Time-Lapse Mikroskopie Experimente wurden an der biomolekularen Screening Facility (BSF), EPFL durchgeführt. Wir danken Marc Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) für die Videografie und Bearbeitung des Films.

Hinweis: In dieser Studie wurde die E14 ES-Zell-Linie verwendet. Dieses Protokoll ist jedoch auf andere Maus-ES Zell-Linie mit dem Ausdruck ein Protein des Interesses verschmolzen zu einem SNAP-Tag, entweder durch das körpereigene Protein tagging oder mittels Überexpression unmittelbar anwendbar. Für die Beispiele in den Abschnitt "Ergebnisse" wurden Doxycyclin-induzierbaren SNAP-Tag-Fusion-Zelllinien verwendet (SNAP-Tag verschmolzen, die folgende Proteine: Nanog, Oct4, Srsf11, oder die fluoreszierende Proteine mOrange2 und SfGFP und setzen Sie unter der Kontrolle der ein Doxycyclin-induzierbaren Promoter. Die Plasmide verwendet für die Generation der Doxycyclin-induzierbaren SNAP-Tag-Fusion-Zell-Linien11 für weitere Informationen siehe). Doxycyclin-induzierbaren Systems kann besonders nützlich sein, da es erlaubt für streng zu kontrollieren, den Zeitpunkt und die Intensität des Ausdrucks des Proteins des Interesses. C-terminale Positionierung des SNAP-Tag wird empfohlen, wie das Ändern der N-terminalen Aminosäure-Sequenz ist wahrscheinlicher, die Halbwertszeit des Zielproteins (N-Seite Regel12) zu ändern.
1. E-Cadherin-Beschichtung und Zelle seeding
<ol><li>Generieren Sie eine ES-Zell-Linie mit dem Ausdruck ein Protein des Interesses verschmolzen zu SNAP-Tag4.</li>
	<li>Mantel 100 mm Zelle Kultur Gerichte mit 4 mL 0,1 % Gelatine (verdünnt in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2 +/Mg2 +) für 1 h Gelatine zu entfernen und sofort für 1 h Nutzung trocknen lassen oder die beschichteten Speisen für bis zu 2 Monate zu speichern.</li>
	<li>Wachsen Sie die Zellinie interessiert ES Zellkulturmedium (Glasgow Minimum wesentliche Mittel, mit 10 % ES Zelle qualifiziert fötalen Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 µM 2 - 2 mM Natrium Pyruvat, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt Mercaptoethanol, Leukämie hemmenden Faktor (LIF), 3 µM CHIR99021 und 0,8 µM PD184352) auf Gelatine beschichtet Gerichte bei 37 ° C und 5 % CO2 für 2 Tage bis zum Erreichen eines Zusammenfluss von 10-20 Mio Zellen pro Schale. Hinweis: Hier produzierte LIF transiente Transfektion von HEK 293T Zellen, gefolgt von überstand Sammlung und filtern. Jede Charge von LIF wurde für sein Potenzial zur Aufrechterhaltung der Pluripotenz getestet, aber Konzentrationen wurden nicht bestimmt. Jedoch rekombinante LIF ist auch im Handel erhältlich und die Konzentration häufig verwendet für Maus-ES Zellkultur 1000 Einheiten/mL13.</li>
	<li>Mantel einer 96-Well-Platte geeignet für imaging mit 30 µL des rekombinanten Maus E-Cadherin Fc Chimäre Protein (E-Cad-Fc) pro Well (5 ng/µL, verdünnt in PBS mit Ca2 +/Mg2 +. Verwenden Sie Lager Konzentration von 100 ng/µL, bei-80 ° C gelagert). Vermeiden Sie umfangreiche pipettieren, wie E-Cad-Fc sehr zerbrechlich ist. Inkubation bei 37 ° C für 1,5 h. Hinweis: Je nach dem Mikroskop könnte andere Formate verwendet werden.</li>
