verwenden Sie eine Pinzette, um eine erwachsene Fliege am Flügel vorsichtig in eine Vertiefung einer Dissektionsplatte mit drei Vertiefungen zu übertragen, die 400 Mikroliter PBS enthält. Verwenden Sie eine Pinzette in der nicht-dominanten Hand, um den Thorax der Fliege gegen den Boden der Vertiefung zu halten, und verwenden Sie mit der dominanten Hand eine ultrafeine Pinzette, um den Kopf sanft vom Rest des Körpers zu ziehen.
Lege den Körper mit der nicht-dominanten Hand auf ein Labortuch und halte den Kopf mit der dominanten Hand am Rüssel gegen den Boden der Vertiefung. Ziehe mit beiden Pinzetten jede Region der Nagelhaut zwischen den Augen ab, bis das Gehirn freiliegt, und entferne alle Zubehörgewebe, die am Gehirn haften. Setzen Sie das gereinigte Gehirn in die dritte Vertiefung ein und präparieren Sie das nächste Gehirn wie gezeigt, bis 15 Gehirne gewonnen wurden oder eine maximale Präparierzeit von 30 Minuten abgelaufen ist.
Fixieren Sie das Gehirn mit 500 Mikrolitern Fixierlösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie das Gehirn fünfmal mit PBS plus Triton, wie gezeigt. Die Gehirne der Erwachsenen sind nun bereit für die Inkubation von Primärantikörpern. Ersetzen Sie die letzte Wäsche durch zwei Tropfen fluoreszierendes sicheres Eindeckmedium, um das Gehirn einzutauchen, und geben Sie einen einzelnen Tropfen Eindeckmedium in die Mitte eines neuen Glasmikroskop-Objektträgers.
Fassen Sie mit einer Pinzette das Gehirn jeder Larve am ventralen Nervenstrang, um sie auf den Objektträger zu übertragen. Um Vorläuferzellen und Neuronen aus der zentralen Region des äußeren Proliferationszentrums, der Lamina oder des Lobula-Pfropfens, sichtbar zu machen, stellen Sie sicher, dass der ventrale Nervenstrang über die Lappen hinausragt, platzieren Sie die Larvengehirne mit der vorderen Seite des Gewebes nach oben auf dem Objektträger. Um Zellen sichtbar zu machen, die zu den Spitzen der äußeren oder inneren Proliferationszentren gehören, stellen Sie sicher, dass der ventrale Nervenstrang unter den Lappen hervorragt.
Platzieren Sie die Larvengehirne mit der hinteren Seite des Gewebes nach oben auf dem Objektträger. Um die Sichel der Neuronen aus den inneren und äußeren Proliferationszentren sowohl in der dorsalen ventralen als auch in der medialen lateralen Achse zu visualisieren, verwenden Sie eine scharfe Pinzette oder eine Wolframnadel, um die Hirnlappen durch den ventralen Nervenstrang zu spalten, beginnend mit dem Spaltpunkt zwischen den Lappen. Richten Sie jeden Lappen mit der Seitenseite nach oben neu aus.
Wenn die Larvengehirne entsprechend ausgerichtet sind, geben Sie einen kleinen Tropfen Eindeckmittel auf jede Seite des Gehirns. Legen Sie einen Deckzettel auf jeden Tropfen und legen Sie einen letzten Deckzettel über das Gehirn, so dass der rechte und der linke Rand auf den anderen beiden Deckblättern aufliegen und eine Deckglasbrücke bilden. Verwenden Sie dann Nagellack, um die Kanten der Deckbrücke zu versiegeln, um die montierten Gehirne zu sichern.
Führen Sie nach der letzten Sekundärantikörperwäsche eine letzte Wäsche mit 400 Mikrolitern PBS durch. Ersetzen Sie das PBS durch drei Tropfen fluoreszierendes sicheres Einbettmedium, um das Gehirn einzutauchen. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium in das linke und rechte Drittel eines Glasobjektträgers.
Legen Sie einen Deckschutz über jeden Tropfen, um eine Deckglasbrücke zu bauen. Versiegeln Sie die Außenkanten des rechten Deckglases mit Nagellack und geben Sie einen einzelnen Tropfen Montagemedium zwischen die Deckgläser. Übertragen Sie das Gehirn mit einer Pinzette vorsichtig und mit besonderer Vorsicht auf den Objektträger, um eine Beschädigung der Sehlappen zu vermeiden.
