Name: synthesis of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles for imaging of atherosclerosis
Uploaded: 2017-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
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Die Autoren möchten die finanzielle Unterstützung von der University of Southern California, das National Heart, Lung, und Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli Edythe breiten Innovationspreis und l.k. Whittier Stiftung Non-Krebs zu erkennen Translational Research Award, EJC gewährt. Die Autoren danken Zentrum für Elektronenmikroskopie und Mikroanalyse, Center of Excellence in NanoBiophysics, Kompetenzzentrum für molekulare Charakterisierung und translationale Imaging Center der University of Southern California für die Unterstützung bei Instrumental-Setups.

Hinweis: Lesen Sie das MSDS für Reagenzien und befolgen Sie alle chemischen Sicherheitsmaßnahmen gemäß lokalen Institution.
1. Vorbereitung des MCP-1 PAMs
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Vorbereitung von MCP-1-Peptid
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<li>Wiegen Sie 0,25 Mmol Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang in einem Reaktionsgefäß (RV). Spülen Sie die Seite des RV mit 5 mL Dimethylforamide (DMF) in einem chemischen Abzug.</li>
		<li>Laden Sie die RV auf eine automatisierte Benchtop-Peptid-Synthesizer. Last abgepackte Aminosäure Ampullen, N "- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C", aus dem C, N-Terminus. Enthalten Sie eine Leere Phiole am Ende für den endgültigen Deprotection Schritt. Hinweis: Eine verschlüsselte Peptid mit Sequenz, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', kann auch synthetisiert werden über das gleiche Protokoll.</li>
		<li>Sobald Synthese abgeschlossen ist, übertragen Sie die Peptide auf Harz von der RV auf das Funkeln Fläschchen mit ca. 2-3 mL Methanol bis alle Harze übertragen werden. Nachdem das Harz auf den Boden gesunken ist, entfernen Sie überstand das Methanol zu und verdunsten Sie, die restlichen bis trocken. Vakuum für weitere 2 h oder über Nacht bei Raumtemperatur trocken.</li>
		<li>12 mL Dekolleté-Lösung mit Trifluoracetic Säure (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 Vol % in einem chemischen Abzug zu machen. Schwenken Sie die Dekolleté-Lösung, um sicherzustellen, dass alles gleichmäßig vermischt ist. Achtung: Da Triisopropylsilane und Ethanedithiol luftempfindlichen, Argon purge Lager Fläschchen mit Triisopropylsilane und Ethanedithiol für 1 min vor dem Ablegen wieder.</li>
		<li>Stellen Sie die Synthese Gefäß (SV) auf einem Arm-Shaker durch Spannen der unteren Hälfte des SV. Übertragen Sie Peptid-Harz auf die SV mit 2 mL Dekolleté-Lösung, bis alle der Peptid-Harze übertragen werden.</li>
		<li>Waschen Sie die Seiten des SV mit 3 mL Dekolleté-Lösung. Schließen Sie den Deckel des SV und schütteln bei 300 Schwingungen/min für 4 h.</li>
		<li>Eine leere 50 mL Zentrifugenröhrchen abwiegen. Notieren Sie die Masse.</li>
		<li>Entleeren Sie nach 4 h die gespalten Peptidlösung vom SV in der 50 mL Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die SV mehrmals mit der restlichen Dekolleté-Lösung.</li>
		<li>Verdunsten Sie gespalten Peptidlösung mit Stickstoff bis gibt es weniger als 4 mL in die Zentrifugenröhrchen bleiben.</li>
		<li>36 mL eiskaltes Äther der Peptid gespalten Projektmappe hinzufügen.</li>
		<li>Vortex ist die Lösung bis es komplett weiß oder gelb. Zentrifugieren bei 3.000 x g für 5 min bei 4 ° C, und den Überstand abgießen.</li>
		<li>Der Tube 40 mL eiskaltes Äther hinzufügen. Wirbel und beschallen wieder. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Den Überstand abgießen.</li>
