Name: single-cell quantification of protein degradation rates by time-lapse fluorescence microscopy in adherent cell culture
Uploaded: 2018-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture at JoVE.com

מיקרוסקופ זמן לשגות הניסויים בוצעו ב למערכות ביולוגיות הקרנת מתקן (BSF), EPFL. אנו מודים מארק Delachaux (שירות Audiovisuel, EPFL) של צילום וידאו ועריכה של הסרט.

הערה: במחקר זה, הקו תא E14 ES שימש. עם זאת, פרוטוקול זה ישימה ישירות על כל העכבר ES תא קו אחר ביטוי חלבון עניין דבוקה תג SNAP, על-ידי תיוג החלבון אנדוגני או באמצעות ביטוי. על הדוגמאות המוצגת במקטע תוצאות, שימשו דוקסיציקלין-inducible SNAP-תג פיוז'ן תא קווים (SNAP-תג דבוקה החלבונים הבאות: Nanog, Oct4, Srsf11, או חלבונים פלורסנט mOrange2, sfGFP ו- put תחת השליטה של דוקסילין-inducible יזם. ראה11 למידע נוסף פלסמידים משמש את הדור של הקווים תא דוקסיציקלין-inducible SNAP-תג fusion). דוקסילין-inducible המערכת יכול להיות שימושי במיוחד, שכן היא מאפשרת לפיקוח הדוק על התזמון והעוצמה של הביטוי של החלבון עניין. C-מסוף מיצוב של הצמד-התג מומלץ, כמו שינוי של N-מסוף רצף חומצות אמיניות סביר יותר לשנות את half-life של החלבון היעד (N-end כלל12).
1. E-קדהרין ציפוי ו תא זריעה
<ol><li>ליצור קו תא ES ביטוי חלבון עניין דבוקה SNAP-תג4.</li>
	<li>מעיל 100 מ מ תא תרבות מנות עם 4 מ"ל של ג'לטין 0.1% (מדולל בפוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ללא Ca2 +/Mg2 +) עבור ה 1 הסר ג'לטין לתת להתייבש במשך ה 1 השתמש באופן מיידי או לאחסן את הכלים מצופים עד 2 חודשים.</li>
	<li>לגדל את שורת התאים עניין ב- ES תא תרבות בינוני (גלאזגו מינימום הכרחי בינוני, בתוספת 10% ES מוסמך התא העוברי שור סרום, פירובט נתרן 2 מ מ, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין, 100 מיקרומטר 2- mercaptoethanol, לוקמיה מעכבות פקטור (LIF), מיקרומטר 3 CHIR99021, מיקרומטר 0.8 PD184352) על מנות מצופים ג'לטין-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 2 ימים עד שהגיע זרימה של 10-20 תאים Mio לכל תבשיל. הערה: כאן, LIF הופק על ידי תרביות תאים ארעית של תאים 293T HEK, ואחריו supernatant איסוף וסינון. כל אצווה של LIF נבדקה הפוטנציאל לשמור על pluripotency, אך לא נקבעו ריכוזים. עם זאת, LIF רקומביננטי גם זמינים מסחרית, ריכוז משמש בדרך כלל תרבית תאים העכבר ES הוא 1000 יחידות/mL13.</li>
	<li>מעיל צלחת 96-ובכן מתאים הדמיה עם 30 µL של העכבר רקומביננטי E-קדהרין Fc כמירה חלבון (E-cad-Fc) ליום טוב (5 ng/µL, מדולל ב- PBS עם Ca2 +/Mg2 +. השתמש מניות ריכוזי 100 ng/µL, המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס). הימנע pipetting מקיף, כמו E-cad-Fc שברירית מאוד. דגירה ב 37 ° C עבור 1.5 h. הערה: בהתאם המיקרוסקופ, פורמטים אחרים עשויים לשמש.</li>
	<li>האחות של E-cad-Fc, לשטוף פעם עם µL 100 ל- PBS עם Ca2 +/Mg2 +ולהוסיף 100 µL מראש ומחוממת ES תא תרבות בינוני.</li>
	<li>לשטוף את התאים עניין עם 5 מ של PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. האחות ולהוסיף 2 מ של טריפסין-EDTA 0.25%. תקופת דגירה של 4 דקות ב 37 º C. להוסיף 4 מיליליטר ES תא תרבות בינוני, resuspend ספין למטה ב- 1000 g x עבור 4 דק לשאוב תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 2 מיליליטר טריים ES תא תרבות בינוני. הערה: PBS ללא Ca2 +/Mg2 + אמור לשמש לניקוי התאים לפני trypsinization על מנת להסיר Ca2 + יונים, אשר נדרשים עבור תא אדהזיה. לעומת זאת, ה-cad-Fc דילול ציפוי (שלב 1.4), ולהשתמש PBS עם Ca2 +/Mg2 +, מאז הידבקות תאים ES E-cad-Fc מנות מצופה היא Ca2 +-תלויים14.</li>
