Hızlandırılmış mikroskobu deneyler biyomoleküler eleme tesisi (BSF adlı), EPFL gerçekleştirilmiştir. Marc Delachaux (hizmet Audiovisuel, EPFL) videografisi ve film düzenleme için teşekkür ederiz.

Not: Bu çalışmada, E14 ES hücre kültürünü kullanıldı. Ancak, bu iletişim kuralını doğrudan diğer fare ES hücre kültürünü bir protein endojen protein etiketleme veya overexpression kullanarak bir ek etiketi için erimiş ilgi ifade etmek için geçerlidir. Sonuçlar bölümünde gösterilen örnekler için Doksisiklin indüklenebilir ek-etiket füzyon hücre satırları kullanılmıştır (ek-etiket için aşağıdaki proteinler erimiş: MicroRNAs, Oct4, Srsf11, veya floresan proteinler mOrange2 ve sfGFP ve kontrolü altında koymak için bir Doksisiklin indüklenebilir organizatörü. Daha fazla bilgi için11 Doksisiklin indüklenebilir ek-etiket füzyon hücre satırları oluşturulmasında kullanılan plazmid bakınız). Sıkı zamanlama ve protein ilgi ifade yoğunluğunu kontrol için izin verdiği Doksisiklin indüklenebilir sistemi özellikle yararlı olabilir. C-terminal ek-etiket-in konumlandırma tavsiye edilir, N-terminal değiştirme olarak amino asit dizisi half-life hedef protein (N-son kural12) değiştirmek daha yüksektir.
1. E-cadherin kaplama ve hücre tohumlama
<ol><li>Bir protein için ek-tag4erimiş ilgi ifade bir ES hücre satırı oluşturmak.</li>
	<li>Kat 100 mm hücre kültür yemekleri (fosfat tamponlu tuz (PBS) olmadan Ca2 +/Mg2 +içinde seyreltilmiş) % 0,1 jelatin 1 h. için 4 mL ile jelatin kaldırmak ve hemen 1 h. kullanım kurumaya bırakın veya kaplamalı yemekleri 2 aya kadar saklayabilirsiniz.</li>
	<li>Hücre kültürünü ES hücre kültür orta (Glasgow en az temel takıma % 10 ES hücre nitelikli fetal sığır serum, 2 mM sodyum pyruvate, %1 non-gerekli amino asitler, % 1 penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2 - Orta, ilgi büyümek mercaptoethanol, lösemi inhibitör faktörü (LIF), 3 µM CHIR99021 ve 0.8 µM PD184352) jelatin kaplı yemekleri yemek başına 10-20 Mio hücre bir izdiham ulaşan kadar 2 gün 37 ° C ve % 5 CO2 . Not: Burada, LIF süpernatant toplama tarafından takip ve filtreleme HEK 293T hücreleri, geçici transfection tarafından üretildi. LIF her toplu iş iş potansiyelini pluripotency korumak test edildi, ama konsantrasyonlarının tespit. Ancak, rekombinant LIF da piyasada bulunan ve sık kullanılan fare ES hücre kültürü için konsantrasyon 1000 adet/mL13.</li>
	<li>96-şey plaka başına iyi (5 ng/PBS içinde Ca2 +/Mg2 +ile seyreltilmiş µL,. E-cadherin Fc chimera protein (E-cad-Fc) rekombinant fare 30 µL ile görüntüleme için uygun ceket Hisse senedi-80 ° C'de depolanan 100 ng/µL konsantrasyonları kullanın.) E-cad-Fc çok kırılgan olduğu gibi geniş pipetting, kaçının. 1,5 saat için 37 ° C'de kuluçkaya. Not: mikroskop bağlı olarak, diğer formatlar kullanılabilir olur.</li>
	<li>E-cad-Fc Aspire edin, bir kez PBS 100 µL Ca2 +/Mg2 +ile yıkayın ve Önceden ısıtılmış ES hücre kültür ortamının 100 µL ekleyin.</li>
	<li>PBS 5 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +faiz hücrelerle yıkayın. Aspire edin ve tripsin-EDTA 2 mL % 0.25 ekleyin. 4 dk. 37 ° C'de için kuluçkaya ES hücre kültür orta 4 mL ekleyin, resuspend ve 1000 x g 4 dk. aspiratı süpernatant de aşağı spin ve Pelet 2 mL taze ES hücre kültür orta resuspend. Not: PBS olmadan Ca2 +/Mg2 + trypsinization önce hücreleri yıkama için hücre adezyon için gerekli olan Ca2 + iyonları, kaldırmak için kullanılır. Buna ek olarak, E-cad-Fc seyreltme ve kaplama (1.4. adım) kullanmak için PBS Ca2 +/Mg2 +ile E-cad-Fc hücrelere ES yapışma beri kaplamalı yemekleri olduğunu Ca2 +-bağımlı14.</li>
