Die Autoren erkennen dankbar die Arbeit von Dr. Mohamad Navab, Alan Fogelman und Srinivasa Reddy für ihre Schlüsselrolle bei der Entwicklung der früheren Iterationen dieses Modells. T.A.A. wird unterstützt durch eine RMIT University Vice-Chancellor Postdoctoral Fellowship. AJ und AH werden durch NHMRC Projekt Grant 1108792 unterstützt. TK stützt sich auf NIH gewährt NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.

alle Experimente mit menschlichen biologischen Proben wurden mit Genehmigung der Ethik an der Universität von Kalifornien-Los Angeles, Los Angeles und der Alfred Hospital menschliche Ethik-Kommission, Melbourne durchgeführt.
 Hinweis: Es gibt viele Variationen der Fluorochrom HDL-Funktion Assay (siehe Diskussion) 32. Im folgenden beschreiben wir das Protokoll, das die beständigsten und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Eine Übersicht des Tests ist in Abbildung 2 dargestellt.
 1. Probe Verarbeitung <ol><li>Verwendung frischer, nicht hämolysiert Serum (in Serum Separator Rohre gesammelt werden können) oder Citrat-Plasma nach 12-14 Stunden Fasten erhalten. Wenn kryokonservierte Proben verwenden, enthalten entsprechende Steuerung, wie in diesem Protokoll beschrieben.</li>
</ol> 2. Tag 0-Vorbereitung auf den Test <ol><li>Prepare arbeiten Layout des Experiments mit den entsprechenden Kontrollen, Proben und repliziert. Führen Sie jede Probe mindestens im Triplicates. Eine Vertreter 96 gut Layout ist in Abbildung 3 dargestellten.</li>
	<li>Berechnen alle Bände der Reagenzien, die für den Assay, basierend auf der Anzahl von Mustern und Wiederholungen verwendet werden. 
	Hinweis: Enthalten ein zusätzliches Volumen von 10 % in jede Aktie arbeiten, stellen Sie sicher, es gibt genügend Volumen für jedes Reagens für das spezifische Experiment.</li>
	<li>Beschriften Sie alle erforderlichen Rohre für alle Stufen des Assays z. B. für die Trennung von HDL, Messung von HDL-C (optional) und die Fluorochromeassay.</li>
</ol> 3. Tag 1-Vorbereitung von Steuerelementen <ol><li>Vorbereitung der studienspezifischen gepoolten Kontrolle <ol><li>Erstellen einer Kontrollprobe von gepoolten Plasma oder Serum alle Studie Proben. Wenn 20 Proben in jede Platte in dreifacher Ausfertigung ausgeführt, kombinieren Sie 10 µL von jeder Probe in ein Steuerelement 200 µL gebündelt. Geben Sie eine separate Aliquot der gepoolten Kontrolle im klinischen Labor den HDL-C-Wert dieses Steuerelements bestimmen. 
		Hinweis: Verwenden Sie dieses gebündelte Steuerelement Assays zu standardisieren und alle möglichen bekannten entfallen (z.B. Art des Matrix-Serum im Vergleich zu Plasma, Frost-Tau-wechseln, Kryokonservierung) und unbekannte Störfaktoren, die experimentelle Variabilität beeinträchtigen 27 , 28.</li>
	</ol></li> <li>Vorbereitung der Labor-spezifische Qualitätskontrolle (QCs) <ol><li>bereiten einen großen Vorrat an HDL in jedem Labor (z. B. HDL von 5 mL Plasma von 10 gesunden Spendern isoliert) und mehrere Aliquote das Tiefgefrieren Lager, Frost-Tau-Wechseln zu minimieren.</li>
		<li>Nutzung von mindestens 10 verschiedenen repliziert aus diesem Bestand den Durchschnittswert des HDLox zu bestimmen. Ein akzeptablen Bereich des gemessenen HDLox Werte für jede QC-Probe in jedem Assay enthalten innerhalb ist &#60; 15 % von der Variationskoeffizient der durchschnittlichen Wert.</li>
		<li>Geben eine separate Aliquot der gepoolten Kontrolle im klinischen Labor, HDL-C-Wert dieses Steuerelements (z.B. 40 mg/dL) zu bestimmen. 
		Hinweis: Eine detaillierte Vorgehensweise wie Blut von Blutbanken verwenden, um diese Steuerelemente erstellen beschrieben 27 , 28 , 32 bislang. Bei Bedarf zusätzliche QCs verwenden (z.B. eine eines gesunden Spenders bekannt, normale HDL-Funktion und einer von einem Spender bekannt, weitgehend abnormale HDL-Funktion haben.</li>
	</ol></li> <li>Optimierung von Hintergrundsignal und leere Werte (optional) <ol><li>um Hintergrund zu minimieren, fügen Sie die entsprechende Menge an Katalase (1-4 U/mL) Inkubation Mittel-und rasch gebildeten H 2 O entfernen 2 durch spontane Luftoxidation der Puffer. 
