Die Autoren möchten die finanzielle Unterstützung von der University of Southern California, das National Heart, Lung, und Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli Edythe breiten Innovationspreis und l.k. Whittier Stiftung Non-Krebs zu erkennen Translational Research Award, EJC gewährt. Die Autoren danken Zentrum für Elektronenmikroskopie und Mikroanalyse, Center of Excellence in NanoBiophysics, Kompetenzzentrum für molekulare Charakterisierung und translationale Imaging Center der University of Southern California für die Unterstützung bei Instrumental-Setups.

Hinweis: Lesen Sie das MSDS für Reagenzien und befolgen Sie alle chemischen Sicherheitsmaßnahmen gemäß lokalen Institution.
1. Vorbereitung des MCP-1 PAMs
<ol><li>
Vorbereitung von MCP-1-Peptid
	<ol>
<li>Wiegen Sie 0,25 Mmol Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang in einem Reaktionsgefäß (RV). Spülen Sie die Seite des RV mit 5 mL Dimethylforamide (DMF) in einem chemischen Abzug.</li>
		<li>Laden Sie die RV auf eine automatisierte Benchtop-Peptid-Synthesizer. Last abgepackte Aminosäure Ampullen, N "- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C", aus dem C, N-Terminus. Enthalten Sie eine Leere Phiole am Ende für den endgültigen Deprotection Schritt. Hinweis: Eine verschlüsselte Peptid mit Sequenz, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', kann auch synthetisiert werden über das gleiche Protokoll.</li>
		<li>Sobald Synthese abgeschlossen ist, übertragen Sie die Peptide auf Harz von der RV auf das Funkeln Fläschchen mit ca. 2-3 mL Methanol bis alle Harze übertragen werden. Nachdem das Harz auf den Boden gesunken ist, entfernen Sie überstand das Methanol zu und verdunsten Sie, die restlichen bis trocken. Vakuum für weitere 2 h oder über Nacht bei Raumtemperatur trocken.</li>
		<li>12 mL Dekolleté-Lösung mit Trifluoracetic Säure (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 Vol % in einem chemischen Abzug zu machen. Schwenken Sie die Dekolleté-Lösung, um sicherzustellen, dass alles gleichmäßig vermischt ist. Achtung: Da Triisopropylsilane und Ethanedithiol luftempfindlichen, Argon purge Lager Fläschchen mit Triisopropylsilane und Ethanedithiol für 1 min vor dem Ablegen wieder.</li>
		<li>Stellen Sie die Synthese Gefäß (SV) auf einem Arm-Shaker durch Spannen der unteren Hälfte des SV. Übertragen Sie Peptid-Harz auf die SV mit 2 mL Dekolleté-Lösung, bis alle der Peptid-Harze übertragen werden.</li>
		<li>Waschen Sie die Seiten des SV mit 3 mL Dekolleté-Lösung. Schließen Sie den Deckel des SV und schütteln bei 300 Schwingungen/min für 4 h.</li>
		<li>Eine leere 50 mL Zentrifugenröhrchen abwiegen. Notieren Sie die Masse.</li>
		<li>Entleeren Sie nach 4 h die gespalten Peptidlösung vom SV in der 50 mL Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die SV mehrmals mit der restlichen Dekolleté-Lösung.</li>
		<li>Verdunsten Sie gespalten Peptidlösung mit Stickstoff bis gibt es weniger als 4 mL in die Zentrifugenröhrchen bleiben.</li>
		<li>36 mL eiskaltes Äther der Peptid gespalten Projektmappe hinzufügen.</li>
		<li>Vortex ist die Lösung bis es komplett weiß oder gelb. Zentrifugieren bei 3.000 x g für 5 min bei 4 ° C, und den Überstand abgießen.</li>
		<li>Der Tube 40 mL eiskaltes Äther hinzufügen. Wirbel und beschallen wieder. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Den Überstand abgießen.</li>
		<li>Trocknen Sie das rohe PA-Pellet mit Stickstoff Gas spülen, bis der Äther sichtbar verdunstet ist.</li>
		<li>Geben Sie 20 mL bidestilliertem Wasser, Wirbel und beschallen bis das Peptid in Lösung vollständig gelöst ist.</li>
		<li>Frieren die Lösung und lyophilize trocknen.</li>
		<li>Sobald das Peptid getrocknet ist, wiegen Sie die Masse der Zentrifugenröhrchen, das rohe-Peptid enthält. Das rohe Peptid in 5 mg/mL Wasser auflösen.</li>
		<li>25 mg von Rohöl MCP-1-Peptid in 5 mL bidestilliertem Wasser eine totale Konzentration von 5 mg/mL zu lösen. Reinigen Sie das rohe MCP-1-Peptid durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit 0,1 % TFA in Wasser (Lösungsmittel A) und 0,1 % TFA in Acetonitril (Lösungsmittel B) als mobilen Phasen auf einer C8-Reverse-Phase-Spalte. Injizieren Sie die 5 mL des Peptids in der HPLC. Hinweis: Die erste mobile Phase bestand aus 100 % Lösungsmittel A bei einer Durchflussrate von 9,0 mL/min Lösungsmittel A langsam auf 30 % in 27 min zu verringern und halten Sie in dieser Zusammensetzung für 3 min. Rückkehr der Gradient zu 100 % Lösungsmittel eine über 3 min und halten an dieser Komposition für 1 min zu geben eine Gesamtlaufzeit von 34 min. halten die Spalte Temperatur bei 55 ° C. Verwenden Sie positive Ionen Quellmodus für die Analyse. Ameisensäure kann anstelle von TFA, verwendet werden, wenn TFS zu sauer für die HPLC-Säule. Es wird empfohlen, die organische Lösungsmittel Zusammensetzung Rampe Geschwindigkeit 2%/min für bessere Trennung nicht überschreiten sollte.</li>