Um die Zellkörper der Lamina- und Medulla-Neuronen sichtbar zu machen, verwenden Sie eine Wolframnadel, um das Gehirn in einer vorderen Position auszurichten, wobei die Antennenlappen nach außen ragen. Um Neuronen des Lubulakomplexes sichtbar zu machen, richten Sie das Gehirn in einem posterioren Bereich aus, wobei die Antennenlappen nach unten gegen die Gleitposition zeigen. Um alle Neuropilen des Sehlappens in einer einzigen Ebene zu visualisieren, richten Sie das Gehirn in einer horizontalen Position aus, richten Sie die Gehirne in einer vorderen Halterung aus und drehen Sie dann jedes Gehirn mit einer Wolframnadel um 90 Grad nach oben, so dass es auf seiner ventralen Seite sitzt und auf dem Rand des Deckglases aufliegt.
Wenn die Gehirne der Erwachsenen entsprechend ausgerichtet sind, legen Sie einen letzten Decklader so über das Gehirn, dass sich der rechte und der linke Rand mit den beiden anderen Deckgläsern überlappen, um eine Brücke zu bilden, und versiegeln Sie den Objektträger mit Nagellack. Hier ist ein Bild eines Larven-Optikerlappens in der vorderen Montageausrichtung. In der vorderen Montageorientierung erscheinen das Epithel des zentralen lauteren Proliferationszentrums, die Medulla-Neuroblasten und die Lamina-Neuronen an der Oberfläche als Zellbänder, die sich um das Gehirn wickeln.
Tiefer im Gehirn, in der Mitte des Z-Stapels, sind das Hauptepithel des äußeren Proliferationszentrums und seine jeweiligen Neuroblasten und Neuronen sichtbar. Zusätzlich sind in diesen Zwischenschnitten das Epithel des inneren Proliferationszentrums und die Neuronen des Lobulapfropfens sichtbar. Die tiefsten Z-Schnitte zeigen die andere Seite des Gehirns, wo sich die hinteren Spitzen des äußeren Proliferationszentrums befinden.
Die oberflächliche Spitze des inneren Proliferationszentrums ist ebenfalls vorhanden. Beachten Sie, dass dies die ersten sichtbaren Strukturen wären, wenn der Sehlappen posterior montiert würde. Hier ist ein Bild von einem optischen Lappen, der an der Seite montiert ist.
An der Oberfläche der seitlichen Halterung ist die Lamellensichel zu sehen und zwischen ihren Armen befindet sich die Lobulapfropfensichel. Die neuronale Sichel der Medulla erscheint an einer etwas tieferen Z-Position. Hier ist ein Bild eines adulten Sehlappens, der in anteriorer Ausrichtung montiert ist.
Da sich das Mark an der Oberfläche des vorderen Reittiers befindet, ist die Markrinde sofort sichtbar. Zellkörper im Kortex projizieren ihre Arborisationen in das Neuropil, die an einer Zwischenposition von Z sichtbar gemacht werden können. Auf dieser Höhe erscheint auch der Läppchen, der senkrecht zur Medulla ausgerichtet ist.
An der tiefsten Z-Position, dem letzten Neuropil des Sehlappens, ist die Läppchenplatte sichtbar. Beachten Sie, dass die Lobulaplatte die erste Struktur wäre, die in einer hinteren Halterung sichtbar ist. Hier ist ein Bild eines erwachsenen Sehlappens, der in horizontaler Ausrichtung montiert ist.
Wenn das Gehirn um 90 Grad auf die Seite gedreht wird, um es in eine horizontale Position zu bringen, sind alle Neuropils und Kortex des Sehlappens in einer einzigen Ebene sichtbar. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es am wichtigsten, das Hirngewebe während des gesamten Protokolls in Lösung zu halten. Wenn das Gehirn der Luft ausgesetzt wird, wird die Qualität des Flecks und damit die endgültigen Bilder erheblich reduziert.
Für die Live-Bildgebung ist es wichtig zu verstehen, wie sich die Montageausrichtung auf die Visualisierung der Optikkeule auswirkt. Larven- und adulte Gehirne können über mehrere Tage kultiviert und abgebildet werden, um Zellteilungen oder Veränderungen in der eigenen Morphologie zu verfolgen. Hier ist die Montageausrichtung entscheidend, da sich die interessierenden Zelltypen für eine optimale Detektion des Fluoreszenzsignals in vivo nahe am Deckglas befinden müssen.