	<li>Aspirieren Sie E-Cad-Fc, einmal mit 100 µL PBS mit Ca2 +/Mg2 +waschen Sie und fügen Sie 100 µL vorgewärmten ES Zellkulturmedium hinzu.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen des Interesses mit 5 mL PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Aspirieren Sie und 2 mL Trypsin-EDTA 0,25 %. 4 min bei 37 ° c inkubieren 4 mL ES Zellkulturmedium hinzufügen, Aufschwemmen und spin-down bei 1000 X g für 4 min. Aspirat überstand und das Pellet in 2 mL frisch ES Zellkulturmedium aufzuwirbeln. Hinweis: PBS ohne Ca2 +/Mg2 + sollte verwendet werden für das Waschen der Zellen vor Trypsinization um Ca2 + -Ionen, die für die Zelladhäsion erforderlich sind zu entfernen. Im Gegensatz dazu für die E-Cad-Fc Verdünnung und Beschichtung (Schritt 1.4), PBS mit Ca2 +/Mg2 +verwenden, die Haftung von ES-Zellen in E-Cad-Fc beschichtete Gerichte ist seit Ca2 +-abhängigen14.</li>
	<li>Verdünnen Sie die resuspendierte Zellen 01:10 in 1 mL ES Zellkulturmedium und Auszählung, mit einer Zählkammer (Last 10 µL für eine Kammer von 0,1 mm Tiefe).</li>
	<li>Samen 30.000 Zellen/cm2 in E-Cad-Fc beschichtet Bildplatte. Füllen Sie bis zu 200 µL pro Bohrloch mit ES Zellkulturmedium. Für Doxycyclin-induzierbaren Zell-Linien, mit einer angemessenen Dosis von Doxycyclin zu induzieren (Dosis und Zeitpunkt der Induktion im Voraus zu optimieren. Die hier verwendeten Zelllinien wurden mit 500 ng/mL Doxycyclin 24 h vor Bildgebung behandelt). Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 und fahren Sie mit dem Puls Kennzeichnung und imaging-24 h nach Aussaat der Zelle.</li>
</ol>2. Puls Kennzeichnung des SNAP-tag
Hinweis: Für Protein Verfall Experimente ist es entscheidend, eine angemessene SNAP Farbstoff Konzentration zu verwenden. Die Konzentration sollte hoch genug sein, ergeben eine hellere Signal am Anfang von den Zeitraffer, wie die Fluoreszenz im Laufe der Zeit sinkt. Jedoch möglicherweise zu hoch Farbstoff Konzentrationen mit residual Farbstoff wird links im Medium oder in den Zellen auch nach dem Waschen. Der freie Farbstoff könnte anschließend an neuproduzierten SNAP-Tag-Moleküle im Laufe des Films, binden, die Verfall-Kurve verzerren. Beobachteten Fluoreszenzsignal hängt von den Eigenschaften der Farbstoff, der Zell-Linie verwendet, als auch die Expression des entsprechenden Proteins. Daher ist es entscheidend, die Farbstoff-Konzentration zu optimieren, indem Sie testen verschiedene Verdünnungen, ausgehend von der Verdünnung, die vom Hersteller für das live Cell Imaging vorgeschlagen. Für diese Studie war eine dunkelrote fluoreszierende Substrat verwendet. Eine optimale Konzentration von 12 nM für Doxycyclin-induzierbaren Überexpression Zelllinien festgelegt wurde.