		<li>Jede Fraktion mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI) Massenspektrometrie für das erwartete Produkt m/Z bei 2.890 zu analysieren. Hinweis: Lösen Sie α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure bei 1 mg/mL in Acetonitril/Wasser (50: 50 Vol-% auf) als die Matrixlösung. Vor Ort 0,75 µL Matrixlösung auf den MALDI-Teller, gefolgt von 0,75 µL der einzelnen Fraktionen. Führen Sie die Analyse mit einem positiven reflektierende Ionen-Modus im Massenbereich von 500-5.000 Da.</li>
		<li>Kombinieren Sie Produkt Brüche, Abblasen Acetonitril, Einfrieren und lyophilize gereinigte Peptide bis trocken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung von MCP-1 PA
	<ol>
<li>Bereiten Sie ein 1.1 molaren Überschuss von 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[Amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000) Maleimide Peptid in separaten funkeln Fläschchen. Lösen Sie beide Verbindungen in bidestilliertem Wasser machen ~ 15 mg/mL. Beschallen Sie für 15 Minuten oder bis beide Lösungen völlig klar sind. Hinweis: DSPE-PEG (2000)-Cy5 synthetisiert unter Verwendung des gleichen Protokolls mit DSPE-PEG (2000)-Amin und N-Hydroxysuccinimide (NHS) Ester funktionalisiert Cy5, mit Ausnahme von Schritt 1.2.3, wo der pH-Wert der Lösung bis 8,5 eingestellt wird.</li>
		<li>Die Peptidlösung DSPE-PEG (2000)-Maleimide-Lösung hinzufügen. Wirbel und beschallen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 M NaOH tropfenweise (1 µL) nacheinander, bis der pH-Wert der Lösung 7 beträgt.</li>
		<li>Stickstoff-Aufräum-Lösung für 5 min. Rühren Sie die Lösung über Nacht.</li>
		<li>Frieren die Lösung und lyophilize trocknen.</li>
		<li>Sobald das Rohprodukt getrocknet ist, lösen Sie den Feststoff in 5 mg/mL Wasser auf.</li>
		<li>Reinigen Sie mit HPLC, wie oben beschrieben. Hinweis: Unconjugated Peptid und DSPE-PEG(2000) sollte zwischen 15-30 % organische Konzentration (Vol%), während DSPE-PEG eluieren (2000)-MCP-1-Konjugat sollte zwischen 40-50 % Bio Konzentration eluieren.</li>
		<li>Analysieren Sie jede Fraktion mittels MALDI Massenspektrometrie für die entsprechenden m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1 eine breite m/Z-Spitze bei 5.760 haben sollte. Hinweis: 2,5-Dihydroxybenzoic Acid wird am besten als Matrix für DSPE-PEG (2000)-MCP-1 mit MALDI verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage von MCP-1 PAMs
	<ol>
<li>Auflösen von 1,75 mg MCP-1 PAs mit 3 mL Methanol in einem 1-Dram-Fläschchen. Beschallen Sie bis die MCP-1 PA vollständig gelöst ist. Hinweis: Cy5 amphiphilen können in einem molaren Verhältnis von 10: 90 MCP-1 PA für imaging-Anwendungen integriert werden.</li>
		<li>Verdampfen Sie das Methanol unter Stickstoff in einer kreisförmigen Bewegung während der Seite des Röhrchens das restliche Methanol abspülen, bis ein gleichmäßiger Film an der Unterseite der Flasche entsteht. Vakuum-trockenen Film über Nacht.</li>
		<li>Den Film mit 3 mL Wasser oder Phosphat-Puffer-Hydrat Kochsalzlösung (PBS), eine 100 µM-Lösung von MCP-1 PAMs zu machen. Sanft Wirbel und beschallen die Lösung bis frei. Bei 80 ° C für 30 min inkubieren. Hinweis: Die erhöhte Temperatur hat gezeigt, dass die Selbstmontage Prozess beschleunigen und ermöglicht es der Peptid-Komponente, die stabilste Sekundärstruktur zu bilden, während die Senkung der kritischen Micelle Konzentration (CMC)42,43.</li>
		<li>Die resultierende Dispersion auf Raumtemperatur abkühlen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Charakterisierung von MCP-1 PAMs
<ol><li>
Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zetapotenzial
	<ol>
<li>Platz 100 µM von MCP-1 PAM oder Rührei PAM in eine Küvette gemäß den Anweisungen des DLS oder Zeta potential Instruments. Hinweis: DLS und Zeta potential Küvetten können unterschiedlich sein auf der Grundlage des Instruments Anweisungen.</li>
		<li>Equilibrate das Instrument auf Raumtemperatur. Messen Sie die Größe und die Oberflächenladung der PAM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)
	<ol>
<li>Fügen Sie 7 µL von 50 µM MCP-1 PAM oder Rührei PAM auf ein TEM-Raster ausgesetzt in eine selbstschließende Pinzette für 5 min. Docht das Tröpfchen mit einem heiklen Aufgabe abwischen.</li>
