Diese Methode verwendet Fluoreszenz, um zu bestimmen, ob ein Proteintransfer auf biologisch wichtige Liqiden zwischen synthetischen Membranen und damit zur Verteilung dieser Lipide in eukaryotischen Zellen beiträgt. Diese Technik ermöglicht die Extraktion und den Transport eines natürlichen Lipids durch ein Protein, es benötigt und Fluoreszenzzellen und Liposomen, die einfach herzustellen sind. Diese Methode kann verwendet und modifiziert werden, um Einblicke in die Zellbiologie durch Proteine hinter der Verteilung einiger essentieller Lipide zwischen Organ und Membranen zu erhalten.
Die visuelle Demonstration ist entscheidend, um zu erklären, wie Echtzeitmessungen des Lipidtransfers durch Fluoreszenz durchgeführt werden können. So wird das Verfahren auch Maud Magdeleine, eine Ingenieurin für mein Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Zubereitung eines frischen gefilterten und entgasten HEPES-Kaliumacetatpuffers, der mit einem millimolaren Magnesiumchlorid ergänzt wird, um einen HKM-Puffer zu bilden.
Bereiten Sie dann Liposomen nur aus PC vor oder zusätzlich mit zwei molaren Prozent PS oder PI(4)P dotiert. Legen Sie nun den Kolben auf einen Rotationsverdampfer, um das Lipid unter Vakuum zu trocknen. Mischen Sie in einer Vertiefung Liposomen mit zwei molaren Prozent PS mit dem Lipidsensor NBD-C2 Lact zu einer Endkonzentration von 250 Nanomolaren und einem Volumen von 100 Mikrolitern.
Füllen Sie eine zweite Vertiefung mit der gleichen Menge Liposom und NBD-C2-Lact, gemischt mit drei mikromolaren Lipidtransferproteinen oder LTP. Füllen Sie eine dritte Vertiefung mit 250 nanomolaren NBD-C2-Lact gemischt mit reinen 80 mikromolaren PC-Liposomen und eine vierte Vertiefung mit reinen 80 mikromolaren PC-Liposomen. Wiederholen Sie diese Schritte, um drei weitere Serien mit vier Bohrungen vorzubereiten.
Legen Sie dann die Multi-Well-Platte in den Fluoreszenzleser. Für jede Bohrung wird ein NBD-Spektrum von 505 bis 650 Nanometern mit einer Bandbreite von fünf Nanometern bei Anregung bei 490 Nanometern bei 25 Grad Celsius aufgezeichnet. Für jede Serie subtrahieren Sie das Spektrum, das nur mit Liposomen aufgezeichnet wurde, von den anderen Spektren.
Für den PI(4)P Extraktionsassay werden Liposomen vorbereitet, die mit zwei molaren Prozent Phosphatidylinositol-4-phosphat dotiert sind, und Messungen mit der NBD-PH FAPP-Sonde durchführen. Führen Sie Kontrollexperimente durch und bestimmen Sie den Extraktionsprozentsatz. Nach Abschluss des Extrudierens füllen Liposomen ein Röhrchen mit diesen extrudierten Liposomen.
Bereiten Sie frisch entgasten und gefilterten HKM-Puffer vor und halten Sie die Röhrchen mit extrudierten Liposomen bei Raumtemperatur. Wickeln Sie Tuben, die Liposomen mit Rhodamin-markiertem Phosphatidylethanolamin enthalten, in Aluminiumfolie und lagern Sie sie in einer undurchsichtigen Box, um ein Bleichen von Fotos zu verhindern. Stellen Sie die Temperatur zwischen 25 und 37 Grad Celsius ein und stellen Sie die Anregungsmonochrommeter auf 460 Nanometer mit einer kurzen Bandbreite von ein bis drei Nanometern und die Emission auf 530 Nanometer bei einer großen Bandbreite von mehr als 10 Nanometern ein.
Stellen Sie die Erfassungszeit auf fünfundzwanzig Minuten mit einer Zeitauflösung von höchstens einer Sekunde ein. In der Quarzküvette verdünnen Sie 30 Mikroliter der LA-Liposomensuspension und nbD-C2-Laktstocklösung und den vorgewärmten HKM-Puffer, um eine 570-Mikroliter-Probe vorzubereiten, die 200 mikromolare Gesamtlipide und 250 nanomolaren oder NBD-C2-Lact enthält. Fügen Sie einen kleinen magnetischen Rührbalken hinzu und positionieren Sie die Küvette im Fluorometerhalter.
Sobald die Probe thermisch ausgeglichen ist, lösen Sie die Messung aus. Nach einer Minute werden der Probe 30 Mikroliter der LB-Liposomensuspension hinzugefügt. Nach drei Minuten injizieren Sie LTP in die Probe, so dass die Endkonzentration des LTP 200 Nanomolar beträgt, und erhalten Dann das Signal für die verbleibenden 21 Minuten.