	<li>לדלל את התאים resuspended 1:10 ב 1 מ"ל של ES תא תרבות בינונית, ספירה, באמצעות חדר הספירה (עומס 10 µL עבור תא של 0.1 מ מ עומק).</li>
	<li>זרע תאים 30,000/cm2 ב- E-cad-Fc מצופה צלחת הדמיה. למלא עד 200 µL לכל טוב עם ES תא תרבות בינוני. עבור שורות תאים דוקסיציקלין-inducible, זירוז עם המינון המתאים של דוקסיציקלין (מיטוב מינון ותזמון של מראש את תנאי הגיוס. הקווים התא המשמש כאן טופלו ng/mL 500 דוקסיציקלין 24 שעות לפני הדמיה). דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 והמשך עם דופק תיוג והדמיה 24 שעות לאחר תא זריעה.</li>
</ol>2. דופק תיוג של הצמד-תג
הערה: לניסויים דעיכה חלבון חשוב להשתמש ריכוז לצבוע נאותה של הצמד. הריכוז צריך להיות גבוה מספיק להניב אות בהיר בתחילת מואץ, כמו ידי קרינה פלואורסצנטית יתמעטו עם הזמן. עם זאת, שימוש ריכוזי צבעים גבוה מדי עלול לגרום לצבוע שיורית להישאר בטווח הבינוני או בתאים גם לאחר כביסה. לצבוע חינם אולי לאחר מכן לאגד החדש מיוצר מולקולות SNAP-תג במהלך הסרט, יעוות את עקומת דעיכה. האות פלורסצנטיות שנצפה תלויות מאפייני לצבוע, את שורת התאים בשימוש, כמו גם את רמת הביטוי של החלבון המתאים. לכן, זה הכרחי למטב את הריכוז צבע על-ידי בדיקת דילולים שונים, החל מדילול הציע עבור הדמיה תא בשידור חי על ידי היצרן. במחקר זה, שימשה מצע פלורסנט מרחיקת אדום. ריכוז האופטימלית 12 ננומטר נקבע עבור שורות תאים דוקסיציקלין-inducible ביטוי.
<ol><li>לדלל לצבוע SNAP כדי הריכוז המתאים במדיום התרבות תאים ES ומחוממת מראש. השתמש פיפטה להסיר בעדינות את המדיום התאים בעבר נזרע בצלחת 96-ובכן ולהוסיף 50 µL של צבע מדולל SNAP לכל טוב. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>וארוקן את צבע מדולל עם פיפטה ולשטוף 3 x עם µL 200 ל- PBS ומחוממת מראש (ללא Ca2 +/Mg2 +). להוסיף 200 µL ES תא תרבות בינוני ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>חזור על השלבים הקודמים כביסה עוד פעמיים. הערה: כביסה רב חשוב כדי להסיר את כל צבע לא מאוגד. השלבים כביסה חוזרות עם PBS להסיר את שאריות הצבע חוץ-תאית במדיום, ואילו incubations 15 דקות להבטיח תיוג חזקים של החלבונים פיוז'ן SNAP-תג לפני הפעלת הניסוי הדמיה. עם זאת, בצע את השלבים כביסה מאת pipetting עדין, אל תשתמש של העצמות אוטומטיים, כמו תאים נזרע על E-cad-Fc נוטים לנתק בקלות.</li>
	<li>להוסיף 200 µL הדמיה בינוני. כדי להפחית את הרקע פלורסצנטיות, השתמש פנול אדום בינוני חינם (בתוספת 10% ES מוסמך התא העוברי שור סרום פירובט נתרן 2 מ מ, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין, 100 מיקרומטר מרקפטואתנול, LIF, 3 מיקרומטר CHIR99021 ו- 0.8 מיקרומטר PD184352).</li>
</ol>3. זמן לשגות מיקרוסקופ
<ol><li>השתמש מיקרוסקופ מתאים הדמיה בשידור חי, ומאפשר טמפרטורה מבוקרת ו- CO2. הגדר את הטמפרטורה 37 ° C ו CO2 כדי 5% מראש להשתמש ולאפשר כדי equilibrate עבור h 1-2.</li>
	<li>למקם את הצלחת לתוך המיקרוסקופ, למצוא מקומות מתאימים עבור הדמיה. בחר כתמים התאים איפה המפוזרים באופן שווה, אבל לא יותר מדי צפוף, כמו זה יקל את הניתוח. להתאים את מספר הנקודות שנבחרו על מספר התאים הנדרש לניתוח. במחקר זה, נרשמו 3-5 נקודות לכל שורת התאים.</li>
	<li>בחר את המטרה. מטרה X 20 מתאים לגודל של תאים ES.</li>
	<li>בחר את הגדרות תאורה עבור פרופיל פלורסנט שיירשמו. להתאים את עוצמת הלייזר ואת חשיפה על פי עוצמת האות פלורסצנטיות מתאי עניין. הקפד להשיג קליטה ראשונית חזקה, מאז זה להקטין במהלך הסרט, אבל להימנע לייזר כוחות גבוה מ 30% על מנת למזער את phototoxicity ואת photobleaching. במחקר זה, מסנן עירור של 632/22 ננומטר (גל/bandpass), מסנן פליטה של 679/34 nm (גל/bandpass), עוצמת הלייזר של 10% וזמן חשיפה של 100 ms שימשו.</li>