		<li>Fügen Sie 7 µL Wasser um das Raster zu waschen. Docht entfernt das Droplet.</li>
		<li>Fügen Sie 7 µL 1 wt % Phosphotungstic Acid für 2 min. Docht entfernt das Droplet. Wiederholen Sie Schritt 2.2.2.</li>
		<li>Trocknen Sie die TEM-Raster vor TEM Analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kreisförmigen Dichroismus (CD) Spektroskopie
	<ol>
<li>Schalten Sie den Stickstoff für 5-10 min vor dem Gebrauch des Gerätes.</li>
		<li>Küvette 300 µL des Rohlings (Wasser oder PBS) entgegenbringen.</li>
		<li>Spektren bei 190-265 nm, 0,2 mm-Länge mit einem 1 s Integrationszeit und 1 nm Bandbreite bei Raumtemperatur zu messen. Sammeln Sie 3 Wiederholungen.</li>
		<li>Maßnahme 100 µM-MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, kletterte Peptid und Rührei PAM unter den gleichen Bedingungen im Schritt 2.3.3 beschrieben. Subtrahieren Sie vom Rohling.</li>
		<li>Passen Sie die Daten über eine lineare Interpolation von Polylysin Grundlage Spektren.</li>
		<li>Schalten Sie das Gerät. Warten Sie 10 Minuten vor dem Ausschalten des Stickstoffs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. in-vitro- Analyse der MCP-1 PAMs
<ol><li>
In-vitro- Biokompatibilität
	<ol>
<li>Kultur und erweitern WEHI 274,1 murine Monozyten in Dulbeccos geändert Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol in 37 ° C weniger als 5 % CO2 , Abschnitt 5. Hinweis: WEHI 274,1 sind Aussetzung Zellen. Bei der Kultivierung, sollten die Medien alle 2-3 Tage wieder aufgefüllt.</li>
		<li>Pipettieren Monozyten in den Medien in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Die alten Medien Aspirieren und in 10 mL frische Medien in die Zentrifugenröhrchen Aufschwemmen. Mischen, langsam, bis die Zellen in den Medien gleichmäßig verteilt sind. Zählen der Zellen verwenden Trypan blau Färbung und eine Hemocytometer.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Zellen so, dass es 4.000 Monozyten pro 90 µL Medien pro Bohrloch. Fügen Sie 90 µL Zellen in Brunnen eine 96-Well-Platte. 24 h inkubieren. Hinweis: Vermeiden Sie die Verwendung der Brunnen auf der Außenkante der Platte, um Unterschiede bei der Verdunstung und thermische Veränderungen in der Platte zu vermeiden. Füllen Sie die äußere Vertiefungen mit 100 µL PBS.</li>
		<li>0,15 µmol MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, Rührei Peptid oder Rührei-PAM in 150 µL PBS in separaten, sterilisierte Mikrozentrifugenröhrchen auflösen. Führen Sie serielle Verdünnung um 65 µL 1, 10 und 100 µM jeder Probe zu machen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL PBS für jede Konzentration in Brunnen mit WEHI 274,1 (Gesamtvolumen: 100 µL pro gut, 6 Zeilen, insgesamt 96 Wells). 72 h inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) in jede Vertiefung. 1 h inkubieren.</li>
		<li>Analysieren Sie die Absorption mit einem Teller Reader auf 490 nm oder basierend auf den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In-vitro- Micelle Bindung
	<ol>
<li>Samen 500.000 Monozyten in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in 2 mL Medium mit 100 µM Cy5-Label MCP-1 PAM (10: 90 Molverhältnis von DSPE-PEG (2000)-Cy5 und MCP-1 PA). 1 h inkubieren.</li>
		<li>Sammeln Sie WEHI 274,1 durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die Medien.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie und waschen Sie die Zellen in 2 mL PBS. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 2 mL PBS. Aspirieren Sie die PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 2 mL kalten 4 % Paraformaldehyd, die Zellen zu beheben. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Pipettieren der fixen Zellen auf einem sterilen Glas Deckgläschen in Brunnen von einem 6-Well-Platte. 400 X g für 5 min zentrifugieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die Paraformaldehyd. Waschen und Spülen mit 2 mL PBS einmal. Mit 1 mL PB Aufschwemmen Hinweis: Beim Spülen, nicht zu stören die Zellen auf das Deckglas.</li>
		<li>Setzen Sie 10 µL von 90 % Glycerin mit PBS-Puffer auf eine Folie. Benutzen Sie eine Nadel und Pinzette um zu holen das Deckglas. Trocknen Sie den Rand des Deckglases. Legen Sie vorsichtig das Deckglas auf einer Folie verdeckt.</li>
		<li>Versiegeln Sie vorsichtig den Rand des Deckglases mit klaren Nagellack. Legen Sie in den Kühlschrank bis bereit für die Bildgebung.</li>
		<li>Verwenden einen konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) installiert mit Lasern für Cy5 bei λErregung = 650 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

