Diese Arbeit wurde von NIAMS AR064873, Epigen Project PB unterstützt. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT zu LL

Die Mäuse wurden nach den üblichen Tierfunktionsverfahren gezüchtet und gepflegt, und alle experimentellen Protokolle wurden von der Tierschutzversicherung und dem internen Tierforschungsethical Committee nach dem italienischen Gesundheitsministerium genehmigt und dem NIH Guide für die Pflege und Verwendung von Labortiere. 1. Muskelverletzung und der In-vivo- Block des autophagischen Flusses <ol><li> Muskelverletzung. <ol><li> Um eine akute Skelettmuskelverletzung zu induzieren, injizieren Sie 20 μl 10 μM Cardiotoxin (CTX) direkt im linken Tibialis anterior (TA) Muskel von 2 Monate alten C57BL / 6J Mäusen, die etwa 20 g wiegen. Verwenden Sie eine gleiche Anzahl von Männern und Frauen. Benutzen Sie das ungestörte kontralaterale Glied als Kontrolle. HINWEIS: 10 μM CTX in 0,9% Natriumchloridlösung sollte filtriert werden (0,22 μm PVDF-Filter) und bei -20 ° C gelagert. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen. </li><li> Mit einem iNsulin-Spritze mit einer 30 G-Nadel, injizieren CTX in der Mitte der TA. Um eine genaue Verletzung in der TA zu induzieren, stellen Sie sicher, dass die Nadel der Spritze in die Nähe der distalen Sehne, 5 mm tief, von der Unterseite bis zur Oberseite des Muskels eintritt ( Abbildung 1A ). </li></ol></li><li> Blockade des autophagischen Flusses in ungestörten und verletzten Mäusen. <ol><li> Zur Beurteilung des autophagischen Flusses, 24 h Post-Injury (pi), verabreichen Sie 50 mg / kg Chloroquin (CLQ) alle 24 h für 4 d durch intraperitoneale (IP) Injektion (Abbildung 1B ). <ol><li> CLQ (10 mg / ml) in PBS 1X auflösen und durch eine 0,2 μm Membran filtrieren. Wiegen Sie jede Maus und berechnen Sie die Menge an CLQ zu injizieren. HINWEIS: Vorbereitung und Verwendung der CLQ-Lösung am selben Tag. CLQ-Lager kann bis zu einem Monat bei -20 ° C gelagert werden. Da Autophagie ist ein Stoffwechsel-Prozess, immer immer CLQ Behandlung immer zur gleichen Zeit ( dh am Morgen befoRe 10 Uhr). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Muskelgewebeabschnitte <ol><li> Mausopfer. <ol><li> Euthanize die Mäuse 5 Tage nach der Verletzung. </li><li> Euthanasie durch zervikale Versetzung oder durch CO 2 durchführen (gefolgt von zervikaler Versetzung zur Bestätigung). Da der Autophagie-Prozess mit der Maus schläft / Essgewohnheiten verwandt ist, immer die Mäuse gleichzeitig opfern, vorzugsweise am Morgen ( dh vor 10 Uhr). </li></ol></li><li> TA Isolierung und Einbeziehung. <ol><li> Vor der Dissektion die Maus mit 70% Ethanol sprühen. </li><li> Mit Schere machen einen kleinen, senkrechten Einschnitt (3 mm lang) auf die dorsale Haut der Maus auf der Ebene der Hüften. Schneiden Sie den Schwanz und die Füße, um die Hautentfernung zu vereinfachen. Ziehen Sie die Haut in Richtung Schwanz und entfernen Sie sie, um die darunter liegenden Muskeln auszusetzen. Der TA-Muskel ist leicht zu lokalisieren, wie in Abbildung 2A gezeigt </Stark&gt;. </li><li> Mit Hilfe von zwei Pinzetten greifen die distalen Sehnen. </li><li> Schneide die distalen Sehnen; Die TA- und extensor digitorium longus (EDL) Sehnen werden oft gemeinsam geschnitten und später getrennt (siehe Schritt 2.2.6). </li><li> Mit der Pinzette den TA-Muskel an der Sehne halten und den Muskel vorsichtig zum proximalen Ende hinaufziehen (in der Nähe des Knies, Abb. 2B ). HINWEIS: An diesem Punkt sind die EDL- und TA-Muskeln leicht erkennbar, die TA ist größer und oberflächlicher als die EDL. </li><li> Trennen Sie den TA vom EDL-Muskel, indem Sie die beiden distalen Sehnen in die entgegengesetzten Richtungen ziehen (Abbildung 2C ). </li><li> Schneide die proximale Sehne </li><li> Mit Pinzette, entfernen Sie die dünne Faszie, die den Muskel bedeckt, ohne das