	<li>בחר את מרווחי והמשך הדמיה של הניסוי זמן לשגות. החלבונים עם מחצית החיים הצפוי של h 2-20, בחר רכישת פעמים של 12-24 h עם מרווחי זמן של 15 דקות. חלבונים shorter-lived, להפחית את מרווחי ואת רכישת פעמים, להגדלת חלבונים longer-lived בהתאם.</li>
	<li>להתחיל הדמיה.</li>
</ol>4. התמונה עיבוד וניתוח
<ol><li>לאסוף את התמונות הנרכש ככל בערימה בתבנית tiff. ניתוח ועיבוד נוסף, לשימוש של תוכנות פיג'י15. אם זמן לשגות לא איסוף הנתונים כמו ערימה על ידי תוכנת מיקרוסקופ, פתח כל המסגרות של הניסוי זמן לשגות בתוכנה (או על ידי לחיצה על קובץ | לפתוח... או גרירה של יורד הקבצים המתאים לסרגל הכלים) ולחצו על התמונה | ערימות | תמונות לערום.</li>
	<li>השתמש בפונקציה רקע הפחת כדי להסיר את הרקע של כל התמונות במחסנית. לשם כך, לחץ על תהליך | להחסיר את הרקע. בחר את רדיוס הכדור מתגלגל בחלון המוקפץ. השתמש רדיוס זה לפחות בגודל של התאים עם תמונה. כדי להחיל רקע חיסור על כל התאים במחסנית, בחר כן ב תהליך מחסנית? חלון מוקפץ.</li>
	<li>בחר תא עניין וצייר אזור עניין (ROI) סביב זה באמצעות סרגל הכלים. עבור אותות גרעינית, השתמש הבחירה אליפסה מאת הראשון לחיצה על הלשונית המתאימה בסרגל הכלים ואז לחיצה על הגרעין של עניין, התאמת את האליפסה סביבו. עבור אותות cytoplasmic או אזורים צפופים מאוד להשתמש הבחירה ביד חופשית כדי להיות מסוגל לעקוב מקרוב את קווי המתאר של התא. הימנע כולל אזורים גדולים מדי של רקע, למרות שזה לא הכרחי לעקוב אחר קווי המתאר תא בדיוק בגלל חיסור עוקבות של רקע כל הפיקסלים (שלב 4.8 4.9).</li>
	<li>להוסיף את האזור של ריבית למנהל רועי בלחיצה נתח | כלים | רועי מנהל | להוסיף, או על-ידי הקשה על T על המקלדת.</li>
	<li>המשך למסגרת הבאה על-ידי הזזת הכרטיסיה בחלון מחסנית או על-ידי הקשה על shift + < במקלדת, ואז לחזור על הפעולות הקודמות. בצע את התא של עניין לאורך כל הקורס של הסרט ולהוסיף ההחזר של כל מסגרת מנהל רועי. להציל את רועי הסופי להגדיר עבור כל תא מסומנים על-ידי לחיצה על יותר | שמור. במנהל ROI. הערה: לאחר חלוקות תאים, לעקוב אחר שני תאי הבת בנפרד, לסכם את עוצמות משולב שלהם לאחר רקע חיסור (ראה שלבים 4.6-4.9) לקחת בחשבון חלבון דילול במהלך חלוקת התא. שמור את ערכות ROI עבור שני תאי הבת.</li>
	<li>לאחר התא עניין מתבצע לאורך כל הסרט, לחץ על מידה, כדי לקבל ערכים של ROIs עוצמת רשע ואזור. להעתיק את הערכים שהושג לתוכנית גליון נתונים אלקטרוניים, לחשב את עוצמת משולב raw של התא עבור כל הזמן-נקודה כדלקמן: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> איפה מתכווןcזה את העוצמה רשע,שטחCהאזור של רועי המתאימים.</li>
	<li>כדי להעריך את הרקע מקומיים, להוסיף רועי ליד התא עניין לכל מסגרת זמן. הימנע כולל קליטה סלולרית קרינה פלואורסצנטית. השתמש רועי מעגלי זה בערך בגודל של תא, להזיז או לכווץ את זה בהתאם. במידת הצורך, למשל אם התאים הסמוכים להתערב. המשך כמתואר קודם לכן עם הטלפון הסלולרי רועי להגדיר כדי לקבל רקע רועי להגדיר ולהעתיק את ערכי העוצמה נמדד הגיליון.</li>
	<li>כדי לקבל ערך מתוקן-רקע על עוצמת משולב של התא, תחילה לחשב את עוצמת משולב של הרקע עבור כל נקודת-זמן: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> מתכווןBG איפה העוצמה אכזרי של רקע אות ו שטחC הוא האזור של רועי המקיפות את התא. אל תשתמש/י את האזור של רקע רועי, אלא אם כן בשני התחומים יש באותו הגודל.</li>