MCP-1 PAMs sind eine vielversprechende molekulare Bildgebung-Plattform, bestehend aus einer hydrophilen targeting Peptid und hydrophobe Endstück, das treibt die selbstgebaute Natur der Nanopartikel. Diese Monocyte-targeting Micelle kann durch einfache Synthese und Reinigungsschritte der MCP-1-Peptid und DSPE-PEG (2000)-MCP-1 hergestellt werden. PAMs haben viele vorteilhafte Eigenschaften für molekulare Bildgebung in Vivo wie ihre Selbstmontage unter milden Bedingungen, intrinsische biologische Abbaubarkeit und strukturelle und chemische Vielfalt ermöglicht die Einbeziehung der anderen bildgebenden Moieties oder Ausrichtung Peptide, gezielt auf einen bestimmten Standort des Interesses zu liefern. Ihre Partikelgröße, Form und Zusammensetzung können abgestimmt werden, indem das Peptid, hydrophobe Schweif oder Micelle Konzentration, so dass optimale chemische und physikalische Eigenschaften für eine Vielzahl von Anwendungen22,33.
Ein paar Einschränkungen dieses Protokolls sollte erwähnt werden. Zuerst, da PAMs durch hydrophobe Wechselwirkungen getrieben werden, ist es notwendig, gezielt Peptide zu konstruieren, die hydrophilen, wodurch das targeting Abstimmungsunterlagen auf der Oberfläche der Micelle vorzulegen sind. Wenn der Peptidsequenz hydrophob ist, ein Zusatz von ein oder zwei hydrophile Aminosäuren am C-Terminus untergebracht werden kann, aber der Zusatz von Aminosäuren die Peptid-Sekundärstruktur innerhalb der Micelle beeinflussen könnten, und ändern der Eigenschaften der Peptid in seinen Heimatstaat in das Protein44,45. Zweitens bei niedrigen Konzentrationen haben PAMs schlechte Stabilität in wässrigen Umgebungen, sind stark abhängig von der CMC, die minimale Konzentration benötigt für PAs ein Mizellen Struktur46zu bilden. Unterhalb der CMC Micelle zerlegt zu einzelnen PA-Monomere und der Micelle fungieren als Träger und Entladen ein Medikament bei einem bestimmten Standort47begrenzt. Um diesen Nachteil zu beheben, kann die CMC verringert werden, durch die Erhöhung der Kettenlänge der hydrophoben Schweif48,49. Zu guter Letzt ist die langfristige Lagerung von PAMs in Lösung nicht empfohlen, da PA Sekundärstruktur mit der Zeit ändern kann und beeinträchtigt dadurch die Mizellen Struktur und Stabilität, sowie Effizienz bei der Ligand verbindliche26.
In der Summe zeigt dieses Protokoll eine robuste, selbstgebaute Peptid Micelle-basierte Nanomedizin Strategie für Atherosklerose-Bildgebung. MCP-1 PAMs sind biokompatibel, biologisch abbaubar und ungiftig, da Komponenten der Micelle von endogenen Elemente an den Körper inspiriert sind. Noch wichtiger ist, haben die MCP-1 PAMs bevorzugte Bindung an Monozyten, die proportional zu Plaque Progression zu erhöhen, einen nicht-invasive Ansatz zur Differenzierung Stufen von atherosklerotischen Plaques zu erleichtern. Aufgrund der Modularität dieser Plattform können PAMs Therapeutika, zusätzliche Ausrichtung Peptide, bildgebenden Moieties und Nukleinsäuren integrieren. Daher glauben angesichts solch dynamischen Fähigkeiten von dieser multifunktionalen Micellen, wir, dass diese Teilchen große Versprechung für klinische Übersetzung bei Arteriosklerose und anderen Krankheiten halten.

