Wir möchten Chuck Kimmel für Führung, John Dowd um Hilfe bei der Entwicklung dieser Zuchtstrategie, Macie Walker für ihre Arbeit in den skelettartigen Fleck zu perfektionieren und Charline Walker und Bonnie Ullmann für hilfreiche Zebrafisch Beratung danken. Diese Arbeit wurde von K99/R00 DE024190, JTN unterstützt.

alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden in gemäß und in Übereinstimmung mit der University of Colorado und der University of Oregon institutionelle Animal Care and Use Ausschüsse (IACUC) abgeschlossen.
 1. Vorbereitung der nicht ausgewählte Start bestand <ol><li>identifizieren heterozygote Träger des mutierten Allels des Interesses von Fin clip 11 und Genotypisierung einen Bestand von voll-Geschwister Tiere durch die Methode der Wahl, wie KASP 12 , 13 , 14. Dieses Protokoll wurde mit dem Zebrafisch-mef2ca b1086-Stamm durchgeführt.</li>
	<li>KASP Genotypisierung 
	Hinweis: Allel spezifische Primer für KASP sind von der Firma entworfen, die die Reagenzien bietet (siehe Tabelle der Materialien). Um zu erhalten die entsprechenden 6-Carboxylgruppen-X-Rhodamin (ROX) Farbstoff Konzentration für die Echtzeit-PCR-Maschine besuchen die Website des Unternehmens.
	<ol><li>Ort der Zebrafisch Schweif Gewebe in 50 µL Lyse-Puffer (10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3 % nichtionische Tenside, 0,3 % Octylphenyl-Polyethylenglykol). Fügen Sie 10 µL von 10 mg/mL Proteinase K pro Bohrloch einer 96-Well-PCR-Platte und verdauen in einem Thermocycler bei 55 ° C für 2 bis 5 h, gefolgt von einem 20 min. 94 ° C Inaktivierung Schritt hinzu. Kühlen Sie die Lyse Produkt nach Verdauung. Hinweis: Lyse Produkte können erfolgreich für mehrere Monate nach der Zubereitung verwendet werden. Wenn Gewebe mit 50 mM NaOH lysiert wurde, blieben KASP Reaktionen erfolglos. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die NaOH-Methode der genomischen DNA-Vorbereitung nicht kompatibel mit KASP.</li>
		<li>Quantifizieren die genomische DNA mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die genomische DNA-Vorlage mit Molekularbiologie Grade Wasser, so dass jede Reaktion ca. 20-30 ng enthält. 
		Hinweis: Quantifizieren Sie 4 oder 5 Proben zu, bündeln sie, dann bereiten Sie Verdünnungen für alle Proben, die basierend auf dem Durchschnitt. Bei Verwendung dieses Protokolls für Erwachsene Schweif Gewebe ist eine 1: 100 Verdünnung oft ausreichend. Die genaue Quantifizierung der DNA-Konzentration ist nicht erforderlich.</li>
		<li>Add 0,14 µL KASP Grundierung mischen und 5 µL des KASP Master pro Probe auf Eis in eine 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und mischen vor kurz Zentrifugieren, um Inhalt an der Unterseite des Rohres sammeln, mischen. 
		Hinweis: KASP master-Mix ist Wärme und Licht empfindlich, lagern auf dem Eis und vermeiden Sie direktes Licht.</li>
		<li>Pipettieren 5 µL Grundierung/Master mix Lösung in die Vertiefungen einer 96-Well optische PCR-Platte für die Echtzeit-PCR-Maschine verwendet wird.</li>
		<li>Pipettieren 5 µL verdünnt (ca. 5-7 ng/µL) DNA-Vorlage Proben in jedem gut und mit einer Pipette mischen Aspirieren.</li>
