Unser Protokoll hilft Wissenschaftlern, subzelluläre stomyosin-Netzwerke in einzelnen Epithelzellen zu analysieren und ermöglicht es ihnen auch, ähnliche Analysen im mehrzelligen Maßstab in gekrümmten Epithelgeweben durchzuführen. Unser Protokoll ist ein schönes Beispiel für eine Fidschi-Anwendung. Es verfügt über eine intuitive grafische Benutzeroberfläche und erfordert keine Kenntnisse der Skripterstellung.
Daher ist es auch für Anfänger im Feld sehr gut geeignet. Obwohl unsere Methode für Drosophila-Eikammern entwickelt wurde, ist sie auch außerhalb der Drosophila-Epithelie anwendbar. Wir ermutigen Wissenschaftler, unser Protokoll in ihren Modellsystemen zu testen.
Verwenden Sie die mitihm versehenen Testdateien, um sich mit diesem Protokoll vertraut zu machen. Es hilft Ihnen zu entscheiden, welcher Teil dieses Protokolls für Ihre individuelle Forschungsfrage geeignet ist. Dieser Teil des Protokolls ermöglicht es Benutzern, Epithelzellen in Zeitrafferfilmen zu segmentieren und anschließend actomyosin-Pulse in einzelnen Zellen im Laufe der Zeit mit dem Surface Manager zu analysieren.
Öffnen Sie zunächst Fidschi, und importieren Sie das Makro TissueCellSegmentMovie. ijm, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Öffnen Sie dann eine bleichkorrigierte TIFF-Datei, und teilen Sie die Kanäle der bleichkorrigierten Datei auf, indem Sie zur Menüleiste wechseln, Bild auswählen, gefolgt von Farbe, und Spalten Sie Kanäle austeilen.
Führen Sie das hochgeladene Skript auf dem aktiven Zellmembrankanal des ausgewählten Zeitrafferfilms aus, indem Sie das Symbol Ausführen im geöffneten Skript drücken. Um eine schöne Zellmaske zu erhalten, stellen Sie die Gaußsche Unschärfe auf 2.500 und die Zellerkennungsempfindlichkeit auf minus eins ein, und klicken Sie auf OK. Legen Sie dann die geschätzte Rauschtoleranz zwischen 10 und 20 für Zeitrafferfilme fest, die mit dem 63-fachen Ziel erfasst wurden, und klicken Sie auf OK. Im analysierten Zeitrafferfilm wird eine generierte Zellenmaske angezeigt, ein neues Fenster namens ParticleStack und ein kleines Fenster namens Aktion erforderlich wird ebenfalls angezeigt. Konzentrieren Sie sich in der Zellenmaske des Zeitrafferfilms nur auf Zellen in der Mitte, und wählen Sie diejenigen aus, die vollständige und klar definierte Umrisse während des Zeitrafferfilms bereitstellen können.
Wenn die ausgewählten Zellen in der Mitte gut den echten Zellmembranen entsprechen, speichern Sie ParticleStack als TIFF-Datei. Öffnen Sie die entsprechende ParticleStack TIFF-Datei in Fidschi. Mit dem Surface Manager Plugin in Fidschi installiert, öffnen Sie das Plugin.
Klicken Sie in Surface Manager auf die Schaltfläche Umrissbild lesen, und legen Sie den Jaccard-Index auf 60% Festaufnahme der Umrisse kann je nach Anzahl der Zellen einige Minuten dauern. Nach dem Laden wird jeder Zelle eine S-Nummer zugewiesen und im linken Teil des Surface-Manager-Fensters angezeigt. Klicken Sie auf die ausgewählte S-Nummer, damit die importierte Zellumriss aus ParticleStack1.
tiff erscheint im Zeitrafferfilm. Überprüfen Sie jede importierte S-Nummer auf die Zellenumrissqualität im gesamten Film, und entfernen Sie unerwünschte Zellen, die falsche Zellumrisse anzeigen. Um eine unerwünschte Zelle zu entfernen, markieren Sie die Zellumrisslinie, und klicken Sie auf die Schaltfläche Löschen.
Verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um Zellumrisse zu korrigieren. Speichern Sie nach Abschluss der korrigierten Zellen als RoiSet. ZIP-Datei.
Um zu identifizieren, ob Actomyosin-Pulse im analysierten Gewebe vorhanden sind und um das detaillierte Verhalten sowie die Richtung von Actomyosin-Signalen zu verstehen, beginnen Sie mit der Öffnung fidschi. Öffnen Sie einen Zeitrafferfilm, laden Sie den gespeicherten ParticleStack1. tiff-Zellmaske und den bleichkorrigierten Zeitrafferfilm, dann laden Sie das Surface Manager-Plugin und den entsprechenden Bereich von Interesse aus dem RoiSet.
ZIP-Datei. Aktivieren Sie in Surface Manager einen Kanal mit Interessenssignalen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik, um das Fenster mit dem Namen Durchschnitt grauer Wert Slice by Slice zu erhalten.
Die mittleren und medianen Intensitäten der Actomyosin-Signale werden im Laufe der Zeit in beliebigen Einheiten angezeigt, sowie andere Parameter, die sich auf den Bereich und die Form der Zelle beziehen. Speichern Sie die Werte als Tabellenkalkulationsdatei, indem Sie in das Statistikfenster gehen, auf Datei klicken und Speichern Sie Als .Ähnlich eine Zellenmaske generieren und in Surface Manager laden, um Actomyosinimpulse auf der Gewebeskala zu analysieren. Dieser Teil des Protokolls ermöglicht es Benutzern, selektiv eine dünne Schicht von Actomyosin im gekrümmten Epithelgewebe im Laufe der Zeit zu extrahieren.
Diese Schritte sind benutzerfreundlich und basieren auf einer intuitiven grafischen Oberfläche. Öffnen Sie Fidschi, und stellen Sie sicher, dass das Ellipsoid Surface Projection Plugin installiert ist. Öffnen Sie dann einen Zeitrafferfilm, und exportieren Sie ihn als XML/HDF5-Datei, indem Sie auf Plugins klicken, zu BigDataViewer gehen und aktuelles Bild als XML/HDF5-Datei exportieren auswählen.
Öffnen Sie anschließend die exportierte Datei in Ellipsoid Surface Projection, indem Sie zu Plugins gehen, auf BigDataViewer klicken, gefolgt von Ellipsoid-Oberflächenprojektion, und xml-Datei auswählen. Dadurch wird ein neues Fenster mit sagittalen Ansichten der Eierkammer geöffnet, und es wird ein Dialogfeld angezeigt, das den Benutzer durch die Verarbeitung führt. Das Dialogfenster, das als Ovarprojektion bezeichnet wird, hat mehrere Registerkarten.
Definieren Sie in der ersten Dialog-Registerkarte, die als Begrenzungsrahmen bezeichnet wird, die x- und y-Ränder einer Eikammer im Zeitrafferfilm zusammen mit der z-Breite des Begrenzungsrahmens, und drücken Sie den Satz. Die ausgewählten Teile der Eierkammer sind rosa hervorgehoben. Definieren Sie als Nächstes die Größe von Signalblobs in der Dialogregisterkarte, die als Find-Blobs im Fenster Ovarprojektion bezeichnet wird.
Definieren Sie das Sigma und den minimalen Spitzenwert. Drücken Sie dann die Berechnung, um die Actomyosin-Signale zu identifizieren, die als grüne Blobs angezeigt werden. Wiederholen Sie diesen Schritt mit verschiedenen Parametern, bis etwa 100 Punkte gefunden werden.
Die Identifizierung der Actomyosin-Signale ist ein entscheidender Schritt. Es hängt von der Signalqualität und der richtigen Größe der erkannten Blobs ab. Wenn keine sichtbaren grünen Flecken im Bild vorhanden sind, funktioniert der nächste Schritt nicht.