	<li>Resuspended hücreleri 1:10 ES hücre kültür orta ve sayım odası (0,1 mm derinlik TMMOB için yük 10 µL) kullanan sayısı, 1 ml seyreltik.</li>
	<li>Tohum 30.000 hücre/cm2 ' E-cad-Fc görüntüleme plaka kaplı. İyi ücret 200 µL ES hücre kültür orta ile doldurun. Doksisiklin indüklenebilir hücre hatlarında Doksisiklin uygun bir doz ile teşvik (doz ve zamanlama indüksiyon önceden optimize edin. Burada kullanılan hücre hatları ile 500 ng/mL Doksisiklin görüntüleme önce 24 saat tedavi edildi). 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçkaya ve etiketleme ve hücre tohum sonra 24 h Imaging darbe ile devam edin.</li>
</ol>2. nabız ek-etiket etiketleme
Not: protein çürüme deneyler için bu yeterli bir ek boya toplama kullanmak çok önemlidir. Konsantrasyonu hızlandırılmış, başında parlak bir sinyal vermeye yüksek olmalıdır Floresans zamanla azalacak gibi. Ancak, çok yüksek boya konsantrasyonları kullanarak kalan boya orta veya hücreleri yıkamadan sonra bile bırakılmak neden olabilir. Ücretsiz boya daha sonra çürüme eğri tahrif edecek film boyunca yeni üretilen ek-etiket moleküllerine bağlamak. Gözlenen Floresans sinyal boya, kullanılan hücre hattı gibi ifade düzeyi karşılık gelen protein özellikleri üzerinde bağlıdır. Bu nedenle, farklı dilutions, canlı hücre görüntüleme için üretici tarafından önerilen seyreltme itibaren test ederek boya toplama en iyi duruma getirmek çok önemlidir. Bu çalışma için bir far-red floresan substrat kullanıldı. En iyi bir konsantrasyon 12 nM Doksisiklin indüklenebilir overexpression hücre hatlarında kararlıydım.
<ol><li>Önceden ısıtılmış ES hücre kültürü ortamında uygun toplama için ek boya sulandırmak. Hafifçe daha önce 96-şey plaka numaralı seribaşı hücrelerden orta kaldırmak için bir pipet kullanın ve seyreltilmiş ek boya iyi başına 50 µL ekleyin. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Bir pipet ile seyreltilmiş boya Aspire edin ve 3 x 200 µL (olmadan Ca2 +/Mg2 +) Önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. ES hücre kültür ortamının 200 µL ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
	<li>Önceki çamaşır adımları iki kez daha tekrarlayın. Not: Geniş çamaşır ilişkisiz herhangi bir boya kaldırmak için önemlidir. 15 dk incubations görüntüleme deney başlamadan önce ek-etiket füzyon proteinlerin sağlam etiketleme sağlamak ise PBS tekrarlanan çamaşır adımlarla ortamda, kalan ekstraselüler boya kaldırın. Ancak, nazik pipetting tarafından çamaşır adımlarını gerçekleştirin ve E-cad-Fc seribaşı hücreleri kolayca ayırmak eğilimi olarak bir otomatik aspiratör kullanmayın.</li>
	<li>Orta görüntüleme 200 µL ekleyin. Floresan arka plan azaltmak, fenol red ücretsiz orta kullanın (takıma % 10 ES hücre nitelikli fetal sığır serum, 2 mM sodyum pyruvate, %1 non-gerekli amino asitler, % 1 penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2-mercaptoethanol, LIF, 3 µM CHIR99021 ve 0.8 µM PD184352).</li>
</ol>3. hızlandırılmış mikroskobu
<ol><li>Mikroskop bırakmak ısı kontrollü ve CO2canlı görüntüleme için uygun kullanın. Sıcaklığı 37 ° C, CO%2 5'için kullanın ve 1-2 h için equilibrate için izin vermek için önceden ayarlayın.</li>
	<li>Plaka mikroskop yer ve noktalar görüntüleme için uygun bulmak. Nerede bu analiz kolaylaştıracaktır gibi hücreler eşit olarak dağıtılmış ama çok yoğun, noktalar seçin. Analiz için gerekli hücre sayısı için seçili noktaların sayısını ayarlayın. Bu çalışmada, 3-5 noktalar hücre satır başına kaydedildi.</li>
	<li>Hedefi seçin. 20 X amaç ES hücre boyutu için uygundur.</li>