		<li>Hinzufügen 5 µL Nuklease-freies Wasser, 3 Brunnen dienen als keine-Vorlagensteuerelemente (NTC) und fügen Sie 5 µL verdünnter bestätigten homozygoter Wildtyp, heterozygot und homozygot mutierten DNA Schablone für Positivkontrollen.</li>
		<li>Silikondichtung eine optisch klare Folie über der Platte um sicherzustellen, dass der Film vollständig auf jedes gut versiegelt ist.</li>
		<li>Kurz Zentrifugieren die Platte 600 X g, der Inhalt an der Unterseite zu sammeln und um Luftblasen zu entfernen, aus dem Mix. 
		Hinweis: Bewahren Sie die Platte auf Eis und Schild aus Licht bis bereit zu gehen.</li>
		<li>Verwenden Sie das Radfahren Programm in Tabelle 1 dargestellt, die Hauptreaktion KASP durchzuführen.</li>
		<li>Zeigen die resultierenden Streudiagramm von Analyse-Computer produziert. Eine erfolgreiche Reaktion zeigen 4 verschiedene Gruppierungen der Punkte auf dem Grundstück ( Abbildung 3): drei probieren Gruppierungen, Genotyp und eine Gruppierung von NTCs nahe dem Ursprung entspricht. Die Positivkontrollen sollten mit der entsprechenden Probe Gruppierung trennen.</li>
		<li>Wenn das Computerprogramm nicht die Handlung, die Gruppierungen erkennt als spezifische Genotypen, zusätzliche Radfahren Sets entspricht möglicherweise erforderlich (Tabelle 2). Das Zusatzprogramm zu wiederholen, bis der Computer enge Gruppierungen vom Genotyp erkennt.</li>
		<li>Die Genotypisierung Ergebnisse in einer Tabellenkalkulationsdatei für eine einfachere Nutzung und Analyse exportieren.</li>
	</ol></li> <li>Der identifizierten heterozygote Tiere zusammen auf dem Hauptsystem Wasser.</li></ol>
 2. die erste Runde der Nachkommenschaft Scoring <ol><li><ol><li>, nachdem die Tiere aus dem Fin-Clip erholen paarweise kreuzen Geschwister heterozygoten richten Sie paarweise Intercrosses. Teiler verwenden, um sicherzustellen, dass Embryonen sind synchrone 16.</li>
		<li>Sammeln die Embryonen und halten Sie die elterlichen Paare isoliert in der Zucht Käfige.</li>
		<li>Isolierte Erwachsene überwachen, so dass aggressive Fische können getrennt oder mit Abdeckung versehen (zerkleinerten Fisch Netze arbeiten schön). Fisch sollte gefüttert werden und ihr Wasser verändert nach IACUC Richtlinien in statische Wasser.</li>
	</ol></li> <li>Embryo Aufzucht <ol><li>Bühne und erhöhen die Zebrafisch-Embryonen, Larven unter Standardbedingungen 17.</li>
		<li>Sammeln phänotypisch Wildtyp Tiere mit einer Glaspipette am Tag 5 oder 6, wenn die Schwimmblase in 75 % der Kupplung aufgeblasen ist. Phänotypische Wildtypen zu platzieren, in den Kindergarten, die Aufnahme, welche Eltern ihnen ergab. 
		Hinweis: Mit mutierten Allele, die rezessiv tödlich, die für viele Skelett Mutanten gilt, nicht reinerbige Mutanten Form Schwimmblase 18 , 19. Daher phänotypischen Wildtypen von mutierten Geschwister basierend auf aufgeblasenen Schwimmblase leicht erkannt werden können.</li>