Gewebe zu beschädigen. </li><li> Entfernen Sie übermäßige Feuchtigkeit in der Probe mit Hilfe eines Papiertuches. Sicherstellen, dass der Muskel weder nass noch übermäßig trocken ist, da übermäßige Feuchtigkeit sig produziertEine deutliche Schädigung des Muskels und gefährden die nächste Färbung. </li><li> Setzen Sie die optimale Schneidtemperatur (OCT) -Verbindung am Boden einer Form ein und legen Sie den Muskel in die in Abbildung 2D gezeigte Ausrichtung. Füge 100% Isopentan zu einem Becher hinzu, bis er eine Tiefe von ca. 3-4 cm erreicht. Stellen Sie das Becherglas mit flüssigem Stickstoff in einer Polystyrolbox in Berührung. </li><li> Lassen Sie den flüssigen Stickstoff nicht in den Becher geben, da er einen sprudelnden Schaum produzieren wird, der die Einbeziehung beeinflussen und die Muskelabschnitte beschädigen kann. </li><li> Beobachten Sie das Isopentan und warten Sie, bis es die richtige Temperatur erreicht (zwischen -140 ° C und -150 ° C); Bei der geeigneten Temperatur wird eine feste weiße Schicht aus gefrorenem Isopentan auf dem Boden des Bechers kristallisieren. </li><li> Wenn das Isopentan vollständig festgefriert, schmelzen und es auf die Gefriertemperatur kühlen, bevor es weiter zum nächsten Schritt geht. </li><li> Mit der vorgegossenen Pinzette die Form fein zerkleinernDas Isopentan für ca. 20-30 s. Legen Sie die gefrorene Probe in einen Behälter mit Trockeneis, bis sie auf einen Gefrierschrank von -80 ° C übertragen wird. HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. </li></ol></li><li> Muskelgewebe Kryosorten. <ol><li> Nach mindestens einer Nacht bei -80 ° C, kryosähen. </li><li> Nehmen Sie das Kryostatmesser und die Anti-Roll-Platte aus dem Gefrierschrank -20 ° C und legen Sie sie auf die entsprechenden Träger in den Kryostatschrank. </li><li> Setzen Sie einen Tropfen OCT auf den Probenstummel und legen Sie die gefrorene Probe in vertikaler NS-Orientierung auf, wie in Abbildung 2D dargestellt. </li><li> Legen Sie den Probenstummel auf das Spannfutter. </li><li> Ohne die Anti-Roll-Platte auf das Messer zu ziehen, machen Sie einige Schnitte bei 40 μm, um OCT loszuwerden, die keinen Muskel enthält. Wenn der Muskel sichtbar wird, reduzieren Sie die Schichtdicke auf 7-8 μm. </li><li> Ziehen Sie die Anti-Roll-Platte nach unten, bis sie ausgerichtet istDer Rand des Messers oder ein wenig darüber. </li><li> Schneiden Sie transversale Abschnitte von 7-8 μm dick und montieren Sie 3-4 Scheiben pro histologischer Rutsche. HINWEIS: Die vorgeschlagene Kryostattemperatur liegt zwischen -15 ° C und -23 ° C. Für die anschließende Analyse werden Querschnitte der Proben benötigt, um die Muskelstammzellen in der Satelliten-Nischenposition zu lokalisieren. </li><li> Um die Adhärenz des Abschnitts zu maximieren, halten Sie die Objektträger bei Raumtemperatur für 10-15 min, um so ihre Ablösung während der Antikörperinkubation zu verhindern. HINWEIS: Der Lufttrocknungsschritt könnte die Immunfärbung beeinträchtigen und mehrdeutige Ergebnisse liefern. Folien können für mehrere Monate bei -80 ° C nicht fixiert werden. Das Protokoll kann hier pausiert werden. </li></ol></li><li> Prüfung auf Muskelschäden bei Kryosationen von TA-Muskeln durch Hämatoxylin Eosin (H &amp; E) Färbung. <ol><li> Um die Qualität des Muskels zu bewerten ( dh die Wirksamkeit der Verletzung, die Muskelisolation und die InklusionIonen und Kryoseiten), eine H &amp; E-Färbung durchführen. Für jeden experimentellen Zeitpunkt fixieren Sie eine Folie mit 4% PFA für 10 min. Nach der Fixierung, waschen Sie die Folien gut in mehreren Änderungen von 1x PBS. HINWEIS: Vorsicht. PFA ist krebserzeugend und muss sorgfältig behandelt werden. </li><li> Nehmen Sie eine Rutsche für jeden experimentellen Punkt und legen Sie sie in ein Färbeglas. </li><li> Füllen Sie das Gefäß mit 9 g / l