		Hinweis: Da die Werte aus den leeren Brunnen (keine HDL) die Werte der HDL Proben abgezogen wird sind und die Ergebnisse werden berichtet relativ zu einem gepoolten Steuerelement (das in der gleichen 96-well-Platte enthalten ist), fanden wir, dass dieser Schritt nicht praktisch Affec tut t die Ergebnisse. So kann Optimierung der Hintergrundsignal mit Katalase verzichtet werden, wenn erforderlich.</li>
	</ol></li></ol> 4. Tag 1-Trennung von HDL-Cholesterin HDL Niederschlag mit Hinweis: verwenden Sie ein handelsübliches standardisierte HDL-Cholesterin auslösenden Reagenz ApoB erschöpft Serum nach Angaben des Herstellers zu isolieren &#39; s Anweisungen. Diese Reagenzien sind weit verbreitet in farbmetrischen Assays, um HDL-Cholesterin-Werte zu bestimmen.
<ol><li>Plasma oder Serum Probe frisch verwenden (oder Auftauen).</li>
	<li>Mix gleiche Volumina (z.B. 80 µL) Plasma und HDL-Cholesterin Fällung Reagenz (20 % w/V Polyethylenglykol in Glycin Puffer bei pH 10,0 (25 ° C)).</li>
	<li>Mix gut von oben und unten pipettieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 1000-2000 x g für 10 min.</li>
	<li>Aspirieren den überstand (HDL Bruch).</li>
	<li>Verwenden Sie isolierte HDL im Idealfall sofort für die Fluorochromeassay der Lipidperoxidation HDL. Jedoch wenn mehrere Proben am selben Tag ausgeführt werden und andere Schritte wie Messung der Konzentration von HDL-Cholesterin sind auch getan, dann die isolierte HDL bei 4 ° C lagern und verwenden Sie es am nächsten Tag für die FluorochromeHDL-Funktion Test.</li>
</ol> 5. Tag 1-Bestimmung des HDL-C in isolierte HDL Hinweis: dieser Schritt ist optional, wenn der Wert des HDL-C aus dem klinischen Labor verwendet wird, um HDLox zu normalisieren von HDL-C-Menge.
<ol><li>Quantify das HDL-Cholesterin aus dem Plasma, mit Standard-farbmetrische assays 27. 50 µL Reagenz Cholesterin in jede Vertiefung hinzufügen und bestimmen, Cholesterin-Konzentration mit einer kolorimetrischen Platte-Leser und eine Cholesterin-standard in jedem Kit zur Verfügung gestellt.</li>
</ol> 6. Tag 2-Vorbereitung der Reagenzien <ol><li>bereiten HRP und Cholesterin-Lösungen von HRP 5 U/mL Lösung (Bereich 1-10 U/mL).</li>
	<li>20 mM bereiten Fluorochrom (z. B. Amplex Red) Lösungen: ein Fläschchen Fluorochrom Reagenz und DMSO auf Zimmertemperatur auftauen. Vor dem Gebrauch lösen Sie Fluorochrom Reagenz (1 mg) in 200 µL von DMSO auf. Speichern-Stammlösung auf eingefroren &#8804;-20 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie positive und negative Kontrollen: benutzen Sie 1 X &#39; Reaktion Puffer &#39; Cholesterin und 20 mM H 2 O 2 arbeiten ohne Lösung als negative und positive Kontrolle bzw..</li>
</ol> 7. Tag 2-Fluorochrom Assay <ol><li>hinzufügen 50 µL 1 x Reaktion Puffer als Leerzeichen (Negativkontrolle).</li>
	<li>Optional: positiv-Kontrolle in jeder Platte 20 mM Arbeitslösung von H 2 O 2 Agrega.</li>
	<li>Experimentelle Variabilität zu minimieren und sicherzustellen, dass Zusatz von Reagenzien und Proben werden konsequent durchgeführt und in einer fristgerechten Weise, führen alle Ergänzungen der Proben in einer separaten 96 gut Rundboden, klar, Polystyrol oder Polypropylen Platte (Platte 1). Verwenden Sie dann eine Mehrkanal-Pipette übertragen bestimmte Volumes in 3 96-Well-Platten (Platten 2-4: Polypropylen, flache BotTom, schwarz) (das haben identische Layout) ( Abbildung 2, Abbildung 3).
	<ol><li>Z. B. zunächst 160 µL isolierte HDL in jede gut/Probe der Platte 1 hinzufügen und dann mit dem Einsatz von Mehrkanal-Pipette übertragen 50 µL des HDL-Cholesterins von jeder gut/Probe in der schwarzen 96-Well Platten. Tipps zwischen jeder Zeile/Spalte ändern und verwenden Sie ungefilterte Tipps für alle Transfers.</li>
	</ol></li> <li>Proben in den Brunnen zu verlassen. Nicht wegwerfen. Es gibt keine Wäsche-Stufen zwischen Zugabe von Reagenzien.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL HRP-Lösung 5 U/mL (0,25 U) in jede Vertiefung. 
	Hinweis: Verwenden Sie HRP vor der Zugabe des Reagenz Fluorochrom.</li>
	<li>30 min bei 37 ° c inkubieren Entsorgen Sie Proben nicht nach der Inkubation (keine Wäsche Schritte zwischen Ergänzungen von Reagenzien).</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL des Fluorochromereagent für eine Endkonzentration von 300 µM. Zu diesem Zeitpunkt insgesamt Reaktionsvolumen beträgt 150 µL. gut mischen und vor Licht schützen.</li>