<ol><li>Den SNAP-Farbstoff auf die entsprechende Konzentration in vorgewärmten ES Zellkulturmedium verdünnt. Verwenden Sie eine Pipette, um entfernen vorsichtig das Medium aus den Zellen in den 96-Well-Platte zuvor gesät, und fügen Sie 50 µL verdünnter SNAP Farbstoff pro Bohrloch. 30 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Abzusaugen Sie die verdünnte Farbe mit einer Pipette und waschen Sie 3 X mit 200 µL vorgewärmten PBS (ohne Ca2 +/Mg2 +). Fügen Sie 200 µL ES Zellkulturmedium und 15 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Wiederholen Sie den vorherigen waschen zweimal mehr. Hinweis: Umfangreiche waschen ist wichtig, um alle ungebundenen Farbstoff zu entfernen. Die wiederholte Waschschritten mit PBS entfernen den restlichen extrazellulären Farbstoff in das Medium, während 15 min Inkubationen robuste Kennzeichnung von SNAP-Tag-Fusionsproteinen sorgen vor Beginn der imaging Experiments. Allerdings führen Sie die Waschschritte durch sanfte pipettieren und verwenden Sie keine automatische Absauganlage, da Zellen ausgesät auf E-Cad-Fc tendenziell leicht lösen.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL von imaging-Medium. Zur Reduzierung der Fluoreszenz-Hintergrund, Phenol rot freie Mittel (ergänzt mit 10 % ES Zelle qualifiziert fötalen Rinderserum, 2 mM Natrium Pyruvat, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 100 µM 2-Mercaptoethanol, LIF, 3 µM CHIR99021 und 0,8 µM PD184352).</li>
</ol>3. Time-Lapse-Mikroskopie
<ol><li>Verwenden Sie geeignet für live Aufnahmen, so dass kontrollierter Temperatur und CO2Mikroskop. Stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C und die CO2 bis 5 % verwenden und lassen Sie für 1-2 h equilibrate vor.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in das Mikroskop und finden Sie Flecken geeignet für Bildgebung zu. Wählen Sie Orte, wo die Zellen sind gleichmäßig verteilt, aber nicht zu dicht, da dies die Analyse erleichtern wird. Passen Sie die Anzahl der ausgewählten Orte, die Anzahl der Zellen, die für die Analyse erforderlich. In dieser Studie wurden 3-5 Flecken pro Zelle Zeile erfasst.</li>
	<li>Wählen Sie das Ziel. Ein 20 X Objektiv eignet sich für die Größe von ES-Zellen.</li>
	<li>Wählen Sie die Beleuchtung-Einstellungen für die fluoreszierenden Kanäle aufgezeichnet werden. Passen Sie die Laserleistung und Belichtung entsprechend der Intensität der Fluoreszenzsignal aus den Zellen von Interesse. Achten Sie auf ein starkes erstes Signal zu erhalten, da wird es im Laufe des Films zu verringern, aber vermeiden Sie Laserleistungen höher als 30 % um Phototoxizität und Immunofluoreszenz zu minimieren. Für diese Studie, eine Erregung Filter von 632/22 nm (Wellenlänge/Bandpass), Emission Filter 679/34 nm (Wellenlänge/Bandpass), Laserleistung von 10 % und die Belichtung Zeit von 100 ms verwendet wurden.</li>
	<li>Wählen Sie die bildgebenden Intervalle und Dauer des Time-Lapse-Experiments. Wählen Sie für Proteine mit erwarteten Halbwertszeiten von 2-20 h Erfassungszeiten von 12-24 h mit zeitlichen Abständen von 15 Minuten. Reduzieren Sie für kurzlebigere Proteine die Intervalle und Erfassungszeiten langlebigeren Proteine Erhöhung entsprechend.</li>
	<li>Starten Sie imaging.</li>
</ol>4. Verarbeitung und Analyse von Bildern
<ol><li>Sammeln Sie die aufgenommenen Bilder als Stapel im TIFF-Format. Verwenden Sie zur Weiterverarbeitung und Analyse Fidschi Software15. Wenn die Time-Lapse Daten nicht als Stapel von der Mikroskop-Software gesammelt werden, öffnen Sie alle Frames des Time-Lapse-Experiments in der Software (entweder durch Klicken auf Datei | Öffnen... oder per Drag & Drop die entsprechenden Dateien in der Symbolleiste) und klicken Sie auf Bild | Stacks | Bilder zu stapeln.</li>