	</ol></li> <li>Alcian blau/Alizarin rot Knorpel und Knochen Färbung <ol><li>Larven, die ihre Schwimmblase mit 0,17 g/L Tricaine-Pumpen nicht auf zu betäuben-S im Embryo Medien. Sammeln Sie Tiere in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit einem weiten Bohrung Glas Pasteur pipettieren. Fügen Sie nicht mehr als 100 Larven pro Röhre.</li>
		<li>Embryo Wasser aus jeder Schlauch entfernen und Tiere in 1 mL 2 % Paraformaldehyd in 1 X PBS pro Röhre beheben. 
		Vorsicht: Wässrige PFA ist brennbar und schwere Haut- und Augenreizungen verursachen. Geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille zu tragen und waschen Sie gründlich die Hände nach Gebrauch.</li>
		<li>Rock für 1 h; längere Fixierung beeinträchtigt Knochen zu beflecken. Überprüfen Sie die Schläuche regelmäßig während dieser und alle nachfolgenden rockende Schritte, keine Larven haben klebte an der Seite oder in den Boden des Röhrchens verklumpt.</li>
		<li>Das Fixiermittel aus Rohren mit einer Glaspipette zu entfernen, fügen Sie 1 mL 50 % Ethanol, und Rock für 10 min.</li>
		<li>Bereiten frische Färbelösung durch Zugabe von 20 µL 0,5 % Alizarin Red pro 1 mL Alcian premix (0,04 % Alcian blau/10 mM MgCl 2 / 80 % Ethanol). Entfernen Sie 50 % Ethanol zu, fügen Sie 1 mL Färbelösung zu jedem Rohr und Rock über Nacht. Larven können bis zu 5 Tage in den Fleck bleiben.</li>
		<li>Entfernen Sie die Fleck-Lösung aus den Rohren und jedes Rohr 1 mL 80 % Ethanol/10 mm MgCl 2 Lösung hinzufügen. Rocken Sie die Rohre für mindestens 1 h; über Nacht Spülen einen klarer Alcian blau Fleck produzieren kann.</li>
		<li>Entfernen Sie die 80 % Ethanol/10 mM MgCl 2 Lösung aus den Rohren und 1 mL 50 % igem Ethanol zugeben; rock für 5 min.</li>
		<li>Entfernen Sie die 50 %-Ethanol-Lösung aus den Rohren und 1 mL 25 % Ethanol und Rock für 5 min.</li>
		<li>Die 50 % ige Ethanol-Lösung aus den Rohren zu entfernen und fügen Sie 1 mL frisch zubereitete 3 % H 2 O 2 /0.5% KOH Bleichbad. Lassen Sie die Kappen öffnen und lassen Sie die Rohre stehen in einem Micro-Tube Rack für ca. 10 Minuten oder bis eine schwache braune Färbung im oberen Teil der Lösung gesehen werden kann. 
		Hinweis: Eine Schicht Bläschen Form auf die Lösung. Sorgfältige Timing ist bei diesem Schritt über bleichen führt zu einer armen doppelte Fleck.</li>
		<li>Bleichbad zu entfernen und fügen Sie 1 mL 25 % glycerol/0.1% KOH; rock für 10 min bis 1 h.</li>
		<li>25 %-glycerol/0.1%-KOH-Lösung aus den Rohren zu entfernen, Hinzufügen jedes Rohr, Rock für 10 min über Nacht 50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung 1 mL.</li>
		<li>50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung aus den Rohren zu entfernen und wieder hinzufügen 50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung für jedes Rohr. Rocken hilft über Nacht Luftblasen zu entfernen, die sich im Inneren Larven anreichern können. Store gebeizt Skelette Vorbereitungen bei 4 ° C, wenn nicht verwendet wird.</li>
	</ol></li> <li>Phänotyp erzielte <ol><li>Score gebeizt mutierte Nachkommen für die Penetranz des ausgewählten Phänotyps. In Nichols Et al. 1 durch Mutation entstehende Variationen für jedes Auftreten von ektopische Knochen erzielt wurden. 