		<li>Trocknen Sie das rohe PA-Pellet mit Stickstoff Gas spülen, bis der Äther sichtbar verdunstet ist.</li>
		<li>Geben Sie 20 mL bidestilliertem Wasser, Wirbel und beschallen bis das Peptid in Lösung vollständig gelöst ist.</li>
		<li>Frieren die Lösung und lyophilize trocknen.</li>
		<li>Sobald das Peptid getrocknet ist, wiegen Sie die Masse der Zentrifugenröhrchen, das rohe-Peptid enthält. Das rohe Peptid in 5 mg/mL Wasser auflösen.</li>
		<li>25 mg von Rohöl MCP-1-Peptid in 5 mL bidestilliertem Wasser eine totale Konzentration von 5 mg/mL zu lösen. Reinigen Sie das rohe MCP-1-Peptid durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit 0,1 % TFA in Wasser (Lösungsmittel A) und 0,1 % TFA in Acetonitril (Lösungsmittel B) als mobilen Phasen auf einer C8-Reverse-Phase-Spalte. Injizieren Sie die 5 mL des Peptids in der HPLC. Hinweis: Die erste mobile Phase bestand aus 100 % Lösungsmittel A bei einer Durchflussrate von 9,0 mL/min Lösungsmittel A langsam auf 30 % in 27 min zu verringern und halten Sie in dieser Zusammensetzung für 3 min. Rückkehr der Gradient zu 100 % Lösungsmittel eine über 3 min und halten an dieser Komposition für 1 min zu geben eine Gesamtlaufzeit von 34 min. halten die Spalte Temperatur bei 55 ° C. Verwenden Sie positive Ionen Quellmodus für die Analyse. Ameisensäure kann anstelle von TFA, verwendet werden, wenn TFS zu sauer für die HPLC-Säule. Es wird empfohlen, die organische Lösungsmittel Zusammensetzung Rampe Geschwindigkeit 2%/min für bessere Trennung nicht überschreiten sollte.</li>
		<li>Jede Fraktion mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI) Massenspektrometrie für das erwartete Produkt m/Z bei 2.890 zu analysieren. Hinweis: Lösen Sie α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure bei 1 mg/mL in Acetonitril/Wasser (50: 50 Vol-% auf) als die Matrixlösung. Vor Ort 0,75 µL Matrixlösung auf den MALDI-Teller, gefolgt von 0,75 µL der einzelnen Fraktionen. Führen Sie die Analyse mit einem positiven reflektierende Ionen-Modus im Massenbereich von 500-5.000 Da.</li>
		<li>Kombinieren Sie Produkt Brüche, Abblasen Acetonitril, Einfrieren und lyophilize gereinigte Peptide bis trocken.</li>
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Vorbereitung von MCP-1 PA
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<li>Bereiten Sie ein 1.1 molaren Überschuss von 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[Amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000) Maleimide Peptid in separaten funkeln Fläschchen. Lösen Sie beide Verbindungen in bidestilliertem Wasser machen ~ 15 mg/mL. Beschallen Sie für 15 Minuten oder bis beide Lösungen völlig klar sind. Hinweis: DSPE-PEG (2000)-Cy5 synthetisiert unter Verwendung des gleichen Protokolls mit DSPE-PEG (2000)-Amin und N-Hydroxysuccinimide (NHS) Ester funktionalisiert Cy5, mit Ausnahme von Schritt 1.2.3, wo der pH-Wert der Lösung bis 8,5 eingestellt wird.</li>
		<li>Die Peptidlösung DSPE-PEG (2000)-Maleimide-Lösung hinzufügen. Wirbel und beschallen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 M NaOH tropfenweise (1 µL) nacheinander, bis der pH-Wert der Lösung 7 beträgt.</li>
		<li>Stickstoff-Aufräum-Lösung für 5 min. Rühren Sie die Lösung über Nacht.</li>
		<li>Frieren die Lösung und lyophilize trocknen.</li>
		<li>Sobald das Rohprodukt getrocknet ist, lösen Sie den Feststoff in 5 mg/mL Wasser auf.</li>
		<li>Reinigen Sie mit HPLC, wie oben beschrieben. Hinweis: Unconjugated Peptid und DSPE-PEG(2000) sollte zwischen 15-30 % organische Konzentration (Vol%), während DSPE-PEG eluieren (2000)-MCP-1-Konjugat sollte zwischen 40-50 % Bio Konzentration eluieren.</li>
