Das übergeordnete Ziel dieses Drosophila-Verletzungsprotokolls ist es, sowohl die Erhaltung der axonalen und synaptischen Morphologie als auch die synaptische Funktion von Axonen und deren Synapsen zu beobachten. Diese Assays können auch verwendet werden, um neuronale Erhaltungsfaktoren zu charakterisieren, axonalen Transport zu studieren oder axonale Organellen in intakten Axonen zu analysieren. Der partielle Flügelverletzungstest ermöglicht die Beobachtung verletzter Axone, die sich einer Degeneration nebeneinander mit unverletzten Kontrollaxonten innerhalb des gleichen Nervenbündels im Drosophila-Flügel unterziehen.
Dieser Verletzungstest kann leicht vorher in Wildfliegen geübt werden, indem man einen Schnitt etwa in der Mitte des Flügels mit Mikroschere auftragen. Die innere Verletzung ermöglicht die Beurteilung der axonalen Morphologie und durch den Einsatz von Optogenetik, um die funktionelle Konservierung von Axon und deren Synapsen zu visualisieren. Die Antennenablation erfordert feste Hände.
Es wird auch empfohlen, die Entfernung der Antennen in Wildfliegen im Voraus zu üben. In der Sucht, jede verfügbare Optogenetik Setup ist geeignet, um die Neuronen in Fliege mit Hut zu aktivieren. Andernfalls kann ein einfaches Setup problemlos von Grund auf neu aufgebaut werden.
Verwenden Sie zunächst fünf jungfräuliche Weibchen und fünf Männchen aus dem rechten Genotyp, um Kreuze bei Raumtemperatur durchzuführen. Übertragen Sie die P0-Generation alle drei bis vier Tage in neue Fläschchen. Sammeln Sie frisch geschlossene erwachsene Nachkommen F1 Generation täglich in neue Fläschchen und altern sie für sieben bis 14 Tage.
Nach der Anästhesisierung verwenden Sie Mikroscheren, um die innere Flügelvene etwa in der Mitte des Flügels zu schneiden. Verwenden Sie einen Flügel für die Verletzung und den anderen Flügel als Alter passte unverletzte Kontrolle. Tragen Sie eine Verletzung pro Flügel und stellen Sie sicher, dass 15 Flügel verletzt.
Erholen Sie die Fliegen in Lebensmitteln, die Fläschchen enthalten. Als nächstes, mit einer Pipette, verteilen 10 Mikroliter Halocarbonöl 27 entlang einer ganzen Glasrutsche. Ein oder sieben Tage nach der Verletzung, verwenden Mikroschere, um den Verletzten sowie den unverletzten Kontrollflügel abzuschneiden.
Verwenden Sie eine Pinzette, um den Flügel in der Mitte zu greifen, maximal vier Flügel in das Halocarbonöl 27 zu montieren und sie mit einem Deckelschlitten zu bedecken. Bilder von GFP-markierten Neuronen im Flügel können leicht mit einer Spinnscheibe aufgenommen werden. Die Erfassungszeit muss jedoch innerhalb von weniger als acht Minuten nach der Montage der Flügel ausgeführt werden, da die Schale nicht fixiert ist.
Stellen Sie den Flügel sofort mit einem sich drehenden Scheibenmikroskop ab. Erfassen Sie eine Reihe von optischen Abschnitten entlang der Z-Achse mit 0,33 Mikrometer Schrittgröße und komprimieren Sie Z-Stacks für nachfolgende Analysen in eine einzige Datei. Kreuzfünf Jungfrau weibchen und fünf Männchen aus dem rechten Genotyp und sammeln F1 Generation wie zuvor.
Verwenden Sie nach der Anästhesisierung eine Pinzette, um das rechte dritte Antennensegment für die einseitige Ablation oder sowohl linke als auch rechte dritte Antennensegmente für die bilaterale Ablation zu verstellen. Dadurch werden GFP-markierte neuronale Zellkörper entfernt, während ihre axonalen Projektionen im ZNS verbleiben. Abhängig von den GFP-markierten Neuronen, die in der Technik verwendet werden, ist es wichtig zu wissen, ob die Zellkörper im dritten oder im zweiten Antennensegment für den nachfolgenden Verletzungstest untergebracht sind.
Erholen Sie die Fliegen in Lebensmitteln, die Fläschchen enthalten. Nach der Anästhesisierung, verwenden Pinzette, um den Hals und eine andere Pinzette zu greifen, um den Thorax zu beheben. Ziehen Sie vorsichtig den Hals und Kopf aus dem Thorax.
Mit Pinzetten, die in die Fixierlösung getaucht wurden, übertragen Sie alle Köpfe in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr, das einen Milliliter Fixierlösung von 4%Paraformaldehyd und 0,1 Triton X100 in PBS enthält. Fixieren Sie die Köpfe für 20 Minuten mit sanfter Rührung bei Raumtemperatur. Dann legen Sie die Mikrozentrifugenröhre auf Eis und die Köpfe gravitieren auf den Boden der Mikrozentrifugenröhre.
Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer hinzu, der 0,1% Triton X100 in PBS enthält. Legen Sie das Rohr auf ein Drehrad bei Raumtemperatur, um für zwei Minuten zu waschen. Wiederholen Sie die Wäsche vier weitere Male, um Restbefestigungslösung zu entfernen.