	<li>חישוב סופי המופחת-רקע משולב האינטנסיביות של התא עבור כל נקודת זמן: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>לנרמל את עקומות דעיכה של תא בודד, לחלק את הערך בעוצמה של כל הזמן-נקודה לפי הערך בעוצמה של נקודת-בפעם הראשונה. הערה: ההתאמה עקומה (ראה שלב 4.11) ניתן גם לבצע על כל תא בודד או על ממוצע האוכלוסייה. נורמליזציה נדרש אם מחושב ממוצע של אוכלוסייה בהתבסס על מנת למנוע הטיות של עוצמות קרינה פלואורסצנטית שונה בין תאים. נירמול ובכך מבטיחה כי כל תא תורם עם אותו משקל, עיקול דעיכה הסופי. בנוסף, נירמול יכול להיות שימושי להמחיש את נרקב תא בודד ללא תלות עוצמות קרינה פלואורסצנטית המוחלט שלהם (ראה דמויות 3A-3 C). אולם, אם רק מתא בודד מחצית החיים נקבעים, הנתונים לא הממוצע היה הצעד נרמול עשוי להיות מושמט, ההתאמה עקומה יכולה להתבצע ישירות על הנתונים הגולמיים.</li>
	<li>על ההערכה של מחצית חיים חלבון, להשתמש בכלי המדידה עקומה. במחקר זה, העקומה MATLAB התאמת הכלים 3.4.1 שימש, אשר ממוקם כברירת מחדל במקטע יישומים של ממשק המשתמש של MATLAB. לייבא את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, ערכי הזמן מהגיליון האלקטרוני לתוך MATLAB על ידי לחיצה על הכרטיסיה ייבוא נתונים פתח את עקומת התאמה בארגז הכלים ובחר את נקודות זמן והנתונים דעיכה פלורסצנטיות נתונים X ו Y הנתונים טאב בחר מותאמת אישית המשוואה פריסטלטיות טאב, הזן את המשוואה עבור דעיכה מעריכית: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> היכן f(t) עוצמת קרינה פלואורסצנטית בכל נקודת זמן נתונה, העוצמה הראשונית ו b קצב הדעיכה. בתיבת הדו-שיח אפשרויות להתאים. בכרטיסיה, בחר 0 עבור הגבול התחתון של גם וגם b . בין הערכים המשוערים עבור ו- b יופיע בחלון תוצאות. לחשב את זמן מחצית החיים כדלקמן: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Protein+Half-Lives.">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct4+kinetics+predict+cell+lineage+patterning+in+the+early+mammalian+embryo.">Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo.</a> Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).</li><li>Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).</li><li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells.">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li><li>Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+O6-alkylguanine-DNA+alkyltransferase+for+applications+in+protein+labeling.">Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling.</a> Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).</li><li>Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).</li><li>Bojkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vivo+Protein+Half-Life.">Measuring In Vivo Protein Half-Life.</a> Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).</li><li>Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+quantitative+measurements+of+gene+expression+in+single+living+cells.">A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells.</a> Methods. 120, 65-75 (2017).</li><li>Komatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Measurements+of+Protein+Dynamics+Using+Fluorescence+Activation-Coupled+Protein+Labeling+Method.">Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method.</a> J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).