Mit diesen Methoden wurde das erste Zebrafischmodell der Neuroblastom-Metastasierung entwickelt. Und um zu zeigen, dass dieses Modell viele Merkmale der Metastasierung, die bei Patienten mit hohem Neuroblastomrisiko beobachtet wurden, getreu rekapitulieren kann. Der Hauptvorteil dieses metastasierenden Zebrafischmodells ist die Echtzeit-In-vivo-Bildgebung der Tumorverbreitung, um besser zu verstehen, wann und möglicherweise wie Metastasen auftreten.
Diese Technik ist nicht spezifisch für Neuroblastome. Es kann auf Zebrafischmodelle verschiedener Krebsarten angewendet werden, solange die Tumorzellen identifiziert und verfolgt werden können, was zu einer Reihe von Möglichkeiten führt. Entwickeln Sie zunächst eine heterozygote transgene Fischlinie, die sowohl MYCN als auch LMO1 überexprimiert, indem Sie MYCN- und LMO1-transgene Linien kreuzen.
Verwenden Sie eines Tages nach der Befruchtung ein stereoskopisches Fluoreszenzmikroskop, um die Nachkommen der Auskreuzung für die EGFP-Expression zu sortieren, die sich als EGFP-positive Punkte präsentiert. Nach dem Sortieren isolieren Sie die gescreenten Embryonen in separate Petrischalen und kennzeichnen sie die Schalen als MYCN-positiv oder MYCN-negativ. Visualisieren und sortieren Sie Embryonen beider Gruppen für die LMO1-Expression drei bis vier Tage nach der Befruchtung.
Suchen Sie nach roten Fluoreszenzflecken sowohl im oberen zervikalen Ganglion als auch in nicht-PSNS-dopaminergen neuronalen Zellen, insbesondere in der Oblongata-Medulla des Hinterhirns. Führen Sie das Screening durch, bevor die Embryonen fünf Tage nach der Befruchtung erreichen. Dann isolieren Sie sortierte Fische in vier Gruppen verschiedener Genotypen und kennzeichnen Sie sie nur als MYCN, nur LMO1, MYCN und LMO1 sowie als Wildtyp.
Heben Sie sie unter identischen Bedingungen gemäß Standardprotokollen an. Visualisieren Sie Tumore mit einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop, indem Sie Fische vorsichtig mit einem Metallspatel auf beiden seitenseitigen Seiten umdrehen, um den Tumor zu sehen. Nach der Identifizierung der möglichen tumortragenden Fische isolieren Sie sie in einem separaten Tank mit entsprechenden Etiketten, die das Geburtsdatum, das Datum, an dem der Tumor untersucht wurde, und den Genotyp enthalten.
Wiederholen Sie sechs Wochen nach der Befruchtung die vorherigen Schritte, um nach tumortragenden Fischen und nicht tumortragenden Fischen zu suchen, um das Vorhandensein von Tumoren für zuvor gescreente Fische zu bestätigen oder neue mögliche tumortragende Fische zu identifizieren. Suchen Sie nach der anhaltenden oder erhöhten Größe der fluoreszenzpositiven Masse und des bestätigten tumortragenden Fisches. Nachdem Sie tumortragende Fische identifiziert haben, überwachen Sie sie zweiwöchentlich auf Hinweise auf eine Tumorzellmigration, die sich als winzige EGFP- oder mCherry-positive Tumormassen weit vom primären Ort der Tumorgenese entfernt präsentiert.
Isolieren Sie diese Fische bei Bedarf in separaten Tanks und kennzeichnen Sie sie entsprechend, um mögliche Metastasen anzuzeigen. Nach der Interpretation des heterozygoten MYCN in LMO1-Fischen und beim Sortieren ihrer Nachkommen war die EGFP MYCN-Expression in den nicht-PSNS-dopaminergen neuronalen Zellen einen Tag nach der Befruchtung prominent. Im Gegensatz dazu war die LMO1-Expression sowohl in PSNS-Zellen als auch in nicht-PSNS-dopaminergen neuronalen Zellen prominent.
Fluoreszierende positive Tumormassen wurden in Geweben in Organen nachgewiesen, die von der primären Tumorstelle in der Verbindung transgener Fische mit Überexpression von MYCN und LMO1 entfernt sind, aber nicht in den transgenen Fischen mit der Expression von MYCN allein. H & E-Färbungen der chirurgischen Abschnitte zeigen, dass der Primärtumor aus der Interrenaldrüsenregion entstand, dem Zebrafisch-Äquivalent der menschlichen Nebenniere, die die häufigste Stelle der Primärerkrankung bei Neuroblastompatienten ist. Tumormassen, die von der Interrenaldrüse entfernt sind, wurden in mehreren Regionen nachgewiesen, einschließlich des distalen Teils der Niere, der Orbita, der Kieme, der Milz und der Innenwand der Vorhofkammer des Herzens.
Die PSNS-Neuroblastenlinie von Tumorzellen am Primärtumor und allen metastasierenden Stellen wurde bestätigt. Signifikant amplifizierte Mengen und eine erhöhte Dicke von PSR-gefärbten Kollagenfasern wurden in MYCN LMO1-Tumoren im Vergleich zu den Tumoren, die MYCN allein exprimieren, gefunden. Nach der Anwendung dieses Verfahrens können ein Arzneimittelscreening und das Testen neuartiger Krebstherapien angewendet werden, die möglicherweise zur Entwicklung alternativer Wirkstoffe zur Vorbeugung und Behandlung von metastasierenden Krebserkrankungen führen können.