	<li>Kaydedilecek floresan kanal (lar) aydınlatma ayarlarını seçin. Lazer güç ve ilgi hücrelerden Floresans sinyalin yoğunluğunu göre pozlama ayarlamak. O film boyunca azaltmak ama lazer güçler fototoksisite ve photobleaching en aza indirmek için 30 daha yüksek önlemek bu yana güçlü bir ilk sinyal aldığınızdan emin olun. Bu çalışmada, bir uyarma filtre 632/22 için nm (dalga boyu/bant), emisyon filtre 679/34 nm (dalga boyu/bant), lazer güç % 10 ve pozlama süresi 100 MS kullanılmıştır.</li>
	<li>Görüntüleme aralıkları ve hızlandırılmış deneme süresi seçin. Beklenen yarı-ömrü 2-20 h olan proteinler için 12-24 h edinme zamanlarında 15 dk zaman aralıkları ile seçin. Shorter-Lived proteinler için aralıkları ve longer-lived proteinler artış satın alma saatleri buna göre azaltın.</li>
	<li>Görüntüleme başlatın.</li>
</ol>4. görüntü işleme ve analiz
<ol><li>Alınan görüntüleri TIFF biçiminde bir yığın olarak toplamak. Daha fazla işleme ve analiz için FIJI yazılım15kullanın. Hızlandırılmış veri yığını olarak mikroskop bilgisayar yazılımı tarafından toplanan değil, tüm çerçeveleri hızlandırılmış deneme yazılımı açın ( dosya tıklayarak tarafından | Açık... veya sürükle ve araç çubuğu'na karşılık gelen dosyaları atılan) tıklatın ve resmi | Yığınlar | Görüntü yığını.</li>
	<li>Yığındaki tüm resimlerden arka plan çıkarmak için çıkarma arka plan işlevini kullanın. Bunu yapmak için işlemi ' ı tıklatın | Arka plan çıkarma. Çalışırken topu RADIUS açılır penceresinde seçin. En azından görüntüsü hücreleri büyüklüğünde bir RADIUS kullanın. Evet , arka plan çıkarma yığındaki tüm hücrelere uygulamak için seçin işlem yığın? açılır pencere.</li>
	<li>İlgi bir hücre seçin ve faiz (ROI) etrafında araç çubuğunu kullanarak bir bölgenin çizin. Nükleer sinyalleri için Oval seçim ilk araç çubuğunda karşılık gelen sekmeyi tıklayarak ve sonra faiz çekirdeği üzerinde tıklayarak ve oval etrafında ayarlayarak kullanın. Sitoplazmik sinyalleri veya çok yoğun bölgeler için serbest seçim hücre özetliyor yakından takip edebilmek için kullanın. Tüm arka plan pikseller (Adım 4,8-4,9) sonraki çıkarma nedeniyle tam olarak hücre anahatları takip için gerekli olmadığı halde çok büyük arka plan, bölgelerinde eklemekten kaçının.</li>
	<li>Analiz tıklatarak ROI Yöneticisi faiz bölgesine eklemek | Araçlar | ROI Yöneticisi | Eklemek, veya T klavye tuşlarına basarak.</li>
	<li>Sonraki kareye yığın penceresinde sekmesini taşıyarak veya üst karakter tuşuna basarak devam + < klavye, sonra önceki eylemlerin yineleyin. Hücre film seyri boyunca ilgi izleyin ve yatırım Getirisi her çerçevenin ROI Yöneticisi'ne ekleyin. Son ROI izlenen her hücre için daha fazla tıklatarak ayarlayın kaydetmek | Kaydet... ROI Yöneticisi'nde. Not: Ayrıca her iki kızı hücreleri hücre bölünmeler sonra izlemek ve onların entegre yoğunluklarda arka plan çıkarma sonra toplamı (protein seyreltme hücre bölünmesi sırasında hesaba 4.6-4,9 adımlara bakın). Her iki kızı hücreleri için yatırım Getirisi setleri kaydedin.</li>
	<li>Bir kez faiz hücre film izlenir, ortalama yoğunluğu ve ROIs alan değerlerini elde etmek için, ölçü birimi,'ı tıklatın. Elde edilen değerler bir elektronik tablo programına kopyalama ve hücrenin ham entegre yoğunluk her zaman noktası aşağıdaki gibi hesaplar: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> nerede cdemekortalama yoğunluğu vealanCkarşılık gelen yatırım Getirisi alan.</li>
	<li>Yerel arka plan tahmin etmek için hücrenin her zaman dilimi için ilgi yakın bir yatırım Getirisi ekleyin. Herhangi bir hücresel Floresans sinyal eklemekten kaçının. Kabaca bir hücre boyutudur dairesel bir yatırım Getirisi kullanın ve taşıma veya buna göre gerekirse, örneğin komşu hücreleri burnunu sokarsan küçültmek. Elektronik tabloya ölçülen yoğunluk değerleri kopyalamak ve yatırım Getirisi bir arka plan yatırım Getirisi elde etmek için ayarla ayarla cep ile daha önce açıklandığı gibi devam edin.</li>