</li><li>Deluz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+mitotic+bookmarking+of+SOX2+in+pluripotency+and+differentiation.">A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation.</a> Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).</li><li>Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+pathway+and+regulation+by+proteolysis.">The N-end rule pathway and regulation by proteolysis.</a> Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).</li><li>Tamm, C., Pijuan Galit&#243;, S., Anner&#233;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Protocols+for+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+Culturing.">A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).</li><li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-Cadherin-Coated+Plates+Maintain+Pluripotent+ES+Cells+without+Colony+Formation.">E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation.</a> PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hilsenbeck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+single-cell+tracking+and+quantification+of+cellular+and+molecular+properties.">Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties.</a> Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).</li><li>Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAST:+An+automated+segmentation+and+tracking+tool+for+the+analysis+of+transcriptional+kinetics+from+single-cell+time-lapse+recordings.">CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings.</a> Methods. 85, 3-11 (2015).</li><li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images.">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Comm. 8, (2017).</li><li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIDRE:+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy.">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li><li>Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminoimidazole-4-carboxyamide+Ribonucleoside+Induces+G1/S+Arrest+and+Nanog+Downregulation+via+p53+and+Enhances+Erythroid+Differentiation.">5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation.</a> Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Regulation+of+Akt+and+Oct4+Promotes+the+Self-Renewal+and+Survival+of+Embryonal+Carcinoma+Cells.">Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells.</a> Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).</li><li>Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+Oct4+Enhances+Its+Stability,+DNA+Binding,+and+Transactivation.">Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation.</a> J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).</li><li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Engineered+Protein+Tag+for+Multiprotein+Labeling+in+Living+Cells.">An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells.</a> Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis.">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השלב המכריע ביותר כאשר היא בעזרת תג SNAP לפקח חלבון דעיכה כדי להבטיח כי אין צבע לא מאוגד שיורית שנשאר במדיום או בתאים אחרי כביסה, אחרת זה עלול להיקשר החדש מיוצר מולקולות SNAP-תג מאוחר יותר במהלך ניסוי של שם פשרה eby העקומה דעיכה. זה מצד אחד, מושגת על ידי ביצוע בקפידה את כל השלבים המתוארים כביסה. מצ...