		<li>Analysieren Sie jede Fraktion mittels MALDI Massenspektrometrie für die entsprechenden m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1 eine breite m/Z-Spitze bei 5.760 haben sollte. Hinweis: 2,5-Dihydroxybenzoic Acid wird am besten als Matrix für DSPE-PEG (2000)-MCP-1 mit MALDI verwendet.</li>
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Montage von MCP-1 PAMs
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<li>Auflösen von 1,75 mg MCP-1 PAs mit 3 mL Methanol in einem 1-Dram-Fläschchen. Beschallen Sie bis die MCP-1 PA vollständig gelöst ist. Hinweis: Cy5 amphiphilen können in einem molaren Verhältnis von 10: 90 MCP-1 PA für imaging-Anwendungen integriert werden.</li>
		<li>Verdampfen Sie das Methanol unter Stickstoff in einer kreisförmigen Bewegung während der Seite des Röhrchens das restliche Methanol abspülen, bis ein gleichmäßiger Film an der Unterseite der Flasche entsteht. Vakuum-trockenen Film über Nacht.</li>
		<li>Den Film mit 3 mL Wasser oder Phosphat-Puffer-Hydrat Kochsalzlösung (PBS), eine 100 µM-Lösung von MCP-1 PAMs zu machen. Sanft Wirbel und beschallen die Lösung bis frei. Bei 80 ° C für 30 min inkubieren. Hinweis: Die erhöhte Temperatur hat gezeigt, dass die Selbstmontage Prozess beschleunigen und ermöglicht es der Peptid-Komponente, die stabilste Sekundärstruktur zu bilden, während die Senkung der kritischen Micelle Konzentration (CMC)42,43.</li>
		<li>Die resultierende Dispersion auf Raumtemperatur abkühlen.</li>
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</ol>2. Charakterisierung von MCP-1 PAMs
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Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zetapotenzial
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<li>Platz 100 µM von MCP-1 PAM oder Rührei PAM in eine Küvette gemäß den Anweisungen des DLS oder Zeta potential Instruments. Hinweis: DLS und Zeta potential Küvetten können unterschiedlich sein auf der Grundlage des Instruments Anweisungen.</li>
		<li>Equilibrate das Instrument auf Raumtemperatur. Messen Sie die Größe und die Oberflächenladung der PAM.</li>
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</li>
	<li>
Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)
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<li>Fügen Sie 7 µL von 50 µM MCP-1 PAM oder Rührei PAM auf ein TEM-Raster ausgesetzt in eine selbstschließende Pinzette für 5 min. Docht das Tröpfchen mit einem heiklen Aufgabe abwischen.</li>
		<li>Fügen Sie 7 µL Wasser um das Raster zu waschen. Docht entfernt das Droplet.</li>
		<li>Fügen Sie 7 µL 1 wt % Phosphotungstic Acid für 2 min. Docht entfernt das Droplet. Wiederholen Sie Schritt 2.2.2.</li>
		<li>Trocknen Sie die TEM-Raster vor TEM Analyse.</li>
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Kreisförmigen Dichroismus (CD) Spektroskopie
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<li>Schalten Sie den Stickstoff für 5-10 min vor dem Gebrauch des Gerätes.</li>
		<li>Küvette 300 µL des Rohlings (Wasser oder PBS) entgegenbringen.</li>
		<li>Spektren bei 190-265 nm, 0,2 mm-Länge mit einem 1 s Integrationszeit und 1 nm Bandbreite bei Raumtemperatur zu messen. Sammeln Sie 3 Wiederholungen.</li>
		<li>Maßnahme 100 µM-MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, kletterte Peptid und Rührei PAM unter den gleichen Bedingungen im Schritt 2.3.3 beschrieben. Subtrahieren Sie vom Rohling.</li>
		<li>Passen Sie die Daten über eine lineare Interpolation von Polylysin Grundlage Spektren.</li>
		<li>Schalten Sie das Gerät. Warten Sie 10 Minuten vor dem Ausschalten des Stickstoffs.</li>