	<li>Entegre yoğunluk hücre için arka plan-düzeltilmiş değer elde etmek için önce her zaman noktası arka entegre yoğunluğunu hesaplamak: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> arka plan sinyal ve alanC ortalama yoğunluğu nerede BG demek hücre çevreleyen ROI alanıdır. Her iki alanda aynı boyutta olmadığı sürece arka plan yatırım Getirisi, alanı kullanmayın.</li>
	<li>Her zaman için hücrenin son arka plan düşülen entegre yoğunluk Hesapla: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>Tek hücre çürümesine eğrileri normalize etmek her zaman-nokta yoğunluk değeri ilk zaman noktası yoğunluk değeri tarafından bölün. Not: Eğri uydurma (bkz. Adım 4.11) de her tek hücre veya nüfus ortalama gerçekleştirilebilir. Bir popülasyonun ortalama önyargıları farklı floresan yoğunluklarda hücreler arasında üzerinden önlemek için hesaplanır, bir normalleştirme gerek yoktur. Normalleştirme böylece her hücre son bozunma eğrisi için aynı ağırlık katkıda bulunur sağlar. Buna ek olarak, normalleştirme bağımsız olarak (bkz. Şekil 3A-3 C) onların mutlak Floresans yoğunluklarda tek hücre bozunmaları görselleştirmek yararlı olabilir. Ancak, eğer sadece tek hücreli yarı-hayat belirlenir ve verileri değil ortalama olarak, normalleştirme adım atlanabilir ve eğri uydurma doğrudan ham veriler üzerinde gerçekleştirilir.</li>
	<li>Protein half-life tahmini için bir eğri uydurma aracını kullanın. Bu çalışmada, MATLAB kullanıcı arabiriminin Apps bölümünde varsayılan olarak bulunduğu araç kutusu 3.4.1 uygun MATLAB eğrisi kullanıldı. Floresan yoğunluğu ithalat ve saat değerleri Veri al sekmesini tıklatarak elektronik tablo içine MATLAB'araç Montaj eğrisi açın ve floresan çürüme veri ve zaman Puan X veri ve Y seçin veri sekmesini seçin Özel denklem eğri uydurma tab ve üstel bir çürüme denklemi girin: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> f(t) floresan yoğunluğu zaman-noktada verildi, olduğu yerde bir ilk yoğunluğu ve b çürüme oranı. Uygun seçenekleri... sekmesinde, hem a ve balt sınırı için 0 seçin. A ve b için tahmini değerleri daha sonra sonuçları penceresinde görünür. Yarı ömrü aşağıdaki gibi hesaplar: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Protein+Half-Lives.">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct4+kinetics+predict+cell+lineage+patterning+in+the+early+mammalian+embryo.">Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo.</a> Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).</li><li>Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).</li><li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells.">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li><li>Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+O6-alkylguanine-DNA+alkyltransferase+for+applications+in+protein+labeling.">Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling.</a> Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).</li><li>Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).</li><li>Bojkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vivo+Protein+Half-Life.">Measuring In Vivo Protein Half-Life.</a> Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).</li><li>Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+quantitative+measurements+of+gene+expression+in+single+living+cells.">A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells.</a> Methods. 120, 65-75 (2017).