זה ידוע כי החלבונים עוברים תחלופת נרחב, עם המחירים סינתזה והשפלה להיות ספציפיים עבור כל חלבון ובכפוף תקנה פיזיולוגיים. באופן מסורתי, חלבון השפלה המחירים כבר נמדד בשיטות בתפזורת, כגון ניתוח צ'ייס הדופק רדיואקטיביים, או מעורבים מעכבי סינתזה חלבונים כגון cycloheximide1. לאחרונה, איזוטופ יציב תיוג עם חומצות אמינו בתרבות תא (SILAC) בשילוב עם ספקטרומטר מסה הוקם לכמת חלבון מחזור על מידה עולמי2. עם זאת, שיטות אלה מוגבלים על ידי ממוצע של אוכלוסייה, מידע על השתנות לתא ולכן הוא אבוד. יתר על כן, אין אפשרות לזהות שינויים חולף ב השפלה חלבון זה הם מסונכרן על פני האוכלוסייה תא.
לחלופין, חלבון מחצית החיים יכול להיקבע גם על-ידי קרינה פלואורסצנטית גישות, אשר לעיתים קרובות יש את היתרון של מתן רזולוציה תא בודד. למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק photoactivatable (paGFP) שימש כדי לקבוע Oct4 half-life של יונקים העובר מוקדם3. שיטה נוספת לעקוב אחר דעיכה חלבונים בתאים חיים היא השימוש תג הצמד בשילוב עם פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ. SNAP-התג הוא גרסה מוטציה של ה-DNA תיקון אנזים O6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (של AGT) זה במיוחד מגיב עם benzylguanine (BG) נגזרים, אשר יכול להיות מצמידים הגששים מולקולרית4,5, 6. לכן, כל חלבון כימרי SNAP-תג יכול להיות בלתי הפיך עם תוויות צבע חדיר פלורסנט, תא. הדופק תיוג של חלבון עניין התמזגו SNAP-תג, ולאחריה שטיפה של לצבוע שיורית, מאפשר לניטור ההשפלה של האוכלוסייה שכותרתו חלבון ובכך לקביעת חלבון half-life. SNAP-tags שימשו בהצלחה במשך. צ'ייס הדופק תיוג של חלבונים, לקביעת חלבון מחצית החיים ב מחסידי תא תרבות, אין ויוו5,7,8,9. ספקטרה פלורסנט מגוון גדול של מצעים SNAP-תג כיסוי נפוץ זמינים מסחרית, המאפשרת הבחירה של לצבוע האופטימלי עבור כל יישום ספציפי. לפיכך, SNAP-tags יכול לשמש גם עבור הדמיה ססגוניות בשילוב עם חלבונים פיוז'ן פלורסנט או צבעים אחרים. תא אטום צבעי מתאימים עבור תיוג קשורה קרום חלבונים, ואילו צבעי תא חדיר הינם ישימים עבור ניטור חלבונים תאיים והן קרום מאוגד. יתר על כן, חלק רגשים אלו שהפגינו כמעט אין קרינה פלואורסצנטית הבזליים, רק להתחיל לשדר אות ניאון חזק על קשירה SNAP-תג10.
פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד את שיעורי השפלה של חלבונים שונים עניין בתאים בודדים באמצעות תג SNAP. כאן אנו מיישמים שיטה זו לתאי גזע עובריים (ES) העכבר בתרבית על E-קדהרין, אבל זה צריך להיות ניתן להשתמש בה עם כל סוג תאים בתרבית חסיד. אנחנו מראים כי הדופק תיוג של חלבונים פיוז'ן SNAP-תג ואחריו קרינה פלואורסצנטית הדמיה בצילום מואץ מאפשר לקביעת תא בודד מחצית החיים של חלבונים שונים של עניין, ומספק הערכה ההשתנות לתא של מחצית החיים ב אוכלוסיית תאים בתרבית.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate</td><td>Corning</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804000528</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified</td><td>ThermoFisher</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium&amp;nbsp; Non-Essential Amino Acids</td><td>ThermoFisher</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00H</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory factor</td><td>-</td><td>-</td><td>Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI)</td><td>Merck Millipore</td><td>361559</td><td></td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>391210-10-9</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from bovine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS 10x concentrated</td><td>BioConcept</td><td>3-05K00-I</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS Without Ca++/Mg++</td><td>BioConcept</td><td>3-05F29-I</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Solution 0.25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>748-EC-050</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>SNAP-Cell 647-SiR</td><td>New England BioLabs</td><td>S9102S</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>-</td><td>-</td><td>Open-source image analysis software</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell quantification of protein degradation rates by time-lapse fluorescence microscopy in adherent cell culture