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</li>
</ol>3. in-vitro- Analyse der MCP-1 PAMs
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In-vitro- Biokompatibilität
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<li>Kultur und erweitern WEHI 274,1 murine Monozyten in Dulbeccos geändert Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol in 37 ° C weniger als 5 % CO2 , Abschnitt 5. Hinweis: WEHI 274,1 sind Aussetzung Zellen. Bei der Kultivierung, sollten die Medien alle 2-3 Tage wieder aufgefüllt.</li>
		<li>Pipettieren Monozyten in den Medien in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Die alten Medien Aspirieren und in 10 mL frische Medien in die Zentrifugenröhrchen Aufschwemmen. Mischen, langsam, bis die Zellen in den Medien gleichmäßig verteilt sind. Zählen der Zellen verwenden Trypan blau Färbung und eine Hemocytometer.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Zellen so, dass es 4.000 Monozyten pro 90 µL Medien pro Bohrloch. Fügen Sie 90 µL Zellen in Brunnen eine 96-Well-Platte. 24 h inkubieren. Hinweis: Vermeiden Sie die Verwendung der Brunnen auf der Außenkante der Platte, um Unterschiede bei der Verdunstung und thermische Veränderungen in der Platte zu vermeiden. Füllen Sie die äußere Vertiefungen mit 100 µL PBS.</li>
		<li>0,15 µmol MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, Rührei Peptid oder Rührei-PAM in 150 µL PBS in separaten, sterilisierte Mikrozentrifugenröhrchen auflösen. Führen Sie serielle Verdünnung um 65 µL 1, 10 und 100 µM jeder Probe zu machen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL PBS für jede Konzentration in Brunnen mit WEHI 274,1 (Gesamtvolumen: 100 µL pro gut, 6 Zeilen, insgesamt 96 Wells). 72 h inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) in jede Vertiefung. 1 h inkubieren.</li>
		<li>Analysieren Sie die Absorption mit einem Teller Reader auf 490 nm oder basierend auf den Anweisungen des Herstellers.</li>
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</li>
	<li>
In-vitro- Micelle Bindung
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<li>Samen 500.000 Monozyten in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in 2 mL Medium mit 100 µM Cy5-Label MCP-1 PAM (10: 90 Molverhältnis von DSPE-PEG (2000)-Cy5 und MCP-1 PA). 1 h inkubieren.</li>
		<li>Sammeln Sie WEHI 274,1 durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die Medien.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie und waschen Sie die Zellen in 2 mL PBS. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 2 mL PBS. Aspirieren Sie die PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 2 mL kalten 4 % Paraformaldehyd, die Zellen zu beheben. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Pipettieren der fixen Zellen auf einem sterilen Glas Deckgläschen in Brunnen von einem 6-Well-Platte. 400 X g für 5 min zentrifugieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die Paraformaldehyd. Waschen und Spülen mit 2 mL PBS einmal. Mit 1 mL PB Aufschwemmen Hinweis: Beim Spülen, nicht zu stören die Zellen auf das Deckglas.</li>
		<li>Setzen Sie 10 µL von 90 % Glycerin mit PBS-Puffer auf eine Folie. Benutzen Sie eine Nadel und Pinzette um zu holen das Deckglas. Trocknen Sie den Rand des Deckglases. Legen Sie vorsichtig das Deckglas auf einer Folie verdeckt.</li>
		<li>Versiegeln Sie vorsichtig den Rand des Deckglases mit klaren Nagellack. Legen Sie in den Kühlschrank bis bereit für die Bildgebung.</li>
		<li>Verwenden einen konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) installiert mit Lasern für Cy5 bei λErregung = 650 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