Um das Ellipsoid zu entwerfen, fahren Sie mit der Registerkarte fit ellipsoid fort. Legen Sie Zufallsstichproben auf 10 000 fest, den Außen-/Innen-Grenzabstand auf eins bis zehn, und klicken Sie dann auf Berechnen. Danach wird die Registerkarte projektion automatisch geöffnet und ermöglicht die Definition der Oberflächenextraktion.
Richten Sie auf der Projektionsregisterkarte einen minimalen und maximalen Projektionsabstand als Breite des gewünschten Ellipsoids ein. Der minimale und maximale Projektionsabstand muss passen, damit der rosa definierte Ellipsoidbereich die gesamte Außenschicht der Eikammer umfasst. Definieren Sie dann den Slice-Abstand als eins.
Stellen Sie sicher, dass der rosa Bereich des Ellipsoids mit dem auf der Eikammer definierten sichtbar ist, bevor Sie die Berechnung drücken. Es hilft, die Qualität einer neuen Ellipsoidpassung zu bewerten. Legen Sie als Nächstes eine Ausgabebreite des Ellipsoids auf größer oder gleich 800 und eine Höhe fest, die größer oder gleich 400 ist.
Legen Sie dann die Dauer der Oberflächenextraktion fest, und wählen Sie entweder eine kugelförmige oder eine zylindrische Projektion aus. Wenn erforderlich, kippen Sie Z und richten Sie Y.Press Compute aus, um eine Oberflächenextraktion für beide Kanäle in neuen Fenstern namens Image zu erhalten. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast der erhaltenen Bildfenster an, um die projizierten Actomyosin-Signale sehen zu können, indem Sie auf Bild klicken, anpassen und Helligkeit/Kontrast auswählen.
Wenn die Oberflächenextraktion gut aussieht, speichern Sie beide Kanäle separat als TIFF-Dateien. Speichern Sie außerdem die Log-Fensterdatei, um zu künftig darauf hinzuweisen, wie die Oberfläche dieser bestimmten Eikammer extrahiert wurde. Führen Sie dann die Kanäle mit einem bevorzugten Farbcode in Fidschi zusammen, und speichern Sie die Ergebnisse als TIFF-Dateien.
Dieses Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, das Verhalten von Actomyosin-Netzwerken in Epithelgeweben zu untersuchen. Dies ist nur möglich, wenn eine detaillierte Analyse des Actomyosin-Verhaltens auf der lokalen Zellskala mit einer ähnlichen Analyse auf der Gewebeskala kombiniert wird. Hier sind repräsentative Beispiele für dynamisches Myosin-II-Verhalten auf der lokalen Zellskala und auf der Gewebeskala für Diekontrolle und fett2 mutierte Drosophila-Eikammern.
Auf der Basalebene bewegt sich die grün modifizierte regulatorische Lichtkette von Myosin-II-Signalen senkrecht zur vorderen-hinteren Achse der Kontrolleierkammern. Diese Polarität geht in fett2 mutierten Eizellen verloren und führt zu anisotropen Myosin-II-Impulsen, Schwingungen Auf Gewebeebene erzeugt die grün modifizierte regulatorische Lichtkette von Myosin II in der Kontrollprobe die synchronisierte Kraft, die erforderlich ist, um die Epithelrotation zu fördern. Im Gegensatz dazu pulsiert das Follikelepithel einer fat2 mutierten Eikammer stark an der Basalseite und erzeugt nicht die synchronisierte Kraft, die erforderlich ist, um die Epithelrotation zu fördern.
In einer dünnen apikalen Region der Drosophila-Eikammer präsentiert sich der fat2-Mutant auch mit verändertem dynamischen Verhalten der grün modifizierten regulatorischen Lichtkette von Myosin II. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Idee haben, wie Sie ein Actomyosin-Netzwerk auf lokaler und Gewebeskala in Drosophila-Eikammern mit Fidschi analysieren können. Weitere praktische Tipps und Fehlerbehebung finden Sie im Diskussionsteil nach dem Protokoll. Wenn Sie Fragen zu Fidschi oder unseren Plugins haben, besuchen Sie die entsprechenden Webseiten oder kontaktieren Sie uns.