</li><li>Komatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Measurements+of+Protein+Dynamics+Using+Fluorescence+Activation-Coupled+Protein+Labeling+Method.">Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method.</a> J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).</li><li>Deluz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+mitotic+bookmarking+of+SOX2+in+pluripotency+and+differentiation.">A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation.</a> Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).</li><li>Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+pathway+and+regulation+by+proteolysis.">The N-end rule pathway and regulation by proteolysis.</a> Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).</li><li>Tamm, C., Pijuan Galit&#243;, S., Anner&#233;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Protocols+for+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+Culturing.">A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).</li><li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-Cadherin-Coated+Plates+Maintain+Pluripotent+ES+Cells+without+Colony+Formation.">E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation.</a> PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hilsenbeck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+single-cell+tracking+and+quantification+of+cellular+and+molecular+properties.">Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties.</a> Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).</li><li>Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAST:+An+automated+segmentation+and+tracking+tool+for+the+analysis+of+transcriptional+kinetics+from+single-cell+time-lapse+recordings.">CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings.</a> Methods. 85, 3-11 (2015).</li><li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images.">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Comm. 8, (2017).</li><li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIDRE:+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy.">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li><li>Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminoimidazole-4-carboxyamide+Ribonucleoside+Induces+G1/S+Arrest+and+Nanog+Downregulation+via+p53+and+Enhances+Erythroid+Differentiation.">5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation.</a> Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Regulation+of+Akt+and+Oct4+Promotes+the+Self-Renewal+and+Survival+of+Embryonal+Carcinoma+Cells.">Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells.</a> Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).</li><li>Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+Oct4+Enhances+Its+Stability,+DNA+Binding,+and+Transactivation.">Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation.</a> J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).</li><li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Engineered+Protein+Tag+for+Multiprotein+Labeling+in+Living+Cells.">An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells.</a> Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis.">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Protein çürüme izlemek için ek etiketi kullanan hiçbir kalıntı ilişkisiz boya orta veya hücreleri olarak aksi takdirde yıkama sonrası bu sol emin olmak için yeni bağlamak olduğunda en önemli adım ek-etiket molekülleri daha sonra sırasında deneme ve orada üretilen Münir uzlaşma bozunma eğrisi. Bir yandan dikkatle açıklanan çamaşır adımları uygulayarak elde bu. Öte yandan, boya konsantrasyon hala iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için izin verir bir aralıktaki olurken mümkün old...