	<li>Die Funktion der subtrahieren Hintergrund Hintergrund aus allen Bildern im Stapel zu entfernen. Dazu klicken Sie auf Prozess | Hintergrund zu subtrahieren. Wählen Sie aus des rollenden Kugel Radius in das Popup-Fenster. Verwenden Sie einen Radius, der mindestens die Größe der Zellen abgebildet ist. Um die Hintergrundabzug auf alle Zellen im Stack anzuwenden, wählen Sie Ja in den Prozess-Stack? Popup-Fenster.</li>
	<li>Wählen Sie eine Zelle von Interesse und zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) um sie über die Symbolleiste. Verwenden Sie für nukleare Signale den Oval -Auswahl vom ersten Klick auf die entsprechende Registerkarte in der Symbolleiste klicken Sie auf den Kern des Interesses und Anpassung das Oval um ihn herum. Für zytoplasmatischen Signale oder sehr dichten Regionen der Freihandauswahl verwenden, um die Zelle Umrisse verfolgen können. Vermeiden Sie zu große Regionen des Hintergrunds, obwohl es nicht notwendig, die Zelle Umrisse genau durch die anschließende Subtraktion alle Hintergrundpixel (Schritt 4,8-4,9) zu folgen ist.</li>
	<li>Die Region des Interesses an den ROI-Manager hinzufügen, indem analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager | Fügen Sie, oder T auf der Tastatur drücken.</li>
	<li>Gehen Sie zum nächsten Bild durch Verschieben der Registerkarte im Fenster "Stapel" oder durch Drücken der Umschalttaste + < auf der Tastatur, dann wiederholen Sie die vorherigen Aktionen. Folgen Sie der Zelle von Interesse im Laufe des Films und fügen Sie den ROI des einzelnen Frames an den ROI-Manager hinzu. Speichern den letzten ROI set für jede überwachte Zelle durch Klicken mehr | Speichern... in der ROI-Manager. Hinweis: Nach Zellteilungen, verfolgen beide Tochterzellen getrennt und die Summe ihrer integrierten Intensitäten nach Hintergrundabzug (siehe Schritte 4,6-4,9), um Protein-Verdünnung während der Zellteilung zu berücksichtigen. Speichern Sie die ROI-Sets für beide Tochterzellen.</li>
	<li>Sobald die Zelle von Interesse im Laufe des Films verfolgt wird, klicken Sie auf messen, um Werte für die mittlere Intensität und den Bereich des ROIs zu erhalten. Die erhaltenen Werte in eine elektronische Tabellenkalkulations-Programm kopieren und die rohe integrierte Intensität der Zelle für jeden Zeitpunkt wie folgt zu berechnen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> wo die mittlerecist die mittlere Intensität undBereichCBereich der entsprechenden ROI.</li>
	<li>Um den lokalen Hintergrund abschätzen zu können, fügen Sie einen ROI in der Nähe der Zelle von Interesse für jeden Zeitrahmen. Vermeiden Sie alle zellulären Fluoreszenzsignal. Verwenden Sie einen kreisförmigen ROI, die etwa die Größe einer Zelle und verschieben Sie oder verkleinern Sie es entsprechend zu, bei Bedarf, z.B. wenn benachbarte Zellen stören. Gehen Sie wie zuvor mit den zellulären gestellten ROI gesetzt, um einen Hintergrund ROI zu erzielen und kopieren Sie die gemessenen Intensitätswerte in das Arbeitsblatt.</li>
	<li>Um einen Hintergrund-korrigierte Wert für die integrierte Intensität der Zelle zu erhalten, berechnen Sie zunächst die integrierte Intensität des Hintergrunds für jeden Zeitpunkt: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> wo MeineBG die mittlere Intensität der Hintergrundsignal und BereichC ist, ist der Bereich des ROI rings um die Zelle. Verwenden Sie die Fläche des Hintergrunds ROI, nicht, es sei denn, beide Bereiche die gleiche Größe haben.</li>