Hämatoxylin, bis die Abschnitte abgedeckt sind und für 8 min inkubieren. </li><li> Recyceln Sie die Hämatoxylin. </li><li> Lassen Sie das Gefäß unter fließendem Wasser für 10 min, um den Überschuss von Hämatoxylin zu entfernen. HINWEIS: Achten Sie darauf, dass das Wasser nicht direkt auf die Abschnitte fließt. </li><li> Mit sterilisiertem Wasser waschen. </li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte mit Eosin 0,5% (w / v) in angesäuertem 90% Ethanol für 1 min. </li><li> Recyceln Sie den Eosin. </li><li> Waschen Sie zweimal mit sterilem Wasser für 3 min / waschen. HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer Chemikalienhaube durch. </li><li> Die Abschnitte mit 70% Ethanol waschen. </li><li> WaschenDie Abschnitte mit 90% Ethanol. </li><li> Die Sektionen mit 100% igem Ethanol waschen. </li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte mit 0,879 g / ml O-Xylol. HINWEIS: Vorsicht. O-Xylol ist brennbar und mäßig giftig. Manipulieren Sie es unter chemischer Haube, tragen Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, ein Laborkittel und eine Maske. </li><li> Recyceln Sie das o-Xylol. </li><li> Setzen Sie die Folien über ein Stück Papier, um zu trocknen. </li><li> Schließen Sie die Objektträger mit einem schnell härtenden, auf Xylol basierenden Montagemedium. </li><li> Überprüfen Sie die Qualität der Abschnitte unter einem optischen Mikroskop bei 10facher Vergrößerung (siehe Abbildung 3 ) HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. </li></ol></li></ol> 3. Immunfärbung für LC3 und MyoD in verletzten Muskelgewebsabschnitten <ol><li> Fixierung von Muskelgewebeabschnitten <ol><li> Bereiten Sie eine Inkubationskammer vor, indem Sie ein Stück Papier benetzen und es auf den Boden einer verschließbaren Plastikbox legen, um ein hohes Le zu erhaltenFeuchtigkeit im Inneren der Kammer Fixieren Sie Gewebeschnitten mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS für 10 min. HINWEIS: Ein nasses Stück Papier wird verwendet, um das Trocknen der Probe zu vermeiden. Frische PFA zubereiten oder PFA bei -20 ° C aufbewahren. Vorsicht. PFA ist giftig; Das Pulver muss bei der Herstellung der Lagerlösung sorgfältig gehandhabt werden. Dieser Vorgang muss in einer chemischen Haube durchgeführt werden, mit Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhen, einem Laborkittel und einer Maske. Auch wenn in der Lösung die PFA sorgfältig manipuliert werden sollte. </li><li> Entfernen Sie die PFA und waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 5-7 min; Wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal. </li></ol></li><li> Permeabilisierung von Muskelgewebeabschnitten <ol><li> Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere um die Gewebeabschnitte mit einem Papierstift. HINWEIS: Dieser Schritt definiert die Oberfläche um die Gewebeschnitten und minimiert das Volumen der in den Schritten 3.4, 3.6, 3.7 und 3.9 beschriebenen Antikörper. </li><li> Die Abschnitte mit 200 μl kalt (-20 ° C)Methanol und legte die Inkubationskammer horizontal in einen Gefrierschrank bei -20 ° C für 5 min. </li><li> Die Inkubationskammer aus dem Gefrierschrank nehmen, das Methanol absaugen und die Abschnitte mit 1X PBS für 5-7 min bei RT waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. </li></ol></li><li> Blockierung <ol><li> Bereiten Sie eine frische Blocklösung von 4% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS 1x vor. HINWEIS: Die BSA-Lösung kann für 1 Woche bei 4 ° C aufbewahrt werden. </li><li> Die Abschnitte mit Blocklösung für mindestens 60 min bei RT inkubieren. </li><li> Entfernen Sie die Sperrlösung. </li><li> Vorbereitung von 100 &amp; mgr; l Anti-Fab-Mischung durch Verdünnen von 20 &amp; mgr; g / ml Anti-Fab in 1x PBS. Inkubieren der Abschnitte mit einem unkonjugierten affinitätsgereinigten F (ab) -Fragment von anti-Maus-IgG für 1 h bei RT. </li></ol></li><li> Primäre Antikörper-Inkubation. <ol><li> 100 μl primäre Antikörpermischung für jede Folie durch Auflösen von LC3- und MyoD-Antikörpern in 4% BSA in 1x PBS vorbereiten. Verwenden Sie 5 μg /Ml anti-LC3 (polyklonaler Kaninchen-Antikörper) und 10 mg / l anti-MyoD (monoklonaler Maus-Antikörper). Inkubieren Sie die primäre Antikörpermischung über Nacht bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Waschen. <ol><li> Entfernen Sie den primären Antikörper-Mix. </li><li> Die Abschnitte mit 1% BSA in 1X PBS für 10 min waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. </li></ol></li><li> Sekundäre Antikörper-Inkubation. <ol><li> 100 μl sekundäre Antikörpermischung für jede Folie vorbereiten. Das Ziegen-Anti-Kaninchen 488 (5 &amp; mgr; g / ml) und die Ziegen-Anti-Maus 594 (5 &amp; mgr; g / ml) in 4% BSA in 1x PBS auflösen. HINWEIS: Vermeiden Sie eine übermäßige Belichtung, um eine Fluorchrom-Bleiche zu verhindern. Führen Sie die folgenden Schritte im Dunkeln durch. </li><li> Inkubieren Sie die Sektionen mit der sekundären Antikörpermischung für 45 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die sekundäre Antikörpermischung und waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 5-7 min; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. </li></ol></li><li> Primäre Antikörper-Inkubation. <ol><li> Lamini verdünnenN-2 (α-2-Ketten) monoklonaler Antikörper (0,33 μg / ml) in 4% BSA in 1x PBS unter Verwendung von 100 &amp; mgr; l Mischung für jede Folie. Inkubieren Sie die Abschnitte in der primären Antikörpermischung für 1-2 h bei RT. </li></ol></li><li> Waschen. <ol><li> Entfernen Sie den primären Antikörper-Mix. </li><li> Die Abschnitte mit 1% BSA in 1X PBS für 10 min waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. </li></ol></li><li> Sekundäre Antikörper-Inkubation. <ol><li> Vorbereitung von 100 &amp; mgr; l Sekundärantikörpermischung für jede Folie durch Verdünnen von Ziegen-Anti-Ratten-647 (5 &amp; mgr; g / ml) in 4% BSA in 1 × PBS. Inkubieren Sie die Sektionen im sekundären Antikörper-Mix für 45 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die sekundäre Antikörpermischung und waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 5-7 min; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. </li></ol></li><li> 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Inkubation. <ol><li> Füge 200 μL 300 nM DAPI-Lösung in 1x PBS zu jeder Folie hinzu. 5 min bei RT inkubieren. Die DAPI - Lösung bei 4 ° C imdunkel. </li><li> Die Abschnitte mit 1x PBS für 5-7 min waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. </li></ol></li><li> Befestigung von gefärbten Muskelabschnitten. <ol><li> Entfernen Sie den Überschuss der Waschlösung aus den Abschnitten. </li><li> Legen Sie 10 μl Glycerin in 1x PBS (3: 1) auf die gefärbten Abschnitte in der Mitte des Objektträgers und fügen Sie ein Deckglas hinzu, wodurch die Bildung von Luftblasen vermieden wird. </li></ol></li></ol> 4. Konfokale Mikroskopie Akquisition <ol><li> Erwerben Sie die Bilder mit einem Vier-Laser-konfokalen Mikroskop integriert mit einem Bild-Capture-System und analytische Software. HINWEIS: MyoD ist mit einem 594-Farbstoff konjugiert, der ein heller Rot-Fluoreszenz-Farbstoff ist, mit einer Anregung, die sich ideal für den 594 nm-Laser eignet (Anregung: 590 nm, Emission: 617 nm). LC3 ist mit einem 488-Farbstoff konjugiert, der ein hellgrün-fluoreszierender Farbstoff ist, wobei die Anregung ideal für die 488 nm Laserlinie geeignet ist (Anregung: 495 nm, Emission: 519 nm). Laminin wird mit einem 647 Farbstoff konjugiertEin heller Far-Rot-Fluoreszenz-Farbstoff, mit Anregung ideal geeignet für die 647 nm Laserlinie (Anregung: 650 nm, Emission: 668 nm). </li><li> Legen Sie die Objektträger in das Mikroskop-Fach