Nach der Vorbereitung der Gehirne, erhalten Sie eine Abdeckung Folie, Kleben Laborband auf sie, und schneiden Sie eine T-ähnliche Form aus dem Band. Verwenden Sie eine 20 bis 200 Mikroliter Pipette Spitze, wo drei Millimeter der Spitze abgeschnitten wurde, um die Öffnung der Pipette zu verbreitern. Pipette das Gehirn mit Antifade-Reagenz auf dem Dia und decken Sie das Gehirn mit einem Abdeckungsschlitten.
Verwenden Sie Ton, um zwei kleine gerade Rollen vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass die Tonrollen nicht höher als die Höhe einer Glasrutsche sind. Stecken Sie die Tonrollen auf die Glasrutsche und legen Sie das Gehirn mit Abdeckungs-Slide-Sandwich auf die Tonrollen.
Gehen Sie nach dem Manuskript. Um die Fliegen für die Optogenetik vorzubereiten, schmelzen Sie zuerst Schmelzfliegenfutter in einer Mikrowelle. Nachdem das Essen abgekühlt ist, vor der Erstarrung, fügen Sie 20 Millimolar alle Trans-Retinal in Ethanol zu einer endletzten Konzentration von 200 Mikromolar.
Gut mischen und das Essen sofort in leere Fläschchen gießen. Bedecken Sie die Fläschchen, die das erstarrte Lebensmittel enthalten, mit Steckern oder Baumwollkugeln. Die Fläschchen mit Aluminiumfolie umwickeln.
Dann lagern Sie das Essen mit Fläschchen in einem dunklen Kühlraum. Verwenden Sie fünf jungfräuliche Weibchen und fünf Männchen aus dem rechten Genotyp, um Kreuze bei Raumtemperatur durchzuführen und F1-Generation wie zuvor in Aluminium-bedeckten Fläschchen mit 200 Mikromolaren alle trans-Retinal in Fliegenfutter zu sammeln. Als nächstes sammeln Sie die Fliegen, indem Sie sie von Lebensmitteln mit Fläschchen in eine leere Durchstechflasche ohne Nahrung tippen.
Die Durchstechflasche in eishaltigem Wasser ca. 30 Sekunden abkühlen lassen. Fliegen schlafen ein. Nun, schnell setzen einzelne Fliegen in kleine Kammern bedeckt eine Abdeckung Folie, um Optogenetik durchzuführen.
Führen Sie in einem dunklen Raum das Protokoll aus 30 Sekunden durch, in dem das rote Licht fehlt, gefolgt von 10 Sekunden Rotlichtbelichtung bei 10 Hertz. Wiederholen Sie diesen Vorgang insgesamt dreimal, gefolgt von einem zusätzlichen Intervall von 30 Sekunden, in dem das rote Licht fehlt. Sammeln Sie einzelne Fliegen aus jeder Kammer auf Kohlendioxid-Pads.
Um sie antennenverletzungen zu unterziehen, ablate sowohl die linke als auch die rechte zweite Antennensegmente. Dadurch werden die Zellkörper von Johnstons Organneuronen entfernt, während die axonalen Projektionen im ZNS verbleiben. Erholen Sie die Fliegen in Aluminium-bedeckten Fläschchen mit 200 Millimolar alle trans-Retinal.
An entsprechenden Zeitpunkten, z.B. sieben Tage nach der Antennenablation, unterwerfen Sie die Fliegen einem anderen Pflegetest. In diesem Protokoll wurden drei Methoden vorgestellt, um die Morphologie und Funktion von abgetrennten Axonen und deren Synapsen zu untersuchen. Die erste Methode ermöglicht eine hochauflösende Beobachtung einzelner Axone im peripheren Nervensystem.
Die schematischen Kreuze zur Erzeugung von Wildtyp- und Hochdrahtklonen im Flügel werden hier gezeigt. Die Kontrolle bei verletzten GFP-markierten Axonen wird auch mit Pfeilen versehen, die auf abgetrennte Axone hinweisen. Der zweite Ansatz zur Untersuchung des Axontodes von GFP markiert sensorischen Neuronaxonen im Gehirn wird vorgestellt.
Schematische Kreuze, um Wildtyp- und Highwire-Klone im Gehirn zu erzeugen, werden hier gezeigt. Beispiele für die Kontrolle von verletzten GFP-markierten Axonen werden mit Pfeilen dargestellt, die auf abgetrennte Axonbündel hinweisen. Die dritte Methode demonstriert den Ansatz zur Visualisierung der axonalen und synaptischen Funktion nach der Axotomie.
Die schematischen Kreuze, um Wildtyp und Dnmnat zu erzeugen, die Johnstons Organsensorische Neuronen überausdrücken, werden hier gezeigt. Wildtypfliegen sind Fliegen, die Johnstons Organneuronen mit abgeschwächtem Axontod enthalten. Beide hatten ein starkes Pflegeverhalten vor der Verletzung.
Jedoch, sieben Tage nach der Verletzung, Pflege nicht durch Optogenetik in wilden Fliegen ausgelöst werden, während die Tiere mit abgeschwächten Axon Tod weiterhin bräutigam. Hier verwenden wir den Verlust von Funktionsmutationen oder unsere Expression von Genen, um die Erhaltung der axonalen Morphologie oder synaptischen Funktion zu beobachten. Andere modifizierende Methoden können angewendet werden, wie z. B. ABstoßen von RNA-Interferenzen oder gewebespezifische CRISPR-Cas9-vermittelte Knock-Outs.
Diese Methoden können in einem verletzungsunabhängigen Kontext verwendet werden. Sie ermöglichen die Beobachtung und Charakterisierung neuronaler Erhaltungsfaktoren während des Alterns, des axonalen Transports und der axonalen Organellen in intakten Axonen.