חלבונים הם במצב דינמי של סינתזה, השפלה, החצי חייהם יכול להיות מותאם תחת נסיבות שונות. עם זאת, הנפוץ ביותר גישות לקביעת חלבון מחצית חיים האם מישהו מוגבל ממוצעים באוכלוסייה מתאי lysed או מחייבות שימוש מעכבי סינתזת חלבון. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדוד חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות SNAP-תג פיוז'ן חלבונים בשילוב עם מיקרוסקופ זמן לשגות זריחה. כל חלבון עניין דבוקה תג SNAP יכולות להיות covalently קשורות על ידי תא פלורסנט, חדיר לצבוע את זה משולב נגזרת benzylguanine, ניתן לנטר את הדעיכה של האוכלוסייה חלבון שכותרתו לאחר שטיפה של לצבוע שיורית. תא עוקבות מעקב, כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית משולב מעל הזמן יוצרת מעגל דעיכה מעריכית עבור כל תא מסומנים, מתן אפשרות לקביעת חלבון השפלה בבתי תאים בודדים על ידי עקומת התאמה. שיטה זו מספקת הערכה הטרוגניות של מחצית החיים בקרב אוכלוסיה של תאים בתרבית, אשר לא יכול בקלות להיות מוערך על ידי שיטות אחרות. הגישה המוצגת כאן היא ישימה לכל סוג של בתרבית תאים חסיד ביטוי חלבון עניין דבוקה תג SNAP. כאן אנו משתמשים בתאי גזע עובריים (ES) העכבר גדל על צלחות תרבות תא E קדהרין-מצופים להמחשת השפלה תא יחיד איך המחירים של חלבונים עם מגוון רחב של מחצית החיים יכול להיקבע.