und verwenden Sie die 63fache Vergrößerung, um Kernsignale zu erkennen. Lehnen Sie sich auf die regenerativen Bereiche ein, indem Sie die Felder der aktiven Regeneration zentrieren und sich auf die Muskelmorphologie verlassen (siehe Abbildung 4 ). HINWEIS: Während im ungestörten Muskel die Myofasergröße nahezu konstant ist (Abbildung 4A ), kann die Verletzungsvermittelte Muskelregeneration durch das Auftreten kleinerer Myofasern erkannt werden, die nach der Regeneration die neu gebildeten Fasern sind. Darüber hinaus ist der Muskel in der aktiven Regeneration durch ein umfangreiches Infiltrat gekennzeichnet, das aus Makrophagen, fibroadipogenen Vorläufern und Zellen besteht, die auf die beschädigten Muskeln lokalisiert sind, um die Muskelregeneration zu orchestrieren (Abbildung 4B ). </li><li> Bewerte die Immunfluoreszenzfärbung in regenDurch die Fokussierung auf MuSCs, die sich unter der Basallamina der Myofasern befinden. </li><li> Konzentriere dich auf MuSCs, die positiv für die MyoD-Färbung sind und in Myofasern positioniert sind, die durch Lamininfärbung markiert sind (siehe Abbildung 4B , weiße Pfeile). </li><li> Verwenden Sie mindestens 3 Mäuse / experimentelle Gruppe und verwenden Sie das Mikroskop, um 63fache Vergrößerungsbilder von mindestens 7 Feldern für jede experimentelle Gruppe zu erwerben. </li><li> Sobald die regenerativen Bereiche identifiziert sind, konzentrieren Sie sich mit der DAPI-Färbung und passen Sie dann die anderen einzelnen Kanäle an. <ol><li> Verwenden Sie folgende Mikroskopeinstellungen: Kanal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Kanal A488 Pinhole 1.6 Airy Einheit, Verstärkung 659; Kanal A647 Pinhole 1.4 Airy Einheit, Gewinn 719. </li></ol></li><li> Nach dem Einstellen des Fokus der einzelnen Kanäle gehen Sie fort, um die Bilder mit einer Größe von 1.024 x 1.024 und einem 12,61 μs Pixel zu gewinnen. </li><li> Zähle den Prozentsatz der MyoD-positiven Zellen (Kontrolle für tEr korrekte Lage unter der Lamina), die LC3-negativ sind und der Prozentsatz der MyoD-positiven Zellen, die ein LC3-Signal anzeigen. HINWEIS: Der Prozentsatz der MyoD-positiven Zellen, die eine LC3-Färbung aufweisen, ist das Auslesen dieses Protokolls. </li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+autophagy:+a+new+metabolic+regulator.">Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator.</a> Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).</li><li>Sandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+skeletal+muscle.">Autophagy in skeletal muscle.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).</li><li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+defective+in+collagen+VI+muscular+dystrophies,+and+its+reactivation+rescues+myofiber+degeneration.">Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration.</a> Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).</li><li>Chrisam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+autophagy+by+spermidine+ameliorates+the+myopathic+defects+of+collagen+VI-null+mice.">Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice.</a> Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).</li><li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+rescues+muscular+dystrophy.">Autophagy induction rescues muscular dystrophy.</a> Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).</li><li>De Palma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+as+a+new+therapeutic+target+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy.</a> Cell Death Dis. 3, e418 (2012).</li><li>Hindi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+TRAF6+at+early+and+late+stages+of+muscle+pathology+in+the+mdx+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).