Herz-Kreislauf-Krankheiten bleiben die führenden Todesursachen weltweit mit etwa 17,3 Millionen Todesfälle weltweit1. Herz-Kreislauf-Krankheiten sind durch Arteriosklerose, eine Bedingung trugen in denen Plaques in den Arterien, dadurch hemmende Blut- und Sauerstoffzufuhr zu den Zellen des Körpers2,3bauen. Die Progression der Atherosklerose beinhaltet die Verdickung und Verhärtung der Arterien durch eine entzündliche Reaktion, unregelmäßige Fettstoffwechsel und Plaquebildung, führt zu Plaque Ruptur und Myokardinfarkt4,5. Endothelzellen express Zytokine und Adhäsion Moleküle, die MCP-1, die an den C-C Chemokin-Rezeptor (CCR2 enthalten) auf der Oberfläche der Monozyten6,7,8bindet. Oxidiertes Cholesterin wandelt Monozyten zu Makrophagen in der frühen Phase der Plaquebildung, die verstärkt der entzündlichen Reaktion in der Region und führt zu Gewebeschäden und die Bildung von Plaques instabil oder gefährdeten9, 10.
Traditionell wird Arteriosklerose durch die Beurteilung der luminalen Stenose durch anatomische Bildgebung mit Ultraschall oder Angiographie11,12ausgewertet. Diese Methoden können aber nur feststellen starke Verengung der Arterienwand und nicht die frühen Stadium der Arteriosklerose, wie erste Gedenktafel Wachstum führt zu arteriellen Umbau um Arterie Größe beizubehalten und blood Flow Rate12,13, 14. Daher underrepresent Angiogramme Atherosklerose Prävalenz. Darüber hinaus nicht-invasive bildgebende Verfahren wie single Photonenemission berechnet Tomographie, Positronen-Emissions-Tomographie und Magnetresonanz-Bildgebung vor kurzem wurden verwendet, um Plaque-Morphologie zu charakterisieren, da sie erste Details bieten können und Charakterisierung von Plaques. Aber diese Modalitäten sind oft begrenzt durch den Mangel an Sensibilität, räumliche Auflösung, oder erfordern die Verwendung von ionisierender Strahlung, machen bildgebende Plaque Fortschreiten in den verschiedenen Phasen viel mehr herausfordernde15,16, 17. Ein bildgebendes System der Lieferung, das speziell Plaques in den verschiedenen Phasen der Atherosklerose identifizieren würde bleibt entwickelt werden.
Nanopartikel haben eine neue Plattform für in Vivo Plaque-targeting und Diagnostik18,19,20,21gezeigt. Insbesondere sind PAMs vorteilhaft aufgrund ihrer chemischen Vielfalt und die Fähigkeit, eine Vielzahl von Moieties, Kompositionen, Größen, Formen und Oberflächen Funktionalisierung22unterbringen. Peptid amphiphilen (PAs) bestehen aus einem hydrophilen, Peptid "Headgroup" befestigt eine hydrophobe Schwanz, die in der Regel sind Lipide; Diese amphiphile Struktur verleiht selbstorganisierende Funktionen und ermöglicht eine multivalente Anzeige der Peptide auf der Oberfläche der Partikel22,23,24. Die Peptid-Headgroups beeinflussen die Kornform durch Falt- und Wasserstoffbindung zwischen Peptide25. Peptide, die durch die Interaktion der β-Blatt Falten haben gezeigt, dass längliche Micellen zu bilden, während α-helikale Bestätigung sowohl sphärische und längliche Micellen22,23,24, bilden kann 25,26,27. Polyethylenglykol (PEG) linker, die Oberflächenladung des Peptids schützen können zwischen der hydrophilen Peptid und das hydrophobe Ende der PAMs, Verbesserung der Verfügbarkeit der Nanopartikel im Körperkreislauf28, platziert werden 29 , 30 , 31. PAMs sind auch vorteilhaft, weil sie biokompatibel sind und gezeigt haben, dass ein breites Spektrum von Anwendungen32,33. Die Wasserlöslichkeit von Micellen bietet einen Vorteil gegenüber anderen Nanopartikel-basierten Systemen wie z. B. bestimmte Polymere Nanopartikel, die nicht in Wasser löslich und in Lösungsvermittler für Injektionen34ausgesetzt werden. Darüber hinaus macht die Fähigkeit zum Erstellen von PAMs, das Zerlegen in Reaktion auf bestimmte Reize PAMs einen attraktive Kandidaten für kontrollierte intrazellulären Droge Lieferung35.
Durch Bindung an den Rezeptor CCR2 und akkumulieren in den Aortenbogen, wurden zuvor PAMs für Monocyte gezielt zur Überwachung der verschiedener Phasen von atherosklerotischen Läsionen in der Aorta9entwickelt. ApoE- / - Mäusen Monocyte Ansammlung steigt proportional zu Plaque Fortschreiten36. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Patienten mit Ruptur neigende, Spätstadium Plaques höhere Mengen an Monozyten37 enthalten. Daher ist die Änderung der PAMs, MCP-1 einzubeziehen nützlich, denn es größere targeting Spezifität und Differenzierung zwischen frühen und späten Stadium atherosklerotische Läsionen ermöglicht. Diese Proof-of-Concept-Studien überprüft auch, ob PAMs sind sicher genug vorklinisch verwendet werden und renally38deaktiviert sind. Da Monozyten und Entzündungen charakteristisch für andere Krankheiten sind, haben MCP-1 PAMs das Potenzial, für therapeutische und diagnostische Anwendungen in anderen Krankheiten über Arteriosklerose8,39,40 verwendet werden , 41.
Hier berichten wir über die Herstellung von hoch skalierbare und selbst-zusammengebauten MCP-1 PAMs, die optimale Größe, Oberflächenladung und gezielte Ausrichtung auf Monozyten für erweiterte imaging-Anwendungen in Atherosklerose des Teilchens nachgewiesen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">1,2-ethanedithiol</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">E0032</td>
			<td style="width:259px;">for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mL disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 mL centrifuge tubes, polypropylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89401-566</td>
			<td>for various applications</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>AC165200050</td>
			<td>for MALDI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25 mL disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-900</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">2-Mercaptoethanol, 50 mM</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31350010</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td>for various applications</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">75 cm2 culture flask</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-680-65</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">75 mL reaction vessel</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>3000005</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-wells cell culture plate</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>40101-346</td>
			<td>for MTS assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>A998SK-4</td>
			<td>for HPLC purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosilicate glass, 1 dram</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>for PAM synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosillicate glass pipet, Long tips</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td>for various applications</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td>for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Cy5 amine</td>
			<td style="width:147px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab146463</td>
			<td>for peptide conjugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Diethyl ether, ACS grade</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">E138-1</td>
			<td>for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable syringes, 20 mL</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-54</td>
			<td>for HPLC purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Double neubauer ruled hemocytometer</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>63510-13</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">DSPE-PEG(2000) amine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td style="width:119px;">880128P</td>
			<td>for peptide conjugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">DSPE-PEG(2000) maleimide</td>
			<td>Avanti</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td>for peptide conjugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DSPE-PEG(2000)-NHS ester&#160;</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-DSNS-10K</td>
			<td>for conjugation to Cy5</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium-high glucose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796-500ML</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10438026</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-A</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-RBF</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-NT</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-CT</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-QT</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-I</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-L</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-KBC</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-F</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-SB</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-TB</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-YB</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-V</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td style="width:119px;">856013</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid, optima LC/MS grade</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>for HPLC purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Glycerol</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">M152-1L</td>
			<td>for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hand tally counter</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S90189</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stir bars, egg-shaped</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>58949-006</td>
			<td>for peptide conjugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol, ACS certified</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>for PAM synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTS cell proliferation colorimetric assay kit</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10191-104</td>
			<td>for MTS assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N,N-Dimethylformamide, sequencing grade</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1160-4</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Methylmorpholine</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>S-1L-NMM</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC416780250</td>
			<td>for fixing cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for various applications</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Peptide synthesis vessel, 25 mL&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CG186011</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Phosphotungstic acid&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A248-25</td>
			<td>for TEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Piperidine</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>P1146-2.5LTGL</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain glass microscope slide 75 x 25 mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent reservoirs, sterile&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95128093</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Self-closing tweezer</td>
			<td style="width:147px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">515</td>
			<td>for TEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TEM support film</td>
			<td style="width:147px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">01814F</td>
			<td>for TEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP618-500</td>
			<td>for peptide cleavage and HPLC purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triisopropylsilane</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>TCT1533-5ml</td>
			<td>for peptide cleavage</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15250061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tweezer, general purpose-serrated</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>231-SA-SE</td>
			<td>for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WEHI-274.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC&#160;CRL-1679</td>
			<td>murine monocyte</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">automated benchtop peptide synthesizer</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:259px;">PS3 Benchtop Peptide Synthesizer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#945;- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>476870-2G</td>
			<td>for MALDI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles for imaging of atherosclerosis