	<li>Bewerten das fluoreszierende auslesen (im Dunkeln) jede Minute mehr als 120 min bei 37 ° C mit einem fluoreszierenden Platte-Lesegerät (530/590 nm-Filter). 
	Hinweis: Verwenden Sie ein kürzeres 60-Minuten-Intervall mit frische Proben. Wir haben festgestellt, dass 120-Minuten-Test gibt mehr reproduzierbaren Daten mit der Verwendung von kryokonservierten Proben.</li>
	<li>Daten, die mittels geeigneter Software.</li>
</ol> 8. Tag 3-Datenanalyse <ol><li>Fluoreszenz Einheiten (willkürliche Einheiten) 120 Minuten nach Zugabe von Fluorochrom Reagenz für alle Proben einschließlich leere Brunnen aufnehmen und alle Steuerelemente.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert der Fluoreszenz-Einheiten (basierend auf mindestens triplicates) (HDL Ox_sample). Nehmen Sie nicht Ausreißer (&#62; 2 SDs vom Mittelwert) in Betracht.</li>
	<li>Subtrahieren die Hintergrundfluoreszenz mithilfe der folgenden Formel: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg" /></li> <li>Normalisierung für HDL-Cholesterin-Betrag (HDL-C): Normalisierung den HDLox Lipid Peroxidation Wert für jede Probe (einschließlich der gepoolten Kontrolle) von HDL-C) (mg/dl). In dem Abschnitt "Ergebnisse" präsentiert sich HDL Ochsen als n (HDL-C) HDLox Maßnahme entsprechend der Einstellung für HDL-C. Verwenden Sie die folgende Gleichung: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg" /></li> <li>die Expression von HDLox Lipid Peroxidation Wert jeder einzelnen Probe gegen den Wert eines Steuerelements gepoolten zu standardisieren. N (HDL-C) HDLox Lipid Peroxidation Wert für jede Probe (bereinigt um HDL-C) von n (HDL-C) HDLox Lipid Peroxidation Wert des Steuerelements gebündelt zu normalisieren. In dem Abschnitt "Ergebnisse" präsentiert sich HDL Ochsen als nHDL Ochsen Maßnahme entsprechend der Einstellung für experimentelle Variabilität und HDL-C. Verwenden Sie die folgende Gleichung: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg" /> Hinweis: dieser Ansatz ist ähnlich zu anderen etablierten experimentellen Ansätzen, wie experimentelle Variabilität von Messungen zu reduzieren International normalized Ratio (INR) 44 , 45. Dieser Ansatz wurde in klinischen Studien 32 , 33 , 34 , 35 , 36 validiert , 37 , 38 , 39.</li> <li>Qualitätskontrolle von Versuchsergebnissen mit standard Qualitätskontrolle Proben durchführen. Jedes Labor sollte eigene Qualitätskontrollen (QCs) festlegen. Im Idealfall gibt es einen QC für nHDLox aus einer Stichprobe mit bekannten dysfunktionalen HDL und QC für nHDLox aus einer Stichprobe von gesunden Spendern [z.B. Verwendung gepoolten Probe von jungen Erwachsenen, die etablierten Blutbank Geber und haben keine bekannten Komorbidität und Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Krankheiten, einschließlich Rauchen]. Die letztere Kontrolle standardisiert Ergebnisse unter verschiedenen Labors. Die Durchschnittswerte der diese QCs sind etablierte basierend auf mindestens 5 Wiederholungen (in der Regel verwenden wir für diesen wichtigen Schritt 10 Wiederholungen).
	<ol><li>Check ob gemessene QCs in jeder Probe haben innerhalb des erwarteten Bereichs der Werte schätzt. Angenommen, eine akzeptable maximale experimentelle Variabilität von 15 %, sollten alle experimentellen Messwerte in 15 % der bekannten durchschnittliche Werte von etablierten QC fallen. Verwenden Sie die folgenden Gleichungen: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg" /> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg" /> Hinweis: Wenn entweder die inklusive Qualitätskontrolle Proben ( Normal im Vergleich zu dysfunktionalen HDL) HDLox Werte außerhalb der erwarteten Bereich (gegründet in jedem Labor) gibt, dann wiederholen Sie den Versuch.</li>
	</ol></li> <li>Durchführen Qualitätskontrolle der experimentellen Ergebnisse mit den Variationskoeffizienten (CV), um experimentelle Variabilität zu quantifizieren: wiederholen Sie alle Proben mit CV % &#62; 15 %. Verwenden Sie die folgende Gleichung: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg" /> Hinweis: eine typische Intra-Assay (innerhalb der gleichen Platte) und Inter-Assay (unter verschiedenen Platten) experimentelle Variabilität ist &#60; 15 %. 2) ein typisches Intra-Assay-Lebenslauf ist zwischen 1-7 % und eine typische Interassay Lebenslauf zwischen 3-10 ist %.</li>
</ol>