		Hinweis: Da der Zebrafisch-Eltern in statische Wasser sind und der Alizarin roten Fleck kann mit der Zeit verblassen, es ist wichtig, Skelette innerhalb weniger Tage der Vollendung der skelettartigen Vorbereitung Punkten.</li>
		<li>Penetranz ist der Anteil der ein Genotyp, der einen Phänotyp hat. Die prozentuale Penetranz nach folgender Formel zu berechnen: % Penetranz = (Mutanten mit Phänotyp) / (Gesamtanzahl der Mutanten) × 100</li></ol></li></ol> 3. Auswahl der <ol><li>Wählen Sie zwei hohe Penetranz und zwei geringe Penetranz Familien für die nächste Generation. Neben Penetranz ist es wichtig, Fruchtbarkeit und Vitalität zu berücksichtigen bei der Auswahl der Familien zu propagieren; Nähere Einzelheiten dazu finden Sie unter Diskussion.</li>
	<li>Geben jedes elterlichen paar eine Sub-Lager-ID: Familie.01,.02, etc.</li>
	<li>Haus elterlichen Paare auf dem Hauptsystem mit mehreren gemischten Sex &#39; Begleiter &#39; Fisch. Begleiter-Fische können jede Zebrafisch-Zeile mit permanenten, offensichtlich Unterscheidungsmerkmale, wie z. B. veränderte Pigmentierung oder Fin-Struktur werden. 
	Hinweis: Während viele Forscher erfolgreich nur Brutpaare in einem Tank halten, sind positive Ergebnisse durch die Unterbringung von Paaren mit mehrere Begleiter Fische gesehen. Diese optionale Schritt ermöglicht Brutpaare von Tieren in größeren Schulen gehalten werden und leicht abgerufen werden, so dass sie immer wieder überquert werden können, je nach Bedarf. Elterliche Paare können wiederholt überschritten werden, um voll-Geschwister Großfamilien zu generieren; warten Sie mindestens eine Woche vor der Wiederholung überqueren das gleiche elterliche paar.</li>
	<li>Cull die Larven Familien aus Schritt 2.2.2. nicht für die nächste Generation ausgewählt wurden.</li>
	<li>Beschriften Sie die Behälter mit den Wildtyp Geschwister Larven aus ausgewählten Familien mit Penetranz von mutierten Geschwister und bis zum Erwachsenenalter als normal erhöhen.</li>
	<li>Die nächste Generation müssen mindestens vier volle Geschwister Familien, zwei für die Linie nach oben und nach unten gerichtete Linie.</li>
	<li>Bei Larven geschlechtsreif, wiederholen Sie das Protokoll beginnend bei Schritt eins mit der neuen Generation.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca.">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li><li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism,+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+(HDR).">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li><li>Cox, S. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Selektiver Zucht stellt Feinheiten der Genfunktion
Shifting mutierte Phänotypen um mehr oder weniger stark durch selektive Zucht ist eine einfache Möglichkeit, neue Einblicke in Genfunktion. Im Vergleich zu standard-Methoden der nicht ausgewählte Zucht kann das Protokoll hier vorgestellten ein viel umfassenderes Verständnis der mutierten Phänotypen ergeben. Insbesondere kann durch die Generierung von Stämmen, die schwere, die volle Bandbreite der mutierten Phänotypen au...

Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges Modell für das Verständnis der Skelettbildung. Mit mutierten Zebrafisch Stämmen können Biologen Genfunktion während Skeletogenese entschlüsseln. Jedoch können Skelett mutierten Zebrafisch Phänotypen mit variabler Penetranz1,2,3,4 präsentieren die Entwicklungs- und genetische Analysen behindern können. Der Zweck dieser Methode ist dreifach. Zunächst ermöglicht Zebrafisch mutierten Linien erzeugen immer wieder schwere Phänotypen erzeugen nachgelagerte Studien wie Zeitrafferaufnahme5 und Transplantation6. Diese Art von Studien können gelähmt werden, indem er versucht, die Phänotypen zu studieren, die nur uneinheitlich manifestieren. Zweitens kann die Inzucht Zebrafisch Stämme genetischen Hintergrund Variation, also Förderung experimenteller Konsistenz und Reproduzierbarkeit verringern. Zum Beispiel alle in Situ können Hybridisierung Analysen auf eine selektiv Inzucht Belastung reduzieren verwirrende Variabilität und Schlussfolgerungen zu stärken. Drittens: Generierung von schweren und leichten Belastungen die gesamte phänotypischen Serie zeigen, die durch eine bestimmte Mutation entstehen können.
Selektive Zucht von letale Mutanten scheint auf den ersten Blick unmöglich. Wie kann eine Rasse für Penetranz, wenn die Tiere, die für die Auswahl erzielte sind tot sind? Glücklicherweise haben Methoden für die selektive Zucht von Familie Auswahl, speziell Nachkommen testen, Wirksamkeit bei der Viehzucht Programme für viele Jahre7,8gezeigt. Diese Programme dienen hauptsächlich für die selektive Zucht für Züge, die nur in einem Geschlecht, wie Milchleistung bei Kühen oder Ei-Produktion bei Hennen vorhanden sind. Die Männchen dieser Arten können nicht direkt, erzielte aber ihre Nachkommen werden ausgewertet und ein Wert wird dann an die Eltern zugewiesen. In Anlehnung an diese Strategie, beinhaltet das Protokoll hier vorgestellten erzielte die festen und gefärbten mutierten Nachkommen aus einem Paar von Zebrafisch, die heterozygot für eine Mutation von Interesse sind. Die Penetranz des Phänotyps bei den homozygoten tödlichen mutierten Nachkommen erhält die Eltern bei der Entscheidung, welche Individuen wird die nächste Generation in der Zeile zu produzieren. Wir finden, dass diese Methode ein wirksames Mittel zur Verlagerung Penetranz im Zebrafisch letale Skelett Mutanten1.
Ähnlich wie bei anderen Studien, nimmt dieses selektive Zucht-Protokoll unter Berücksichtigung Kriterien wie normale Entwicklung der Embryonen und Geschlechterverhältnis9, Gelegegrösse, Überleben der Nachkommen. Jedoch sind alle diese Faktoren im Zusammenhang mit einem mutierten Hintergrund mit dem Ziel der Verschiebung der mutierten Penetranz berücksichtigt. Daher reicht dieses Protokoll vorherigen Auslesezüchtung Paradigmen bieten eine Methode, um Stärken Entwicklungsstörungen mutierte Analysen sowie Hintergrund Homogenität zu erhöhen.
Dieses Protokoll erfordert umfangreiche Genotypisierung, deshalb es wichtig ist auf eine zuverlässige und schnelle Genotypisierung-Protokoll zu entwickeln. Es gibt viele Genotypisierung Protokolle verfügbar10,11, jedoch finden wir die KASP Genotypisierung12,13,14 ist schneller, kostengünstiger, effizienter und zuverlässiger als Methoden basierend auf Restriktionsenzym Spaltung der amplifizierten Sequenzen10. Daher sind wir ein KASP Protokoll in dieser Arbeit. Darüber hinaus wir zielen auf Skelett mutierte Phänotypen in diesem Protokoll und ein Verfahren für Alcian blau/Alizarin rote Färbung veränderte aus früheren Protokollen15umfassen.
Die hier beschriebene Methode ist eine einfache Strategie zum tödlichen mutierten Penetranz verschieben, nach oben oder unten. Während dieses Protokoll konzentriert sich auf Skelett mutierte Phänotypen, glauben wir, dass es eine sinnvolle Strategie für Tierhaltung aller mutierten Zebrafisch Linien sein wird. In der Tat hinausgeht die Nützlichkeit dieser Zuchtstrategie wahrscheinlich Zebrafisch. Wir sagen voraus, dass dieses Protokoll geändert werden kann, um Penetranz in einer Vielzahl von Organismen zu verlagern. Verschiebung tödliche Penetranz um Nachkommen testen kann dazu beitragen, den Fortschritt der Entwicklungsstörungen Genetiker voranzutreiben.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde, pelleted, solid</td><td>Ted Pella Co.</td><td>18501</td><td>Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, solid</td><td>Acros Organics</td><td>223210010</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, Aqueous</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>190 proof Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue, solid</td><td>Anatech Ltd.</td><td>867</td><td>Must be from Anatech</td></tr><tr><td>Alizarin Red, solid</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP229 1</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP263500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide,&amp;nbsp; solid</td><td>Fisher</td><td>P250 500</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-time PCR Machine</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; seal</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>KASP Master Mix, High ROX</td><td>LGC</td><td>KBS-1016-022</td><td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td></tr><tr><td>KASP By Design Primer Mix</td><td>LGC</td><td>KBS-2100-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl, solid</td><td>Fisher</td><td>BP153 500</td><td></td></tr><tr><td>potassium chloride, solid</td><td>Fisher</td><td>BP366 500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP337 100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700 100</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Drop Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>for DNA quantitation</td></tr></tbody></table>

shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing

Mutierte Zebrafisch Phänotypen sind oft unvollständig penetrant, nur in einigen Mutanten manifestiert. Interessante Phänotypen, die uneinheitlich erscheinen können schwierig sein, zu studieren und zu verwirrende Ergebnisse führen können. Das hier beschriebene Protokoll ist ein einfache Zucht Paradigma zu erhöhen und verringern Penetranz in tödliche Zebrafisch Skelett Mutanten. Da letale Mutanten können nicht direkt gezielt gezüchtet werden, ist die klassischen Auslesezüchtung Strategie der Nachkommenschaft Tests eingesetzt. Diese Methode beinhaltet auch Protokolle für Kompetitive Allel spezifische PCR (KASP) Genotypisierung Zebrafisch und Färbung Larven Zebrafisch Knorpel und Knochen. Anwendung der hier beschriebenen Strategie zur Tierhaltung kann die Penetranz der eine interessante skelettalen Phänotyp ermöglicht mehr reproduzierbare Ergebnisse in downstream-Anwendungen erhöhen. Darüber hinaus kann verringern die mutierten Penetranz durch diese selektive Zuchtstrategie Entwicklungsprozesse offenbaren, die am wichtigsten ist die Funktion des mutierten Gens erfordern. Während das Skelett speziell hier betrachtet wird, schlagen wir vor, dass diese Methode für alle mutierten Zebrafisch-Linien nützlich sein wird.

Dieses Protokoll ist eine langfristige Haltung Technik nützlich für Verständnis Zebrafisch Skelett Mutanten (Abbildung 1). Selektiver Zucht von Nachkommen testen sollte eine Verschiebung im allgemeinen Penetranz nach unten und nach oben in ein paar Generationen (Abbildung 2) ergeben. In unserer bisherigen Arbeit fuhren zwei Runden der Zuchtauslese die durchschnittliche Penetranz nach unten von 17 % auf 3 %1</...

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Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Penetranz der letale Skelett mutierte Phänotypen im Zebrafisch durch selektive Zucht zu ändern. Letale Mutanten können nicht bis ins Erwachsenenalter angebaut werden und selbst gezüchtet, daher dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Verfolgung und Penetranz über mehrere Generationen von Nachkommen Tests auswählen.

Verschiebung der Zebrafisch letale Skelett mutierte Penetranz um Nachkommen testen

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

shifting-zebrafish-lethal-skeletal-mutant-penetrance-progeny

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7.5K Aufrufe.  University of Colorado Anschutz Medical Campus. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Penetranz der letale Skelett mutierte Phänotypen im Zebrafisch durch selektive Zucht zu ändern. Letale Mutanten können nicht bis ins Erwachsenenalter angebaut werden und selbst gezüchtet, daher dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Verfolgung und Penetranz über mehrere Generationen von Nachkommen Tests auswählen.

Serie: Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Forschung

Genetik

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Krebsforschung

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Entwicklungsbiologie

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Biologie

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...