Muskelstammzellen bleiben mit ihrer endogenen Nische assoziiert und können beispielsweise durch siRNA-Transfektion leicht manipuliert werden. Diese Methode ermöglicht es, Muskelstammzellen in Kultur in einem Umfeld zu analysieren, das der In-vivo-Situation stärker ähnelt als Standard-2D-Kulturmodelle, indem die Nische erhalten bleibt. Beginnen Sie mit dem Schneiden steriler Pasteurpipetten mit einem Diamantstift.
Verwenden Sie für jede Maus eine Großbohrpipette mit einer Öffnung von etwa 0,3 Zentimetern und einer Länge von etwa 10 bis 12 Zentimetern und eine zweite Glaspipette mit einer kleinen Öffnung von etwa 0,1 Zentimetern und einer Länge von etwa 22 Zentimetern. Glätten Sie die Kanten beider Pipetten, indem Sie die Pipettenspitzen mit sanfter Bewegung fünf bis 10 Sekunden in der Flamme eines Bunsenbrenners halten. Beschichten Sie beide Pipetten unmittelbar vor Gebrauch mit sterilem Pferdeserum, indem Sie die gesamte Pipette fünf Minuten lang mit 2 Millilitern Pferdeserum füllen, dann das Pferdeserum injizieren und die Pipetten fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.
Besprühen Sie alle Geräte und die Hinterbeine der Maus mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine gehärtete, fein gebogene Schere und eine feine Pinzette, um die Haut zu entfernen und die darunter liegenden Muskeln freizulegen. Entfernen Sie die umgebende Faszie mit der fein gekrümmten Pinzette, ohne die darunter liegenden Muskeln zu beschädigen.
Um die Tibialis anterior oder TA zu entfernen, greifen Sie die distale TA-Sehne mit einer Pinzette und schneiden Sie sie mit einer feinen Schere ab. Während Sie die TA an der Sehne halten, ziehen Sie sie in Richtung Knie und schneiden Sie den Muskel in der Nähe des Knies ab, um den EDL-Muskel freizulegen. Heben Sie die distale EDL-Sehne mit einer gebogenen Pinzette an und schneiden Sie sie mit einer feinen Vannas-Federschere.
Legen Sie die proximale EDL-Sehne frei, indem Sie die EDL vorsichtig in Richtung Knie ziehen. Dann schneiden Sie die proximale Sehne mit einer Schere ab. Inkubieren Sie die EDL-Muskeln im Reaktionsrohr bei 37 Grad Celsius in einem zirkulierenden Wasserbad.
Stoppen Sie die Verdauung, wenn sich die Muskeln lockern und einzelne Meilenfasern sichtbar sind. Das Arbeiten unter einem sterilen Binokularmikroskop, das mit einer Heizplatte ausgestattet war, spülte die Muskeln mit der großen Bohrpipette mit warmem Isolationsmedium. Dissoziieren Sie die Muskeln mit der Großbohrungspipette, bis die gewünschte Anzahl von Myofibern frei in der Lösung schwimmt.
Um die Ablagerungen zu waschen, verwenden Sie die Glaspipette mit kleiner Bohrung, um nicht kontrahierte Myofiber in die zweite mit Isolationsmedium gefüllte Vertiefung zu übertragen. Dann übertragen Sie 50 bis 100 nicht kontrahierte Myofiber in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die mit Myofiber-Kulturmedium gefüllt ist. Inkubieren Sie die Myofiber bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 72 bis 96 Stunden.
Transfizieren Sie Myofiber-assoziierte Muskelstammzellen vier Stunden nach der Myofiber-Isolierung. Kombinieren Sie 25 Mikroliter Opti-MEM mit dem jeweiligen Volumen der siRNA mit 25 Mikrolitern Opti-MEM, die 1,5 Mikroliter Transfektionsreagenz enthalten. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung für fünf Minuten und geben Sie sie zu den Zellen in der 24-Well-Platte.
Dann die Platte bei 37 Grad Celsius aus Respekt vor der Zeit inkubieren. Hier werden nur kritische Schritte des Immunfluoreszenz-Färbeprotokolls demonstriert. Verwerfen Sie vorsichtig das Myofiber-Kulturmedium, während Sie eine Lösung im Brunnen lassen.
Fügen Sie 500 Mikroliter 2% Paraformaldehyd hinzu, um die Myofiber mit ihren benachbarten Muskelstammzellen zu fixieren. Den Teller fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie die Myofiber dreimal mit PBS.
Bedecken Sie die Platte während der Inkubationsschritte nach der Inkubation mit sekundären Antikörpern mit Alufolie. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um einen Kreis auf einem mikroskopisch kleinen Objektträger aus Glas zu zeichnen. Dann die Myofiber in möglichst kleinem Volumen auf den Objektträger übertragen und dispergieren.
Entfernen Sie die Restflüssigkeit mit der Kleinen Pasteurpipette oder einer 200 Mikroliter Pipette. Verwenden Sie zwei Tropfen wässriges Montagemedium und bedecken Sie die Myofiber mit einem Abdeckzettel. Lassen Sie die Objektträger dann trocknen und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius im Dunkeln, gefolgt von einer mikroskopischen Analyse.
Dieses Protokoll zeigt die Ableitung und Kultur einzelner Myofiber aus murinen EDL-Muskeln. Die Immunfluoreszenzfärbung für Pax7 wurde verwendet, um Kerne von Muskelstammzellen zu identifizieren. Der vergrößerte Bereich legt das Myofiber mit seiner angrenzenden Muskelstammzelle frei und demonstriert das PAX7-Immunfluoreszenzsignal im Kern einer Muskelstammzelle.
Die myogene Progression von Muskelstammzellen kann durch Markerexpression analysiert werden. Das Vorhandensein von Pax7 und das Fehlen der MyoD-Expression ist mit ruhenden Muskelstammzellen frisch isolierter Myofasern assoziiert. Die MyoD-Expression kann in proliferierenden Muskelstammzellen beobachtet werden.
Nach 72 Stunden bilden Muskelstammzellen Cluster von Nachkommen mit unterschiedlichen myogenen Zuständen, die mit der Expression verschiedener myogener Marker einhergehen. Pax7-Only-Zellen sind selbsterneuernde Stammzellen. Pax7 und MyoD doppelt positive Zellen vermehren sich.
Während myo D nur Zellen differenzierende Zellen sind. Die siRNA-Transfektion von Muskelstammzellen zeigte eine Akkumulation von zytoplasmatischer siRNA in granularer Weise, was auf eine effiziente Aufnahme hinweist. Die Quantifizierung von transfizierten Pax7-positiven Zellen pro Myofiber ergab, dass die Anzahl der transfizierten Zellen nach 30 Stunden um bis zu 74% anstieg, ohne dass sich dies nachteilig auf die Anzahl der Muskelstammzellen auswirkte.
Wenn Sie dieses Protokoll ausprobieren, ist es von größter Wichtigkeit, die EDL sorgfältig zu sezieren, ohne Schaden anzurichten. Neben der siRNA-Transfektion ist die Analyse transgener Tiere oder die Inkubation mit rekombinanten Proteinen für weitere Funktionsanalysen von Muskelstammzellen auf ihren benachbarten Myofibern möglich.