	<li>Die endgültige Hintergrund subtrahiert integrierte Intensität der Zelle für jeden Zeitpunkt zu berechnen: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>Um die einzelne Zelle Verfall Kurven zu normalisieren, teilen Sie den Intensitätswert des jeden Zeitpunkt durch den Intensitätswert der ersten Zeit-Punkt. Hinweis: Die Kurvenanpassung (siehe Schritt 4.11) kann entweder auf jeder einzelnen Zelle oder auf die durchschnittliche Bevölkerung durchgeführt werden. Eine Normalisierung ist erforderlich, wenn ein Bevölkerungsdurchschnitt berechnet wird, um Verzerrungen aus verschiedenen Fluoreszenz-Intensitäten zwischen Zellen zu vermeiden. Die Normalisierung gewährleistet, dass jede Zelle mit dem gleichen Gewicht zur endgültigen Verfall Kurve trägt. Darüber hinaus kann die Normalisierung, die einzelne Zelle zerfällt unabhängig von ihrer absoluten Fluoreszenz-Intensitäten zu visualisieren (siehe Abbildungen 3A-3 C) nützlich sein. Jedoch, wenn nur die einzelligen Halbwertszeiten ermittelt werden und die Daten nicht gemittelt, Normalisierung Schritt kann ausgelassen werden und die Kurvenanpassung kann direkt auf die raw-Daten durchgeführt werden.</li>
	<li>Verwenden Sie für die Schätzung der Protein-Halbwertszeit eine Kurve Montagewerkzeug. In dieser Studie wurde die MATLAB Kurvenanpassung Toolbox 3.4.1 verwendet, die befindet sich standardmäßig im Bereich Apps der MATLAB-Benutzeroberfläche. Importieren der Fluoreszenzintensität und Zeitwerte aus der elektronischen Tabellenkalkulation in MATLAB durch Klicken auf die Registerkarte " Daten importieren " die Kurvenanpassung Toolbox öffnen und wählen Sie die Zeitpunkte und Fluoreszenz-Verfall-Daten in der X-Daten und Y Daten tab. Wählen Sie Benutzerdefinierte Gleichung in der Kurvenanpassung Registerkarte, und geben Sie die Gleichung für eine exponentielle Zerfall: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> Wenn f(t) die Fluoreszenzintensität zu einem bestimmten Zeitpunkt ist eine der Anfangsintensität und b die Zerfallsrate. In den Optionen passen... Registerkarte, wählen Sie 0 für die untere Grenze von a und b. Die geschätzten Werte für a und b werden dann im Ergebnisfenster angezeigt. Berechnen Sie die Halbwertszeit wie folgt: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Protein+Half-Lives.">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der wichtigste Schritt bei der Verwendung eines SNAP-Tags Protein Verfall zu überwachen ist, um sicherzustellen, dass kein passives ungebundenen Farbstoff im Medium oder in den Zellen nach dem Waschen, da sonst es links neu binden könnte produziert SNAP-Tag Moleküle später im Verlauf des Experiments und ther Eby Kompromiss der Verfall-Kurve. Dies ist einerseits durch sorgfältig ausführen der beschriebenen Waschschritte erreicht. Auf der anderen Seite sollte die Farbstoff-Konzentration werden so gering wie möglich,...

Es ist bekannt, dass zelluläre Proteine umfangreiche Umsatz mit Synthese und Abbau spezifisch für jedes Protein und einer physiologischen Regulierung zu unterziehen. Traditionell wurden Protein Abbauraten mit Bulk-Methoden wie radioaktive Puls Chase Analyse, oder an denen Protein-Synthese-Hemmer wie Cycloheximide1gemessen. Vor kurzem wurde stabiler Isotope Etikettierung mit Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) in Kombination mit der Massenspektrometrie gegründet, um Protein-Umsatz auf einer globalen Skala2zu quantifizieren. Aber diese Methoden sind begrenzt, indem der Durchschnitt der Bevölkerung, und Informationen über Zell-Zell-Variabilität geht also verloren. Darüber hinaus können vorübergehende Änderungen im Proteinabbau, die in der Zellenbevölkerung unsynchronized sind identifiziert werden.