</li><li>Pauly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+activation+stimulates+autophagy+and+ameliorates+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse+diaphragm.">AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm.</a> Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).</li><li>Spitali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+Impaired+in+the+Tibialis+Anterior+of+Dystrophin+Null+Mice.">Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice.</a> PLoS Curr. 5, (2013).</li><li>Whitehead, N. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+therapeutic+effect+of+simvastatin+revealed+by+functional+improvement+in+muscular+dystrophy.">A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).</li><li>Fiacco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+regulates+satellite+cell+ability+to+regenerate+normal+and+dystrophic+muscles.">Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles.</a> Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).</li><li>Lee, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+NAD-dependent+deacetylase+Sirt1+in+the+regulation+of+autophagy.">A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).</li><li>Rubinsztein, D. C., Mari&#241;o, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging.">Autophagy and aging.</a> Cell. 146 (5), 682-695 (2011).</li><li>Colman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+delays+disease+onset+and+mortality+in+rhesus+monkeys.">Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys.</a> Science. 325 (5937), 201-204 (2009).</li><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132 (1), 27-42 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Calorie+Restriction+Enhances+Cellular+Quality-Control+Processes+in+Human+Skeletal+Muscle.">Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle.</a> Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).</li><li>Wenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+muscle+PGC-1alpha+expression+protects+from+sarcopenia+and+metabolic+disease+during+aging.">Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).</li><li>Carnio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Impairment+in+Muscle+Induces+Neuromuscular+Junction+Degeneration+and+Precocious+Aging.">Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging.</a> Cell Rep. , (2014).</li><li>Sandri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misregulation+of+autophagy+and+protein+degradation+systems+in+myopathies+and+muscular+dystrophies.">Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).</li><li>Cerletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+calorie+restriction+enhances+skeletal+muscle+stem+cell+function.">Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).</li><li>Gopinath, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3+promotes+quiescence+in+adult+muscle+stem+cells+during+the+process+of+self-renewal.">FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).</li><li>Tang, A. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+autophagy+supports+the+bioenergetic+demands+of+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation.</a> EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).</li><li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+maintains+stemness+by+preventing+senescence.">Autophagy maintains stemness by preventing senescence.</a> Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren

<html> Dieses Protokoll beschreibt, wie man Autophagie in Skelettmuskel Stammzellen während der kompensatorischen Muskelregeneration zu überwachen. Mehrere Antikörper für die Co-Färbung von LC3 und MyoD wurden ausprobiert, und diejenigen, die in Mausgewebeabschnitten arbeiten und erfolgreiche Ergebnisse erstellen, sind hier aufgelistet (siehe Materialtabelle ). Die Permeabilisierung mit Methanol (siehe Schritt 3.2.2) ist für eine erfolgreiche Färbung sehr zu empfehlen. <p clas...