Atherosklerose ist ein wesentlicher Faktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, die häufigste Todesursache weltweit, der jährlich 17,3 Millionen Todesopfer fordert. Atherosklerose ist auch die häufigste Ursache des plötzlichen Tod und Myokardinfarkt, angestiftet von instabilen Plaques, die platzen und verdecken das Blutgefäß ohne Vorwarnung. Aktuelle bildgebende Modalitäten kann nicht unterscheiden zwischen stabilen und instabilen Plaques, die platzen. Peptid amphiphilen Micellen (PAMs) können diesen Nachteil überwinden, wie sie können, mit einer Vielzahl geändert werden von targeting Moieties, die speziell auf erkranktes Gewebe zu binden. Monozyten haben gezeigt, zu frühe Marker für Arteriosklerose, während große Ansammlung von Monozyten Plaques anfällig für Bruch zugeordnet ist. Daher können Nanopartikel, die Monozyten abzielen kann verwendet werden, verschiedene Stadien der Arteriosklerose zu unterscheiden. Zu diesem Zweck hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vorbereitung des Monocyte-targeting PAMs (Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sind selbst zusammengebaut durch Synthese unter milden Bedingungen, Form Nanopartikel von 15 nm im Durchmesser mit in der Nähe von neutralen Oberflächenladung. In Vitro, PAMs erwiesen sich biokompatible und hatte eine hohe Bindungsaffinität für Monozyten. Die hier beschriebenen Methoden zeigen, Versprechen für ein breites Anwendungsspektrum in Atherosklerose sowie anderen entzündlichen Erkrankungen.