Protein-Halbwertszeiten können alternativ auch durch Fluoreszenz-basierte Ansätze, die haben oft den Vorteil, dass einzellige Auflösung ermittelt werden. Zum Beispiel wurde ein Photoactivatable grün fluoreszierendes Protein (PaGFP) zur Oct4 Halbwertszeit in den frühen Säugetieren Embryo3zu bestimmen. Eine weitere Methode zur Protein-Zerfall in lebenden Zellen zu überwachen ist die Verwendung eines SNAP-Tags in Kombination mit Zeitraffer-Fluoreszenz-Bildgebung. Der SNAP-Tag ist eine mutierte Version von der DNA-Reparatur Enzym O6- Alkylguanine DNA-Alkyltransferase (AGT), die speziell mit Benzylguanine (BG) Derivate, reagiert die molekularen Sonden4,5, gekoppelt werden können 6. daher SNAP-Tag-Fusionsprotein kann irreversibel mit einer, Zelle durchlässig Leuchtstofffärbung beschriftet werden. Puls Kennzeichnung eines Proteins des Interesses mit der SNAP-Tag, gefolgt von Auswaschung der restliche Farbstoff verschmolzen ermöglicht für die Überwachung des Abbaus der beschrifteten Protein Bevölkerung und damit für die Bestimmung von Protein-Halbwertszeit. SNAP-Tags haben erfolgreich eingesetzt für Puls-Jagd Kennzeichnung von Proteinen und für die Bestimmung von Protein Halbwertszeiten im Anhänger Zell-Kultur und in Vivo5,7,8,9. Eine Vielzahl von SNAP-Tag Substrate für gebräuchliche fluoreszierende Spektren sind im Handel erhältlich, so dass die Auswahl der optimalen Farbstoff für jede spezifische Anwendung. SNAP-Tags können somit auch für mehrfarbige Bildgebung in Kombination mit anderen fluoreszierende Fusionsproteine oder Farbstoffe verwendet werden. Zelle-undurchlässig Farbstoffe eignen sich für die Kennzeichnung von Membran-angebunden Proteine während Zelle durchlässig Farbstoffe für die Überwachung der intrazellulären und Membrane-springen Proteine anwendbar sind. Darüber hinaus einige der diese Sonden fast keine basale Fluoreszenz ausstellen und erst emittierende eine starke Fluoreszenzsignal nach Bindung an ein SNAP-Tag10.
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Abbauraten verschiedener Proteine des Interesses an einzelne Zellen mit einem SNAP-Tag zu messen. Hier wenden wir diese Methode auf embryonale Stammzellen (ES) Mauszellen kultivierten auf E-Cadherin, aber es sollte möglich sein, es mit jeden anhaftende kultivierte Zelltyp verwenden. Wir zeigen, dass Puls Kennzeichnung von Fusionsproteinen SNAP-Tag gefolgt von Time-Lapse Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht die Bestimmung der Einzelzelle Halbwertszeiten von Interesse verschiedener Proteine und eine Schätzung für die Zell-Zell-Variabilität der Halbwertszeiten in liefert eine Bevölkerung von kultivierten Zellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Equipment</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest</td>
			<td style="width:189px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:189px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate</td>
			<td style="width:189px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm</td>
			<td style="width:189px;">Marienfeld-superior</td>
			<td style="width:119px;">640030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:189px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;">MCO-170AICUV-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Centrifuge 5804 R</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td>5804000528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System</td>
			<td style="width:189px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">29027886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Name</td>
			<td style="width:189px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Reagents</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">16141-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">113-24-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Minimum Essential Medium&#160; Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:189px;">BioConcept</td>
			<td style="width:119px;">4-01F00H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Leukemia Inhibitory factor</td>
			<td style="width:189px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI)</td>
			<td style="width:189px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">361559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">PD 0325901</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">391210-10-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Gelatin from bovine skin</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dulbecco&#39;s PBS 10x concentrated</td>