Die Skelettmuskelregeneration ist das Ergebnis der Wechselwirkung zwischen adulten Stammzellen (Muscle Satellite Cells, MuSCs) und anderen Zelltypen, die am regenerativen Prozess beteiligt sind. Die Muskelhomöostase und die Funktionalität werden durch die kombinierten Signale, die sich aus der Muskelnische und den systemischen Cues 1 , 2 ergeben, aufrechterhalten. Im Laufe des Lebens wurden Veränderungen in der MuSC-Funktionalität, der Muskelnische und den systemischen Stichworten berichtet, was zu einem Rückgang der funktionalen Kapazitäten bei älteren Menschen führte. MuSCs werden in eine Nische unterhalb der Basallamina gesetzt und bei Muskelverletzungen aktiviert, um beschädigte Muskeln 4 , 5 zu reparieren. Um eine produktive regenerative Reaktion zu gewährleisten, ist es entscheidend, dass MuSCs verschiedene Prozesse koordinieren, die für den Ausstieg aus der Ruhe, die Selbsterneuerung und die proliferative Expansionsstufe erforderlich sindDurch die myogene Differenzierung 6 . Bei älteren und bei muskulären chronischen Erkrankungen werden alle diese Funktionen kompromittiert, was zu einer veränderten Muskelfunktionalität 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 führt . Makroautophagie (nachstehend als Autophagie bezeichnet) entsteht als ein entscheidender biologischer Prozess, der für die Erhaltung der Gewebshomöostase unerlässlich ist. Der autophagische Prozess schließt Handlungsmechanismen ein, bei denen Teile von Zytoplasma, Organellen und Proteinen in Vesikel verschlungen werden, die schließlich über den Lysosomweg abgebaut werden, wodurch die Entfernung von toxischen Molekülen und das Recycling von Makromol gefördert wirdCules Dies liefert energiereiche Verbindungen zur Unterstützung der Zell- und Gewebeanpassung unter Stress oder anderen ungünstigen Bedingungen 15 , 16 . Zusammen mit seiner Zell-Überlebensaktivität kann Autophagie auch als Zell-Todes-Induktor arbeiten, je nach Zellgewebe-Kontext ( z. B. normales gegen Krebsgewebe) und der Art des Stressreizes 17 , 18 . Der jüngste Beweis deutet darauf hin, dass Autophagie erforderlich ist, um die Muskelmasse und die Myofaser-Integrität 19 , 20 aufrechtzuerhalten und wurde in verschiedenen Muskeldystrophien 21 , 22 , 23 , einschließlich Duchenne Muskeldystrophie (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , beeinträchtigt </suP&gt; , 28 , 29 , 30. Ebenso wurde bei einem älteren 31 , 32 , 33 , 34 , 35 eine fortschreitende Reduktion des autophagischen Prozesses nach einem Verlust der Muskelmasse (bezeichnet als Sarkopenie) 32 , 33 , 34 beobachtet , 35 , 36 , 37 und im Überleben von Myofiber 38 . Eine enge Beziehung zwischen Autophagie und dem regenerativen Potenzial der Skelettmuskulatur wurde von einer Studie aus dem Labor von Wagers erwartet, die zeigte, dass eine Kalorienrestriktion die Verfügbarkeit und Aktivität von MuSC erhöht. Dieses neinWurde durch die jüngste Beobachtung weiter unterstützt, dass die Foxo3-Notch-Achse den autophagischen Prozess während der Selbsterneuerung 40 und den MuSC-Übergang vom Ruhe- zum Proliferationszustand 41 aktiviert. Diese Daten stimmen mit der fortschreitenden Verringerung der Basalautophagie von jungen zu alten und geriatrischen MuSCs in Verbindung mit dem numerischen und funktionalen Abfall der MuSCs während des Alterns überein 42 . In einer neueren Arbeit zeigten wir eine enge Beziehung zwischen Autophagie und der kompensatorischen Muskelregeneration, die die frühen Stadien der DMD-Progression unterscheidet. Dementsprechend beobachteten wir einen reduzierten autophagischen Fluss bei späteren Stadien des Krankheitsverlaufs, wenn die Muskelregeneration beeinträchtigt ist und eine fibrotische Gewebeablagerung auftritt. Faszinierend zeigten wir, dass in regenerierenden Zuständen Autophagie in MuSCs aktiviert wird und dass die Modulation des autophagischen Prozesses die MuSC-Aktivierung und fu beeinflusstNktionalität 30 Insgesamt zeigen diese Daten die Dringlichkeit, den autophagischen Prozess in MuSCs während der Muskelregeneration in normalen und pathologischen Zuständen und während der gesamten Lebensdauer zu erforschen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Überwachung des autophagischen Prozesses in MuSCs in Muskelregenerationsbedingungen durch die Durchführung von in situ Immunfärbung für Mikrotubuli-assoziiertes Protein 1A / 1B-leichte Kette 3 (LC3), ein Marker von Autophagie 43 und MyoD, ein Marker von Myogene Abstammung, in Muskelgewebeabschnitten von der Kontrolle und verletzten Mäusen. Die genannte Methodik ermöglicht die Überwachung des autophagischen Prozesses in einem bestimmten Zellkompartiment, dem MuSC, das eine Schlüsselrolle bei der Orchestrierung der Muskelregeneration spielt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:332px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:251px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:128px;">000664</td>