MCP-1 PAMs sind eine vielversprechende molekulare Bildgebung-Plattform, bestehend aus einer hydrophilen targeting Peptid und hydrophobe Endstück, das treibt die selbstgebaute Natur der Nanopartikel. Diese Monocyte-targeting Micelle kann durch einfache Synthese und Reinigungsschritte der MCP-1-Peptid und DSPE-PEG (2000)-MCP-1 hergestellt werden. PAMs haben viele vorteilhafte Eigenschaften für molekulare Bildgebung in Vivo wie ihre Selbstmontage unter milden Bedingungen, intrinsische biologische Abbaubarkeit und...

Herz-Kreislauf-Krankheiten bleiben die führenden Todesursachen weltweit mit etwa 17,3 Millionen Todesfälle weltweit1. Herz-Kreislauf-Krankheiten sind durch Arteriosklerose, eine Bedingung trugen in denen Plaques in den Arterien, dadurch hemmende Blut- und Sauerstoffzufuhr zu den Zellen des Körpers2,3bauen. Die Progression der Atherosklerose beinhaltet die Verdickung und Verhärtung der Arterien durch eine entzündliche Reaktion, unregelmäßige Fettstoffwechsel und Plaquebildung, führt zu Plaque Ruptur und Myokardinfarkt4,5. Endothelzellen express Zytokine und Adhäsion Moleküle, die MCP-1, die an den C-C Chemokin-Rezeptor (CCR2 enthalten) auf der Oberfläche der Monozyten6,7,8bindet. Oxidiertes Cholesterin wandelt Monozyten zu Makrophagen in der frühen Phase der Plaquebildung, die verstärkt der entzündlichen Reaktion in der Region und führt zu Gewebeschäden und die Bildung von Plaques instabil oder gefährdeten9, 10.
Traditionell wird Arteriosklerose durch die Beurteilung der luminalen Stenose durch anatomische Bildgebung mit Ultraschall oder Angiographie11,12ausgewertet. Diese Methoden können aber nur feststellen starke Verengung der Arterienwand und nicht die frühen Stadium der Arteriosklerose, wie erste Gedenktafel Wachstum führt zu arteriellen Umbau um Arterie Größe beizubehalten und blood Flow Rate12,13, 14. Daher underrepresent Angiogramme Atherosklerose Prävalenz. Darüber hinaus nicht-invasive bildgebende Verfahren wie single Photonenemission berechnet Tomographie, Positronen-Emissions-Tomographie und Magnetresonanz-Bildgebung vor kurzem wurden verwendet, um Plaque-Morphologie zu charakterisieren, da sie erste Details bieten können und Charakterisierung von Plaques. Aber diese Modalitäten sind oft begrenzt durch den Mangel an Sensibilität, räumliche Auflösung, oder erfordern die Verwendung von ionisierender Strahlung, machen bildgebende Plaque Fortschreiten in den verschiedenen Phasen viel mehr herausfordernde15,16, 17. Ein bildgebendes System der Lieferung, das speziell Plaques in den verschiedenen Phasen der Atherosklerose identifizieren würde bleibt entwickelt werden.
Nanopartikel haben eine neue Plattform für in Vivo Plaque-targeting und Diagnostik18,19,20,21gezeigt. Insbesondere sind PAMs vorteilhaft aufgrund ihrer chemischen Vielfalt und die Fähigkeit, eine Vielzahl von Moieties, Kompositionen, Größen, Formen und Oberflächen Funktionalisierung22unterbringen. Peptid amphiphilen (PAs) bestehen aus einem hydrophilen, Peptid "Headgroup" befestigt eine hydrophobe Schwanz, die in der Regel sind Lipide; Diese amphiphile Struktur verleiht selbstorganisierende Funktionen und ermöglicht eine multivalente Anzeige der Peptide auf der Oberfläche der Partikel22,23,24. Die Peptid-Headgroups beeinflussen die Kornform durch Falt- und Wasserstoffbindung zwischen Peptide25. Peptide, die durch die Interaktion der β-Blatt Falten haben gezeigt, dass längliche Micellen zu bilden, während α-helikale Bestätigung sowohl sphärische und längliche Micellen22,23,24, bilden kann 25,26,27. Polyethylenglykol (PEG) linker, die Oberflächenladung des Peptids schützen können zwischen der hydrophilen Peptid und das hydrophobe Ende der PAMs, Verbesserung der Verfügbarkeit der Nanopartikel im Körperkreislauf28, platziert werden 29 , 30 , 31. PAMs sind auch vorteilhaft, weil sie biokompatibel sind und gezeigt haben, dass ein breites Spektrum von Anwendungen32,33. Die Wasserlöslichkeit von Micellen bietet einen Vorteil gegenüber anderen Nanopartikel-basierten Systemen wie z. B. bestimmte Polymere Nanopartikel, die nicht in Wasser löslich und in Lösungsvermittler für Injektionen34ausgesetzt werden. Darüber hinaus macht die Fähigkeit zum Erstellen von PAMs, das Zerlegen in Reaktion auf bestimmte Reize PAMs einen attraktive Kandidaten für kontrollierte intrazellulären Droge Lieferung35.
Durch Bindung an den Rezeptor CCR2 und akkumulieren in den Aortenbogen, wurden zuvor PAMs für Monocyte gezielt zur Überwachung der verschiedener Phasen von atherosklerotischen Läsionen in der Aorta9entwickelt. ApoE- / - Mäusen Monocyte Ansammlung steigt proportional zu Plaque Fortschreiten36. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Patienten mit Ruptur neigende, Spätstadium Plaques höhere Mengen an Monozyten37 enthalten. Daher ist die Änderung der PAMs, MCP-1 einzubeziehen nützlich, denn es größere targeting Spezifität und Differenzierung zwischen frühen und späten Stadium atherosklerotische Läsionen ermöglicht. Diese Proof-of-Concept-Studien überprüft auch, ob PAMs sind sicher genug vorklinisch verwendet werden und renally38deaktiviert sind. Da Monozyten und Entzündungen charakteristisch für andere Krankheiten sind, haben MCP-1 PAMs das Potenzial, für therapeutische und diagnostische Anwendungen in anderen Krankheiten über Arteriosklerose8,39,40 verwendet werden , 41.
Hier berichten wir über die Herstellung von hoch skalierbare und selbst-zusammengebauten MCP-1 PAMs, die optimale Größe, Oberflächenladung und gezielte Ausrichtung auf Monozyten für erweiterte imaging-Anwendungen in Atherosklerose des Teilchens nachgewiesen.