Dieses Protokoll und Test sind relevant für das patent PCT/US2015/018147.

Das hier beschriebene Protokoll bietet ein robustes Werkzeug um wichtige Forschungsfragen bezüglich der Rolle von HDL-Funktion bei Arteriosklerose und menschliche Krankheit zu beantworten. Der Assay quantifiziert den HDL Lipid Peroxid Inhalt pro mg HDL-C enzymatische Verstärkung (HRP). Dieser Ansatz vermeidet bekannte Einschränkungen der vorherige HDL-Funktion-Assays (z. B. Cholesterin-Efflux-Assay) einschließlich erhebliche Heterogenität in Bezug auf Arten der verwendeten Zellen, Art der Anzeige gemeldet, fehlende ...

Arteriosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) ist die führende Ursache des Todes weltweit1,2. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass geringe Mengen an High-density-Lipoprotein (HDL) Cholesterin in der Regel umgekehrt das Risiko für die Entwicklung von Atherosklerose1,2zugeordnet sind. Obwohl einige Studien eine Atheroprotective Rolle für HDL1,2unterstützen, ist der Mechanismus, mit dem HDL die Initiierung und Progression der Atherosklerose dämpft, komplex 3,4. So wurde vermutet, dass die komplexe Struktur und Funktion des HDL statt absolute Ebene Atherosklerose 5,6,7,8genauer vorhersagen können. Mehreren Veränderungen HDL Protein- und Lipid kompositorischen, die HDL-Funktion beeinträchtigen in entzündlichen Zuständen wie Arteriosklerose. Diese i) reduzieren seinen Cholesterin Efflux potenzielle 9, Ii) verringern Sie anti-entzündliche und Erhöhung der HDL-assoziierten entzündungsfördernde Proteine 6,7, (Iii) Abnahme Antioxidans Faktorstufen und Aktivität und HDLs Fähigkeit zur Hemmung der Oxidation von Low Density Lipoprotein (LDLox)10 und iv) Lipid Hydroperoxid Inhalt und Redox-Aktivität (HDLox)9,11zu erhöhen. Robust-Assays, die die Pleotropic Funktionen des HDL (z. B. Cholesterin Efflux, antioxidative Funktion) auswerten können Bestimmung des HDL-HDL-C in der Klinik ergänzen.
HDL-Funktion wird in der Regel durch Zell-basierte Methoden wie das Cholesterin Efflux Assay8,12,13,14bewertet. Diese Methoden haben wesentliche Einschränkungen einschließlich erhebliche Heterogenität in Bezug auf Arten der verwendeten Zellen, Art der Anzeige gemeldet, fehlende Standardisierung und verwirrende Effekte von Triglyceriden 7,15. Diese Nachteile aufwerfen Schwierigkeiten für große klinische Studien16. Zellfreie Assays können robustere Maßnahmen der HDL-Funktion im Vergleich zu zellbasierte Assays geben. Der Cholesterin-Efflux ist eine der wichtigsten Funktionen von HDL, aber es kann nur durch zellbasierte Assays ermittelt werden. Andere Ansätze zur HDL-Funktion wie Proteomics17,18,19,20,21,22,23zu bestimmen, 24 und zellbasierte Monocyte Chemotaxis-Assays HDL Funktion 17,22,25 nicht standardisiert wurden und nicht in großem Maßstab Studien am Menschen verwendet werden.
HDL hat bedeutende antioxidative Atheroprotective Effekt5,6,7,8. Die antioxidative Funktion von HDL wurde im Beisein von LDL in vorherigen Zelle frei fluorometrischen Assays 26bestimmt. Diese biochemischen fluorometrischen Methoden der HDL antioxidative Funktion wurden ursprünglich von Mohamad Navab und Alan Fogelman und ihre Kollegen26entwickelt. Obwohl viele Studien am Menschen diese Methoden verwendet haben, um festzustellen, HDL Funktion 17,18,19,20,21,22,23 ,24, Lipid (HDL)-Lipid (LDL) und Lipid-Fluorochrom Interaktionen begrenzen Reproduzierbarkeit dieser Zelle frei nicht-enzymatische biochemischen Assays HDL Funktion27,28.