הפרוטוקול המתואר מספקת הערכה של מידת ההשתנות לתא בתוך מחצית חיים עבור כל חלבון נתון דבוקה תג SNAP. השימוש רקומביננטי E-קדהרין-Fc לציפוי של צלחת הדמיה מאפשרת לתא בודד רזולוציה ES תאים, אשר אחרת צומחים במושבות. תאים בודדים ניתן לעקוב בנפרד לאורך כל הקורס של הסרט ( איור 1 א').
<p class="...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture at JoVE.com

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות הדופק תיוג פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ של חלבונים פיוז'ן SNAP-תג.

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K Views.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות הדופק תיוג פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ של חלבונים פיוז'ן SNAP-תג.

Video: Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases. Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest that typically occurs in response to exposure to sub-lethal stresses. However, like other non-dividing cells, senescent cells remain metabolically active and carry out many functions that require unique transcriptional and translational demands and widespread changes in the intracellular and secreted proteomes. Understanding how protein synthesis and decay rates change during senescence can illuminate the underlying mechanisms of cellular senescence and find potential therapeutic avenues for diseases exacerbated by senescent cells. This paper describes a method for proteome-scale evaluation of protein half-lives in non-dividing cells using pulsed stable isotope labeling by amino acids in cell culture (pSILAC) in combination with mass spectrometry. pSILAC involves metabolic labeling of cells with stable heavy isotope-containing versions of amino acids. Coupled with modern mass spectrometry approaches, pSILAC enables the measurement of protein turnover of hundreds or thousands of proteins in complex mixtures. After metabolic labeling, the turnover dynamics of proteins can be determined based on the relative enrichment of heavy isotopes in peptides detected by mass spectrometry. In this protocol, a workflow is described for the generation of senescent fibroblast cultures and similarly arrested quiescent fibroblasts, as well as a simplified, single-time point pSILAC labeling time-course that maximizes coverage of anticipated protein turnover rates. Further, a pipeline is presented for the analysis of pSILAC mass spectrometry data and user-friendly calculation of protein degradation rates using spreadsheets. The application of this protocol can be extended beyond senescent cells to any non-dividing cultured cells such as neurons.

This protocol describes the workflow for metabolic labeling of senescent and non-dividing cells with pulsed SILAC, untargeted mass spectrometry analysis, and a streamlined calculation of protein half-lives.

מדידת שיעורי תחלופת חלבונים בתאי תרבית סנסנטיים ולא מתחלקים באמצעות תיוג מטבולי וספקטרומטריית מסה

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Biochemistry

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Immunology and Infection

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Biology

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high throughput. In general, the acquisition of single-cell time courses from cultured cells is hampered by cell motility and diversity of cell shapes. Adhesive micro-arrays standardize single-cell conditions and facilitate image analysis. LISCA combines single-cell microarrays with scanning time-lapse microscopy and automated image processing. Here, we describe the experimental steps of taking single-cell fluorescence time courses in a LISCA format. We transfect cells adherent to a micropatterned array using mRNA encoding for enhanced green fluorescent protein (eGFP) and monitor the eGFP expression kinetics of hundreds of cells in parallel via scanning time-lapse microscopy. The image data stacks are automatically processed by newly developed software that integrates fluorescence intensity over selected cell contours to generate single-cell fluorescence time courses. We demonstrate that eGFP expression time courses after mRNA transfection are well described by a simple kinetic translation model that reveals expression and degradation rates of mRNA. Further applications of LISCA for event time correlations of multiple markers in the context of signaling apoptosis are discussed.

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays LISCA - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

We present a method for the acquisition of fluorescence reporter time courses from single cells using micropatterned arrays. The protocol describes the preparation of single-cell arrays, the setup and operation of live-cell scanning time-lapse microscopy and an open-source image analysis tool for automated preselection, visual control and tracking of cell-integrated fluorescence time courses per adhesion site.

הדמיית תא חי של מערכים חד-תאיים (LISCA) - טכניקה רב-תכליתית לכימות קינטיקה תאית

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high ...