Vorbereitung von MCP-1 PAM Das CCR2-Bindung-Motiv (Rückstände 13-35) der MCP-1 Protein [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] oder Rührei Peptid [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] wurde modifiziert, indem ein Cystein-Reste auf dem N-Terminus. Das MCP-1-Peptid wurde durch eine Fmoc-vermittelten Festphasen-Methode unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthesizers synthetisiert. Das rohe-Peptid wurde gereinigt, durch Reverse-Phase-HPLC auf eine Spalte C8 bei 50 ° C mit 0,1 % TFA in Acetonitril/Wasser-Gemischen und zeichnet sich durch MALDI-Massenspektrometrie (Abbildung 1). Das Cystein-haltigen Peptid wurde auf DSPE-PEG2000-Maleimide DSPE-PEG (2000)-Peptid Konjugate über ein Gestänge Thioether Ausbeute konjugiert. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Rohprodukt durch HPLC (Abbildung 2) gereinigt. DSPE-PEG (2000)-Cy5 wurde mit einer NHS-Ester-Reaktion synthetisiert. Monocyte-targeting PAMs Co montiert mit DSPE-PEG (2000)-MCP-1 und DSPE-PEG (2000)-Cy5 wurden durch Auflösen in Methanol, die dann von N2eingedampft wurde hergestellt, und der resultierende Film wurde über Nacht unter Vakuum getrocknet und selbst im Wasser montiert oder PBS durch die hydrophoben Wechselwirkungen der Form MCP-1 PAMs "Schweif Gruppen".
Charakterisierung von MCP-1 PAM DLS-Daten und TEM Bilder von Monocyte-targeting PAMs zeigte gut dispergierte, kugelförmigen Nanopartikel von 15,3 ± 2,0 nm im Durchmesser (Abbildung 3 und Tabelle 1). MCP-1 PAMs und Rührei PAMs zeigten einen leichten positiven Zeta potential von 12,1 ± 3,1 mV und 13,7 ± 1,9 mV, bzw. (Tabelle 1). CD hat gezeigt, dass die Einbeziehung von MCP-1-Peptid innerhalb der Micelle die Sekundärstruktur verbessert (Tabelle 2, MCP-1 PAMs: 46,2 ± 0,9 % β-Sheet, 53.1 ± 1,4 % zufällige Spule und kostenlose MCP1: 34,2 ± 3,5 % β-Sheet, 65.8 ± 3,5 % zufällige Spule).
In-vitro- Analyse von MCP-1 PAM In-vitro- Biokompatibilität und Monocyte Bindung von MCP-1 PAMs wurden von konfokalen Mikroskopie beobachtet. Maus Monozyten mit steigenden Konzentrationen von MCP-1, MCP-1 PAM, Rührei Peptid und Rührei PAM für 72 h inkubiert wurden, und die Zellen erwiesen sich tragfähige und biokompatible bis zu 100 µM (Abbildung 4). Darüber hinaus zeigte konfokalen Mikroskopie spezifische Bindung der Monozyten, MCP-1 PAMs im Vergleich zu Rührei PAMs (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56625/56625fig1.jpg"> Abbildung 1 : HPLC-Chromatogramm bei 220 nm (Wellenlänge von Peptidbindungen) und 254 nm (Tyrosin Wellenlänge) MCP-1-Peptid (A) und Rührei Peptid (B) (Boxed Spitze bei 7,4 min). MALDI-TOF Massenspektrum von MCP-1-Peptid (C) und Rührei Peptid (D) bei einer Reichweite von 500-5.000 Da zeigt die Spitze [M + h]+ bei m/Z 2.888 (erwartete 2.890). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56625/56625fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56625/56625fig2.jpg"> Abbildung 2: HPLC-Chromatogramm bei 220 nm (Wellenlänge von Peptidbindungen) und 254 nm (Tyrosin Wellenlänge) der DSPE-PEG (2000)-MCP-1 (A) und der DSPE-PEG (2000)-(B) verschlüsselt. (Boxed Peak bei 16,9 min). (C) MALDI-TOF Masse Spektrum der DSPE-PEG (2000)-MCP-1 bei einer Reichweite von 1.000-10.000 Da zeigt die Gipfel [M + h]+ bei m/Z 2.888 (erwartete 2.890) für MCP-1 und m/Z 5.758 (erwartete 5.760) für DSPE-PEG (2000)-MCP-1. (D) MALDI-TOF Masse Spektrum der DSPE-PEG (2000)-verschlüsselt in einem Bereich von 1.000-10.000 Da zeigt die Peaks für [M + H]+ bei m/Z 2.887 (erwartete 2.890) für verschlüsselte Peptid und m/Z 5.761 (erwartete 5.760) für DSPE-PEG-verschlüsselt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56625/56625fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56625/56625fig3.jpg"> Abbildung 3 : TEM Bilder von MCP-1 PAM (A) und kletterte PAM (B). Maßstabsleiste = 100 nm. Anzahl-Durchschnitt Größenverteilung von MCP-1 PAM (C) und kletterte PAM über DLS (D). Daten sind Mittelwert ± S.D. (n = 3). (E) CD-Analyse von MCP-1 und Rührei Peptide und PAMs (n = 3). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56625/56625fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56625/56625fig4.jpg"> Abbildung 4 : In-vitro- Lebensfähigkeit des WEHI 274,1 murinen Monozyten nach 72 h MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, Rührei Peptid und verschlüsselte PAM. Daten sind Mittelwert ± S.D. (n = 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56625/56625fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56625/56625fig5.jpg"> Abbildung 5: CLSM Bilder von MCP-1 PAM (A) und Rührei PAM (B) integriert mit 10 Mol% Cy5 PA (rot) mit WEHI 274,1 für 1 h. Maßstabsleiste inkubiert = 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56625/56625fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PAMs</td>
			<td>Anzahl-Ave Durchmesser (nm)</td>
			<td>PDI</td>
			<td>Zeta-Potential (mV)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MCP-1</td>
			<td>15,3 ± 2.0</td>
			<td>0.119 ± 0,006</td>
			<td>12,1 ± 3,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rührei</td>
			<td>16.9 ± 1,4</td>
			<td>0.232 ± 0,019</td>
			<td>13.7 ± 1,9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">In PBS-Puffer gemessen. Daten werden ausgedrückt als ± SD bedeuten</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Größe, Polydispersität und Zeta-Potential von PAMs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>a-Helix (%)</td>
			<td>b-Blatt (%)</td>
			<td>Zufällige Spule (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MCP-1-Peptid</td>
			<td>0.0 ± 0.0</td>
			<td>36.2 ± 2,2</td>
			<td>63,8 ± 1,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>MCP-1 PAM</td>
			<td>0,7 ± 0,6</td>
			<td>46,2 ± 0,9</td>
			<td>53.1 ± 1,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verschlüsselte Peptid</td>
			<td>0.0 ± 0.0</td>
			<td>43,7 ± 2,1</td>
			<td>56,3 ± 3,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verschlüsselte PAM</td>
			<td>0.0 ± 0.0</td>
			<td>60.7 ± 0,2</td>
			<td>39,3 ± 0,2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Sekundärstruktur Zusammensetzung der Peptide und PAMs.