İyi hücresel protein sentezi ve yıkımı oranları belirli her protein ve fizyolojik düzenleme tabi olmak ile geniş ciro, tabi olduğu bilinmektedir. Geleneksel olarak, protein yıkımı oranları ölçülen radyoaktif darbe chase analizi gibi toplu yöntemleri kullanarak veya sikloheksimit1gibi protein sentez inhibitörleri içeren olmuştur. Daha yakın zamanlarda, kararlı izotop kütle spektrometresi ile birlikte (SILAC) hücre kültüründe amino asitler ile etiketleme bir küresel ölçekte2protein ciro ölçmek için kurulmuştur. Ancak, bu yöntemlerin nüfus sayı ortalaması alınarak sınırlıdır ve hücre-hücre değişkenlik hakkında bilgi bu nedenle kaybolur. Ayrıca, hücre nüfus arasında iseEşitlenmemiş protein yıkımı geçici değişimler tanımlanamıyor.
Alternatif olarak, protein yarı-hayat da hangi sık sık tek hücreli çözünürlük sağlama avantajına sahip floresan tabanlı yaklaşımlar tarafından belirlenebilir. Örneğin, bir photoactivatable yeşil flüoresan protein (paGFP) erken memeli embriyo3Oct4 half-life belirlemek için kullanılır. Canlı hücreler içinde protein çürüsün izlemek için başka bir yöntem bir ek etiketi Floresans hızlandırılmış görüntüleme ile birlikte kullanmaktır. EK-etiket DNA onarım enzim O6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) özellikle moleküler probları4,5' e, birleştiğinde (BG) türevleri ile benzylguanine tepki verir, mutasyona uğramış bir sürümüdür 6. bu nedenle, herhangi bir ek-etiket füzyon proteini bir Floresan, hücre geçirgen boya ile geri dönüşümsüz olarak etiketlenmiş. Darbe bir protein ek etiketi artık boya fiyasko tarafından takip, erimiş ilgi etiketlerine göre etiketli protein nüfus düşüşü izleme ve dolayısıyla protein half-life belirlemek için izin verir. Nabız-chase proteinlerin etiketleme için ek-etiketleri başarıyla kullanılmaktadır ve protein belirlemek için yarı-yapışık hayatımızda hücre kültür ve in vivo5,7,8,9. Yaygın olarak kullanılan çeşitli kapsayan ek-etiket yüzeylerde floresan spectra her özel uygulama için en iyi boya seçimi etkinleştirmek ticari olarak kullanılabilir. Böylece, ek-etiketleri diğer floresan füzyon protein veya boya ile çok renkli görüntüleme için de kullanılabilir. Hücre geçirgen boyalar hücre içi hem de membran bağlı proteinler izlemek için geçerlidir, ancak hücre geçirimsiz boyalar proteinler membran hayvan zinciri, etiketleme için uygundur. Ayrıca, bazı Bu sondalar neredeyse hiçbir Bazal Floresans sergi ve sadece ek-etiket10bağlama üzerine güçlü bir floresan sinyal yayan başlar.
Bu iletişim kuralı tek hücrelere ek etiketini kullanarak ilgi farklı protein yıkımı oranları ölçmek nasıl açıklar. Burada E-cadherin kültür fare embriyonik kök (ES) hücrelere bu yöntemi uygulamak, ama herhangi bir yapisan kültürlü hücre türü ile kullanmak mümkün olmalıdır. Biz ek-etiket füzyon protein Floresans hızlandırılmış görüntüleme tarafından takip darbe etiketleme tek hücre yarı-hayat ilgi çeşitli proteinlerin belirlemek için izin verir ve yarı-hayatımızda hücre hücre çeşitliliği için bir tahmin sağlar gösterir bir nüfus kültürlü hücre.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Equipment</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest</td>
			<td style="width:189px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:189px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate</td>
			<td style="width:189px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm</td>
			<td style="width:189px;">Marienfeld-superior</td>
			<td style="width:119px;">640030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:189px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;">MCO-170AICUV-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Centrifuge 5804 R</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td>5804000528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System</td>
			<td style="width:189px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">29027886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Name</td>
			<td style="width:189px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Reagents</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">16141-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">113-24-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Minimum Essential Medium&#160; Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:189px;">BioConcept</td>
			<td style="width:119px;">4-01F00H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Leukemia Inhibitory factor</td>
			<td style="width:189px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI)</td>