			<td style="width:196px;">WT mice</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cardiotoxin 1</td>
			<td>Latoxan</td>
			<td>L8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Millex-VV</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td style="width:196px;">Syringe Filter Unit, 0.1 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Chloroquine diphosphate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">BD Micro-Fine + 0,5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue-Tek Cryomold Intermediate</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:122px;">o-Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1040</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="136">
			<td height="136" style="height:136px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Eukitt - Quick-hardening mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LC3B Antibody</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>2775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:332px;">Monoclonal mouse anti-MyoD 
			(concentrated) clone 5.8A</td>
			<td>DAKO - Agilent Pathology Solutions</td>
			<td>M3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Laminin-2 (&#945;-2-chain) monoclonal antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>4H8-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A21248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ immunofluorescent staining of autophagy in muscle stem cells

Zunehmende Beweise weisen auf Autophagie als einen entscheidenden regulatorischen Prozess zur Erhaltung der Gewebshomöostase. Es ist bekannt, dass Autophagie an der Skelettmuskelentwicklung und -regeneration beteiligt ist und der autophagische Prozess in mehreren Muskelpathologien und altersbedingten Muskelstörungen beschrieben wurde. Ein kürzlich beschriebener Block des autophagischen Prozesses, der mit der funktionellen Erschöpfung von Satellitenzellen während der Muskelreparatur korreliert, unterstützt die Vorstellung, dass aktive Autophagie mit einer produktiven Muskelregeneration gekoppelt ist. Diese Daten zeigen die entscheidende Rolle der Autophagie bei der Aktivierung von Satellitenzellen während der Muskelregeneration sowohl bei normalen als auch bei pathologischen Zuständen wie Muskeldystrophien. Hier stellen wir ein Protokoll zur Überwachung des autophagischen Prozesses im erwachsenen Muskelstammzell (MuSC) -Feld während Muskelregenerationsbedingungen zur Verfügung. Dieses Protokoll beschreibt die Setup-Methodik zur Durchführung in situ Immunfluoreszenz-Bildgebung von LC3, aUtophagie-Marker und MyoD, eine myogene Linie Marker, in Muskelgewebe Abschnitte von der Kontrolle und verletzte Mäuse. Die beschriebene Methodik ermöglicht die Überwachung des autophagischen Prozesses in einem bestimmten Zellkompartiment, dem MuSC-Kompartiment, das eine zentrale Rolle bei der orchestrierenden Muskelregeneration spielt.

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente In-situ- Methode, um Autophagie in MuSCs während der Muskelregeneration zu erkennen. CTX In vivo Behandlungen: Verwenden Sie CTX, um Muskelschäden in TA-Muskeln zu induzieren und verwenden Sie ungestörte Muskeln als Kontrollen. Da Autophagie hochdynamisch ist, blockieren Sie den autophagischen Fluss durch...

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In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Aktive Autophagie ist mit produktiven Muskelregeneration verbunden, die für die Muskelstammzell-Aktivierung (MuSC) essentiell ist. Hier stellen wir ein Protokoll für die in situ- Detektion von LC3, einen Autophagie-Marker in MyoD-positiven MuSCs von Muskelgewebeabschnitten von Kontroll- und verletzten Mäusen zur Verfügung.

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

in-situ-immunofluorescent-staining-of-autophagy-in-muscle-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

10.1K Aufrufe.  Italian National Research Council.  Aktive Autophagie ist mit produktiven Muskelregeneration verbunden, die für die Muskelstammzell-Aktivierung (MuSC) essentiell ist. Hier stellen wir ein Protokoll für die in situ- Detektion von LC3, einen Autophagie-Marker in MyoD-positiven MuSCs von Muskelgewebeabschnitten von Kontroll- und verletzten Mäusen zur Verfügung. 

Serie: In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Verfahren für die Ratte<em&gt; In situ</em&gt; Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Forschung

Biologie

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Bewertung von Muscle Funktion des Extensor digitorum longus<em&gt; Ex vivo</em&gt; Und Tibialis anterior<em&gt; In situ</em&gt; In Mäuse

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...