Vor kurzem Interesse konzentriert sich auf die funktionellen Konsequenzen der HDL-Oxidation, die das Ergebnis der Oxidation von Lipiden und Proteinen innerhalb von HDL 27,29,30. Frühere Studien haben gezeigt, dass Oxidation von HDL HDL Funktion 27,29,30beeinträchtigt. HDL hat eine Hauptrolle in Lipid Peroxid Transport und hohes Maß an Lipid-Peroxide bezieht sich auf abnormale HDL-Funktion. Somit kann HDL Lipid Peroxid Inhalte zur Bestimmung der HDL-Funktion 9,17,20,31 und angesichts der bekannten Grenzen der vorherige Assays von HDL-Funktion7, 15,27,32, wir entwickelt alternatives fluorometrisch Verfahren, das HDL Lipid Peroxid Inhalt (HDLox) 32quantifiziert. Diese Methode basiert auf der Enzym-Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Fluorochrom Amplex Red, die (ohne Cholesterin Oxidase) Peroxid Fettgehalt pro mg von HDL-C 32quantifizieren können. Die biochemische Prinzip des Tests ist in Abbildung 1dargestellt. Wir haben gezeigt, dass diese Fluoreszenz basierenden Ansatz nicht die Grenzen der vorherige HDL Funktion Assays27,28. Dieser Assay wurden weiter verfeinert und in unserem Labor standardisiert, so dass es in großem Maßstab Studien am Menschen selbst mit kryokonservierten Plasma 32,33,34, zuverlässig genutzt werden kann 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. das Auslesen dieser Assay ist verbunden mit Anzeigen von validierten zellbasierte Assays, Surrogat Maßnahmen der Herz-Kreislauf-Krankheit, systemische Entzündung, Immun-Dysfunktion und damit verbundene Risiko für Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen Phänotypen 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. hier beschreiben wir diese einfache, aber robuste Methode zur Messung der HDL Peroxid Lipidgehalt (HDLox). Dieser Assay kann als Werkzeug verwendet werden, um wichtige Forschungsfragen bezüglich der Rolle von HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit zu beantworten wo systemische Entzündung, oxidativer Stress und oxidierten Lipide haben eine wichtige Rolle (z.B. Arteriosklerose)32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent</td>
			<td>Pointe Scientific</td>
			<td>H7511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red reagent.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Radish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Esterase.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cholesterol Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Resorufin fluorescense Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Reaction Buffer.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL Cholesterol Automated Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>TR39601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, black).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 200, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>14-488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>&#160;14-387--955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 2.01 software</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Plate reader</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein

Niedrige High-density-Lipoprotein-Cholesterin (HDL-C) Ebenen sind einer der leistungsstärksten unabhängigen negative Prädiktoren für arteriosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Die Struktur und Funktion von HDL statt HDL-C können Arteriosklerose genauer vorherzusagen. Mehreren Veränderungen HDL Protein- und Lipid kompositorischen, die HDL-Funktion beeinträchtigen in entzündlichen Zuständen wie Arteriosklerose. HDL-Funktion richtet sich normalerweise nach zellbasierte Assays wie Cholesterin-Efflux-Assay, aber diese Tests haben zahlreiche Nachteile fehlende Standardisierung. Zellfreie Assays können robustere Maßnahmen der HDL-Funktion im Vergleich zu zellbasierte Assays geben. HDL-Oxidation beeinträchtigt HDL-Funktion. HDL hat eine Hauptrolle in Lipid Peroxid Transport und hohes Maß an Lipid-Peroxide bezieht sich auf abnormale HDL-Funktion. Lipid-Sonde Interaktionen sollten als Interpretation der Ergebnisse der nicht-enzymatische Fluoreszenz Tests zur Messung der Lipid oxidativen Status berücksichtigt werden. Dies hat uns motiviert, entwickeln eine zellfreie biochemische enzymatische Methode zur HDL Peroxid Lipidgehalt (HDLox) zu ermitteln, die zur HDL Dysfunktion beiträgt. Diese Methode basiert auf der Enzym-Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Fluorochrom Amplex Red, die (ohne Cholesterin Oxidase) Peroxid Fettgehalt pro mg von HDL-c quantifizieren kann Hier ist ein Protokoll Describedfor Bestimmung des HDL-Lipid Peroxidation verwenden das Fluorochrom-Reagenz. Assay-Variabilität kann durch strikte Standardisierung der experimentellen Bedingungen reduziert werden. Höhere HDLox Werte sind verringerte HDL antioxidative Funktion zugeordnet. Das Auslesen dieser Assay ist verbunden mit Anzeigen von validierten zellbasierte Assays, Surrogat Maßnahmen von kardiovaskulären Erkrankungen, systemische Entzündung, Immun-Dysfunktion und damit verbundene Risiko für Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen Phänotypen. Dieser technische Ansatz ist eine robuste Methode zur HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit zu beurteilen, wo systemische Entzündung, oxidativer Stress und oxidierten Lipide eine wichtige Rolle (z.B. Arteriosklerose haben).

50 µL jeder HDL-Probe werden in jedem Brunnen wie in Schritt 7.3 hinzugefügt. 50 µL HRP-Lösung 5 U/mL (0,25 U) werden dann in jedem Brunnen wie in Schritt 7,5 hinzugefügt. Proben sind für 30 min bei 37 ° C wie in Schritt 7.6 inkubiert. 50 µL Reagenz Fluorochrom sind dann in jedem Brunnen wie in Schritt 7,7 (Endkonzentration von 300 µM) hinzugefügt. Das fluoreszierende auslesen (im Dunkeln) wird dann jede Minute mehr als 120 Minuten bei 37 ° C mit einem fluoreszierenden Platte-L...

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Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Wir beschreiben hier ein fluorometrisch zellfreie biochemischen Assays zur Bestimmung von HDL-Lipidperoxidation. Dieser schnellen und reproduzierbaren Assay kann zur HDL-Funktion in groß angelegte Studien zu bestimmen und zu unserem Verständnis der HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit beitragen kann.

Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

cell-free-biochemical-fluorometric-enzymatic-assay-for-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.2K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Wir beschreiben hier ein fluorometrisch zellfreie biochemischen Assays zur Bestimmung von HDL-Lipidperoxidation. Dieser schnellen und reproduzierbaren Assay kann zur HDL-Funktion in groß angelegte Studien zu bestimmen und zu unserem Verständnis der HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit beitragen kann.

Serie: Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein

Zusammenfassung

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