			<td style="width:189px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">361559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">PD 0325901</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">391210-10-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Gelatin from bovine skin</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dulbecco&#39;s PBS 10x concentrated</td>
			<td style="width:189px;">BioConcept</td>
			<td style="width:119px;">3-05K00-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dulbecco&#39;s PBS Without Ca++/Mg++</td>
			<td style="width:189px;">BioConcept</td>
			<td style="width:119px;">3-05F29-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Trypsin-EDTA-Solution 0.25%</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein</td>
			<td style="width:189px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">748-EC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">SNAP-Cell 647-SiR</td>
			<td style="width:189px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">S9102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">FluoroBrite DMEM</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Name</td>
			<td style="width:189px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Software</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">FIJI</td>
			<td style="width:189px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Open-source image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">MATLAB R2014a</td>
			<td style="width:189px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:189px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantification of protein degradation rates by time-lapse fluorescence microscopy in adherent cell culture

Protein sentezi dinamik bir durumda olduğundan ve bozulması ve yarı hayatlarını çeşitli şartlar altında ayarlanabilir. Ancak, en sık protein half-life ya olduğunu belirlemek için yaklaşımlar kullanılan lysed hücrelerden popülasyon ortalamaları için sınırlı veya protein sentez inhibitörleri kullanılmasını gerektirir. Bu iletişim kuralı protein yarı-hızlandırılmış Floresans mikroskobu ile birlikte ek-etiket füzyon protein kullanarak hayatımızda tek yaşam yapışık hücreleri, ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bir ek etiketi için erimiş ilgi herhangi bir protein kovalent birleştiğinde bir Floresan, hücre geçirgen boya tarafından benzylguanine türev bağlanabilir ve etiketli protein nüfus çürüme kalan boya fiyasko sonra izlenebilir. Sonraki hücre izleme ve miktar bir üstel çürüme eğri eğri uydurma tarafından protein yıkımı oranları Tek Kişilik hücrelerde belirlemek için izin izlenen her hücre için zaman sonuçlar üzerinde tümleşik Floresans yoğunluğunu. Bu yöntem için yarı-hayat kolayca diğer yöntemlerle ölçülen olamaz kültürlü hücrelerinin bir popülasyondaki heterojen bir tahmin sağlar. Burada sunulan yaklaşım kültürlü yapışık hücreleri bir protein bir ek etiketi için erimiş ilgi ifade, her türlü için geçerlidir. Burada E-cadherin kaplı hücre kültür Tabaklarda yetiştirilen fare embriyonik kök (ES) hücre protein oranları geniş bir yarı-hayat ile belirlenebilir nasıl tek hücre yıkımı göstermek için kullanın.

Açıklanan protokol tahmini hücre hücre değişkenlik half-life için bir ek etiketi için erimiş herhangi bir verilen protein sağlar. Aksi takdirde koloniler halinde yetişen ES hücreleri tek hücre çözümlenmek rekombinant E-cadherin-Fc kullanımı görüntü plaka kaplama için sağlar. Tek hücreler ayrı ayrı Film ( şekil 1A) ders boyunca izlenebilir.
Her tek hücre proteini half-life belirlemek için her iki kızı hücreleri entegre yoğunluklarda...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture at JoVE.com

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Bu iletişim kuralı protein yarı-tek yaşam yapisan hücrelerde, hayatını darbe etiketleme ve floresan hızlandırılmış görüntüleme ek-etiket füzyon proteinlerin kullanarak belirlemek için bir yöntem açıklanır.

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K Görüntüleme.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). Bu iletişim kuralı protein yarı-tek yaşam yapisan hücrelerde, hayatını darbe etiketleme ve floresan hızlandırılmış görüntüleme ek-etiket füzyon proteinlerin kullanarak belirlemek için bir yöntem açıklanır.

Video: Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Gelişim Biyolojisi

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Kültür Drosophila Egg Chambers Time-Lapse filmler kullanarak yerel hücresel ve doku ölçeklerde Actomyosin dinamikleri Analizi

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...