			<td style="width:189px;">BioConcept</td>
			<td style="width:119px;">3-05K00-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dulbecco&#39;s PBS Without Ca++/Mg++</td>
			<td style="width:189px;">BioConcept</td>
			<td style="width:119px;">3-05F29-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Trypsin-EDTA-Solution 0.25%</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein</td>
			<td style="width:189px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">748-EC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">SNAP-Cell 647-SiR</td>
			<td style="width:189px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">S9102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">FluoroBrite DMEM</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Name</td>
			<td style="width:189px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Software</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">FIJI</td>
			<td style="width:189px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Open-source image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">MATLAB R2014a</td>
			<td style="width:189px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:189px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantification of protein degradation rates by time-lapse fluorescence microscopy in adherent cell culture

Proteine sind in einem dynamischen Zustand der Synthese und Degradation und ihre Halbwertszeiten können unter verschiedenen Umständen angepasst werden. Jedoch am häufigsten verwendeten Ansätze um zu ermitteln Protein Halbwertszeit sind entweder beschränkt auf Bevölkerung Durchschnitte aus lysierten Zellen oder erfordern den Einsatz von Protein-Synthese-Hemmer. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Messung von Protein-Halbwertszeiten in einzelne lebende adhärente Zellen mit SNAP-Tag Fusionsproteine in Kombination mit Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie. Jedes Protein des Interesses verschmolzen zu einem Kinderspiel-Tag kann kovalent an ein, Zelle durchlässig Fluoreszenzfarbstoff, der gekoppelt ist ein Benzylguanine Derivat gebunden, und der Zerfall der beschrifteten Protein Bevölkerung nach Auswaschung der restliche Farbstoff überwacht werden kann. Nachfolgende Zelle tracking und Quantifizierung der integrierten Fluoreszenzintensität über Zeit Ergebnisse in einer exponentiellen Zerfall Kurve für jede überwachte Zelle, so dass für die Bestimmung von Protein Abbauraten in Einzelzellen durch Kurvenanpassung. Diese Methode liefert eine Schätzung für die Heterogenität der Halbwertszeiten in einer Population von kultivierten Zellen, die leicht durch andere Methoden bewertet werden kann. Der hier vorgestellte Ansatz gilt für jede Art von kultivierten adhärente Zellen ein Protein des Interesses verschmolzen zu einem Kinderspiel-Tag zum Ausdruck zu bringen. Hier verwenden wir Mauszellen embryonaler Stammzellen (ES) auf E-Cadherin-beschichtete Kultur Zellplatten angebaut, wie einzelne Zelle Abbau illustrieren Preise von Proteinen mit einer breiten Palette von Halbwertszeiten ermittelt werden können.

Das beschriebene Protokoll stellt eine Schätzung der Zell-Zell-Variabilität in Half-Life für jeden gegebenen Proteins verschmolzen zu einem Kinderspiel-Tag. Die Verwendung von rekombinanten E-Cadherin-Fc für die Beschichtung von die Speicherfolie ermöglicht einzelne Zelle Auflösung in ES-Zellen, die sonst in den Kolonien wachsen. Einzelne Zellen können separat im Laufe des Films ( Abbildung 1A) verfolgt werden.
Um die Protein-Halbwertszeit für jede einzeln...

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Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Bestimmen von Protein in einzelne lebende adhärente Zellen, Halbwertszeiten mit Puls Kennzeichnung und Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung von Fusionsproteinen SNAP-Tag.

Einzellige Quantifizierung der Protein-Abbauraten von Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie in adhärente Zellkultur

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K Aufrufe.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Bestimmen von Protein in einzelne lebende adhärente Zellen, Halbwertszeiten mit Puls Kennzeichnung und Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung von Fusionsproteinen SNAP-Tag.

Serie: Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Analyse der Actomyosin-Dynamik bei lokalen Zellstoff- und Gewebeskalen mit Zeitraffer-Filmen von kultivierten Drosophila-Eierkammern

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...