Führen Sie ein paralleles Experiment durch, um das NBD-Signal zu normalisieren. Mischen Sie 30 Mikroliter LA-Gleichgewichts-Liposomensuspension mit 250 nanomolaren NBD-C2-Lact in HKM-Puffer bei einem Endvolumen von 570 Mikrolitern. Nach einer Minute injizieren Sie 30 Mikroliter LB-Gleichgewichts-Liposomensuspension.
Konvertieren Sie die kinetischen Kurven, die mit einem LTP von Interesse gemessen wurden, um die Menge an PS zu bestimmen, die im Laufe der Zeit von LA- zu LB-Liposomen übertragen wird. Normalisieren Sie dann jeden Datenpunkt der Kurve. Führen Sie das PI(4)P-Experiment unter Verwendung der gleichen Bodenemittereinstellungen und -bedingungen wie für den PS-Transfer-Assay durch.
Mischen Sie in der Küvette 30 Mikroliter lb Liposomensuspension und NBD-PH FAPP-Sonde mit vorgewärmtem HKM-Puffer, um ein Endvolumen von 570 Mikrolitern zu erhalten. Sobald das thermische Gleichgewicht der Probe erreicht ist, beginnen Sie mit der Messung. Nach einer Minute injizieren Sie 30 Mikroliter LA-Liposomensuspension.
Nach drei Minuten injizieren Sie den interessierenden LTP und zeichnen sie das Signal auf. Führen Sie ein zweites Experiment durch, um das NBD-Signal zu normalisieren. Mischen Sie 30 Mikroliter lb Gleichgewichts-Liposomensuspension mit 250 nanomolaren NBD-PH FAPP und 570 Mikrolitern HKM-Puffer.
Nach einer Minute injizieren Sie 30 Mikroliter LA-Gleichgewichts-Liposomensuspension. Konvertieren Sie die kinetischen Kurven, um die Menge an PI(4)P zu bestimmen, die im Laufe der Zeit von LB- zu LA-Liposomen übertragen wird, und normalisieren Sie dann jeden Datenpunkt. Quantifizierung des Ausmaßes, in dem ein LTP effizient ist.
Führen Sie eine lineare Regression der ersten Datenpunkte der Transferkinetik durch, um eine Steigung zu erhalten. Dividieren Sie den Steigungswert durch die LTP-Konzentration im Reaktionsgemisch, um die Anzahl der pro Protein und Zeiteinheit übertragenen Lipidmoleküle zu bestimmen. Die effiziente Rückgewinnung von C2-Lact aus den Perlen wurde mit einer SDS-Seitenanalyse überprüft.
Das ultraviolette sichtbare Absorptionsspektrum von C2-Lact, das mit NBD markiert wurde, bestätigte, dass alle C2-Lact-Moleküle mit einer NBD-Gruppe markiert wurden. Die Reinheit von NBD-C2-Lact und seine Fluoreszenz wurden durch SDS-Seitenanalyse bestimmt. Die Fluoreszenz von NBD-C2-Lact oder NBD-PH FAPP war maximal, wenn nur Liposomen, die PS oder PI(4)P enthielten, für die Inkubation verwendet wurden, was darauf hindeutet, dass der Sensor membrangebunden war.
Eine niedrige Fluoreszenz wurde beobachtet, als Osh6p auch vorhanden war, was darauf hindeutet, dass dieses Protein PS oder PI(4)P effizient aus Liposomen extrahierte. Die Ergebnisse eines PS-Transfer-Assays mit Osh6p als LTP werden gezeigt. Die durchschnittlichen kinetischen Kurven des PS-Transfers von LA-Liposomen zu LB-Liposomen, dotiert oder nicht mit Phosphatidylinositol-4-phosphat dotiert, wurden berechnet.
Die mittlere anfängliche PS-Transportrate wurde aus drei verschiedenen Experimenten bestimmt. In ähnlicher Weise werden hier Ergebnisse eines PI(4)P-Transfertests mit Osh6p als LTP gezeigt. Zusammen mit den durchschnittlichen kinetischen Kurven, die nach der Signalnormalisierung erhalten wurden.
Die mittleren Übertragungsraten wurden mit LA-Liposomen gemessen, die mit PS dotiert oder nicht dotiert waren. Verwenden Sie bei der Durchführung dieses Protokolls einen neuen Puffer und bereiten Sie die gleichen Tage vor. Minimieren Sie die Lichtexposition von floreszierenden Liposomen und Proteinen, verwenden Sie gut gereinigtes NBD-markiertes Protein und halten Sie sie auf Eis. kann durch Messung des PS- und PI(4)P-Transfers zwischen Organellen innerhalb der prokaryotischen Zelle mit genetisch kodierten fluoreszierenden Lipidsensoren bestätigt werden.
Diese Technik ebnet einen Weg zu einem besseren Verständnis von PS und PI(4) sind innerhalb der Zelle verteilt, und ihre Aktivität erfährt eine Spezifität von mehreren LTPS.