<table><tbody><tr><td>1,2-ethanedithiol</td><td>VWR</td><td>E0032</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>10 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes, polypropylene</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165200050</td><td>for MALDI</td></tr><tr><td>25 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>5 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>75 cm2 culture flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>75 mL reaction vessel</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>96-wells cell culture plate</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td>for MTS assay</td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Borosilicate glass, 1 dram</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>for PAM synthesis</td></tr><tr><td>Borosillicate glass pipet, Long tips</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Cy5 amine</td><td>Abcam</td><td>ab146463</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>Diethyl ether, ACS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>for peptide precipitation</td></tr><tr><td>Disposable syringes, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Double neubauer ruled hemocytometer</td><td>VWR</td><td>63510-13</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) amine</td><td>Avanti</td><td>880128P</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) maleimide</td><td>Avanti</td><td>880126P</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000)-NHS ester&amp;nbsp;</td><td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td><td>for conjugation to Cy5</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium-high glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438026</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-A</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-RBF</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-NT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-CT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-QT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-I</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-L</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-KBC</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-F</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-SB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-TB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-YB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-V</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh</td><td>Novabiochem</td><td>856013</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Formic acid, optima LC/MS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Hand tally counter</td><td>Fisher Scientific</td><td>S90189</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Magnetic stir bars, egg-shaped</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>Methanol, ACS certified</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>for PAM synthesis</td></tr><tr><td>MTS cell proliferation colorimetric assay kit</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>for MTS assay</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide, sequencing grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine</td><td>Protein Technologies</td><td>S-1L-NMM</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416780250</td><td>for fixing cells</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Peptide synthesis vessel, 25 mL&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>CG186011</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Phosphotungstic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A248-25</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Spectrum</td><td>P1146-2.5LTGL</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Plain glass microscope slide 75 x 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Reagent reservoirs, sterile&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>95128093</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Self-closing tweezer</td><td>TedPella</td><td>515</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>TEM support film</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP618-500</td><td>for peptide cleavage and HPLC purification</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5ml</td><td>for peptide cleavage</td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0.4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Tweezer, general purpose-serrated</td><td>VWR</td><td>231-SA-SE</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;CRL-1679</td><td>murine monocyte</td></tr><tr><td>automated benchtop peptide synthesizer</td><td>Protein Technologies</td><td></td><td>PS3 Benchtop Peptide Synthesizer</td></tr><tr><td>&amp;alpha;- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>476870-2G</td><td>for MALDI</td></tr></tbody></table>