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Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Dieses Papier stellt eine Methode, mit der Synthese und Charakterisierung von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen und den entsprechenden assays für Biokompatibilität und Fähigkeit der Micelle binden an Monozyten zu testen.

Synthese von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen für die Bildgebung der Atherosklerose

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Aufrufe.  University of Southern California. Dieses Papier stellt eine Methode, mit der Synthese und Charakterisierung von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen und den entsprechenden assays für Biokompatibilität und Fähigkeit der Micelle binden an Monozyten zu testen.

Serie: Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Forschung

Biotechnik

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband Optical Detector von Ultraschall für medizinische Imaging-Anwendungen

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Synthese von Keratin-basierten Nanofaser für Biomedizinische Technik

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Mikrowelle gesteuerte Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für die schnelle Erkennung von Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

A protocol for the preparation and characterization of lipophilic doxorubicin pro-drug loaded 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG) micelles is described.

Herstellung und Charakterisierung von Lipophile Doxorubicin Pro-drug Mizellen

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Synthese von kationisiertem Magnetoferritin für ultraschnelle Magnetisierungs von Zellen

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Synthese von Hydrogelen mit Antifouling-Eigenschaften als Membranen für die Wasserreinigung

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m resolution, show great potential in various fields of nanotechnology such as the molecular reactors, drug delivery, and nanoplasmonic systems. The reconfigurable DNA accordion rack, which can collectively manipulate a 2D or 3D nanoscale network of elements, in multiple stages in response to the DNA inputs, is described. The platform has potential to increase the number of elements that DNA nanomachines can control from a few elements to a network scale with multiple stages of reconfiguration.
In this protocol, we describe the entire experimental process of the reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes. The protocol includes a design rule and simulation procedure of the structures and a wet-lab experiment for synthesis and reconfiguration. In addition, analysis of the structure using TEM (transmission electron microscopy) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is included in the protocol. The novel design and simulation methods covered in this protocol will assist researchers to use the DNA accordion rack for further applications.

We describe the detailed protocol for design, simulation, wet-lab experiments, and analysis for a reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes.

Design und Synthese eines rekonfigurierbaren DNA-Akkordeon-Racks

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

Synthese von Nahinfrarot emittierenden Gold-Nanoclustern für biologische Anwendungen

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...