synthesis of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles for imaging of atherosclerosis

Atherosklerose ist ein wesentlicher Faktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, die häufigste Todesursache weltweit, der jährlich 17,3 Millionen Todesopfer fordert. Atherosklerose ist auch die häufigste Ursache des plötzlichen Tod und Myokardinfarkt, angestiftet von instabilen Plaques, die platzen und verdecken das Blutgefäß ohne Vorwarnung. Aktuelle bildgebende Modalitäten kann nicht unterscheiden zwischen stabilen und instabilen Plaques, die platzen. Peptid amphiphilen Micellen (PAMs) können diesen Nachteil überwinden, wie sie können, mit einer Vielzahl geändert werden von targeting Moieties, die speziell auf erkranktes Gewebe zu binden. Monozyten haben gezeigt, zu frühe Marker für Arteriosklerose, während große Ansammlung von Monozyten Plaques anfällig für Bruch zugeordnet ist. Daher können Nanopartikel, die Monozyten abzielen kann verwendet werden, verschiedene Stadien der Arteriosklerose zu unterscheiden. Zu diesem Zweck hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vorbereitung des Monocyte-targeting PAMs (Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sind selbst zusammengebaut durch Synthese unter milden Bedingungen, Form Nanopartikel von 15 nm im Durchmesser mit in der Nähe von neutralen Oberflächenladung. In Vitro, PAMs erwiesen sich biokompatible und hatte eine hohe Bindungsaffinität für Monozyten. Die hier beschriebenen Methoden zeigen, Versprechen für ein breites Anwendungsspektrum in Atherosklerose sowie anderen entzündlichen Erkrankungen.

Vorbereitung von MCP-1 PAM Das CCR2-Bindung-Motiv (Rückstände 13-35) der MCP-1 Protein [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] oder Rührei Peptid [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] wurde modifiziert, indem ein Cystein-Reste auf dem N-Terminus. Das MCP-1-Peptid wurde durch eine Fmoc-vermittelten Festphasen-Methode unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthesizers synthetisiert. Das rohe-Peptid wurde gereinigt, durch Reverse-Phase-HPLC auf eine Spalte C8 bei 50 ° C mit 0,1 % TFA in...

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Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Dieses Papier stellt eine Methode, mit der Synthese und Charakterisierung von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen und den entsprechenden assays für Biokompatibilität und Fähigkeit der Micelle binden an Monozyten zu testen.

Synthese von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen für die Bildgebung der Atherosklerose

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K Aufrufe.  University of Southern California. Dieses Papier stellt eine Methode, mit der Synthese und Charakterisierung von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen und den entsprechenden assays für Biokompatibilität und Fähigkeit der Micelle binden an Monozyten zu testen.

Serie: Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.

An example of a nano drug based on polymalic acid is presented towards the rational design of personalized medicine that is applicable to cancer. It describes the synthesis of a nano drug to treat Her2-positive human breast cancer in a nude mouse.

Polyäpfelsäure-basierten Nano Biopolymere für Targeting mehrerer Tumormarker: Eine Chance für die personalisierte Medizin?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

Forschung

Chemie

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Biochemie

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR Molekulare Bildgebung von Prostatakrebs mit einem kleinen Molecular Targeted CLT1 Peptid-Kontrastmittel

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Medizin

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting self-assembled supramolecular structures. The synthetic route takes advantage of solid-phase peptide synthesis with the on-resin coupling of the dithiolane precursor molecule, 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl)propanoic acid, and the microwave-assisted thioacetate deprotection of the peptide N-terminus before final cleavage from the resin to yield the 1,2-dithiolane modified peptide. After the high-performance liquid chromatography (HPLC) purification of the 1,2-dithiolane peptide, derived from the nucleating core of the A&#946; peptide associated with Alzheimer&#39;s disease, the peptide is shown to self-assemble into cross-&#946; amyloid fibers. Protocols to characterize the amyloid fibers by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), circular dichroism spectroscopy (CD) and transmission electron microscopy (TEM) are presented. The methods of N-terminal modification with a 1,2-dithiolane moiety to well-characterized self-assembling peptides can now be explored as model systems to develop post-assembly modification strategies and explore dynamic covalent chemistry on supramolecular peptide nanofiber surfaces.

A protocol for the synthesis of a 1,2-dithiolane modified peptide and the characterization of the supramolecular structures resulting from the peptide self-assembly.

Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Vorbereitung und photoakustische Analyse von Zell Fahrzeuge, die Gold-Nanostäbchen

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Biotechnik

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Mikrowelle gesteuerte Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für die schnelle Erkennung von Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

Erstbewertung der Antikörper-Konjugate mit Viral-abgeleitete Peptide zur Erhöhung der zellulären Akkumulation und Verbesserung der Tumor gezielt modifiziert

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

Synthese von funktionalisierten 10 nm Polymer beschichteten Goldpartikeln für Targeting Endothel und Drug-Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Immunologie und Infektion

Preparation and Characterization of Targeted Microbubbles

Targeting of microbubbles (ultrasound contrast agents for molecular imaging) has been researched for more than two decades. However, methods of microbubble preparation and targeting ligand attachment are cumbersome, complicated, and lengthy. Therefore, there is a need to simplify the targeted microbubble preparation procedure to bring it closer to clinical translation. The purpose of this publication is to provide a detailed description and explanation of the steps necessary for targeted microbubble preparation, functional characterization and testing. A sequence of the optimized and simplified procedures is presented for two systems: a biotin-streptavidin targeting pair model, and a cyclic RGD peptide targeting the recombinant &#945;v&#946;3 protein, which is overexpressed on the endothelial lining of the tumor neovasculature.
Here, we show the following: covalent coupling of the targeting ligand to a lipid anchor, assessment of the reagent quality, and tests that confirm the successful completion of the reaction; preparation of the aqueous precursor medium containing microbubble shell components, followed by microbubble preparation via amalgamation; assessment of the efficacy of lipid transfer onto the microbubble stabilizer shell; adjustment of microbubble size distribution by flotation at normal gravity to remove larger microbubbles that might be detrimental for in vivo use; assessment of microbubble size distribution by electrozone sensing; evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a static binding assay test (in an inverted dish); and evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a parallel plate flow chamber test.

<meta charset="utf8"></head><body>Herstellung und Charakterisierung von gezielten Mikrobläschen

The goal of this protocol is to prepare, purify and characterize gas-filled microbubbles (targeted contrast agents for ultrasound molecular imaging). Two targeting systems are described: biotinylated bubbles adherent to streptavidin, and cyclic RGD peptide microbubbles that bind to &#945;v&#946;3, a known tumor neovasculature biomarker.