Der Autor bedankt sich bei Annette Blak Rasmussen und Kristine Moeller für ihre technische Unterstützung

Die Sammlung von Hautproben von gesunden Erwachsenen Probanden einer plastischen Operation erfordert Genehmigung durch die Ethik-Kommission in den Einrichtungen. Dieses Protokoll wurde von der regionalen ethischen Ausschuss der Region Midtjylland, Dänemark (M-20110027) genehmigt. Die hier beschriebene Methode leitet sich von ähnlichen Studien von Maciaq Et al. 10 und Liu und Karasek11.
1. Isolation von Keratinozyten aus der menschlichen Haut
<ol>
	<li>Beginnen, indem Sie die folgenden Lösungen: 50 mL Lösung von 0,25 % Trypsin und 0,1 % Glukose in DPBS. Mischung und Filter zu sterilisieren (0,2 µm) die Lösung. 10 mL RPMI-1640 + 2 % FBS Lösung, 50 mL des DPBS und Keratinozyten serumfreien Medium (KSFM) vorzubereiten. 500 mL KSFM KSFM Ergänzungen und 250 µL Gentamycin hinzufügen. Vorwärmen der Lösungen auf 37 ° C vor dem Gebrauch.</li>
	<li>Haut von gesunden Erwachsenen Probanden einer plastischen Operation zu sammeln. Die Hautproben verwendet sind ca. 10 cm x 15 cm, aber können in der Größe variieren. Halten Sie die Haut kühl unter Transport durch den Transport der Hautproben in einer Styropor-Box mit einem Kühlelement. Bei Bedarf kann die Hautprobe über Nacht bei 4 ° C gespeichert werden.</li>
	<li>Entfernen Sie Fett unter der Haut-Sektion mit sterilisierten Scheren, Skalpelle und Pinzetten.</li>
	<li>Schnalle aus Abschnitt Haut (ca. 10 cm x 15 cm) auf eine sterile Abdeckung oben auf einen Teller mit Nadeln. Zuerst reinigen Sie die Haut mit einem trockenen steriler Gaze-Pad. Dann reinigen Sie die Haut mit einem sterilen Tupfer mit 70 % Ethanol.</li>
	<li>Mit einem Fuß-Hobel, der obersten Hautschicht (Epidermis) des Abschnitts Haut schneiden Sie und legen Sie es in einem 9 cm Petrischale. Fügen Sie dann sofort 25 mL der DPBS/Trypsin/Glucose-Lösung (vorbereitet in Schritt 1.1) in der Petrischale. 30 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Mit einer Pipette entfernen Sie die DPBS/Trypsin/Glukose-Lösung aus der Petrischale und 10 mL RPMI-1640 + 2 % FBS, die Trypsin zu inaktivieren.</li>
	<li>Mit zwei Pinzetten, lassen Sie jetzt die Epidermiszellen in das Medium durch sanft kratzen und rühren die epidermalen und dermalen Abteil des die Hautpartien.</li>
	<li>Filtern der epidermalen Zellsuspension durch einen Metallfilter (1 mm Lochgröße), und sammeln Sie in einem 50 mL-Tube. Hinzu kommt der übrigen Haut eine 50 mL-Tube mit 10 mL RPMI-1640 ohne FBS und Vortex für 10 S. Filter filtern die Aussetzung durch das Metall in ein 50 mL-Tube mit der epidermalen Zellsuspension. Einem Gesamtvolumen von 50 mL DPBS hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zellsuspension für 10 min bei 450 X g bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der epidermalen Zelle Pellet in ca. 10 mL von 37 ° C KSFM abhängig von der Größe des Pellet-Zelle. Zählen Sie die Zellen mit dem Trypan blau Färbung Methode unter Mikroskop. Die Anzahl der Zellen aus einen 10 x 15 cm-Haut-Abschnitt ist ca. 50-100 x 106 Zellen. Übertragen Sie an jedem 75 cm2 Kultur Kolben, 8 x 106 Zellen zusammen mit 12 mL von 37 ° C KSFM. Schütteln Sie die Kulturflaschen um gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Keratinozyten in einem Inkubator 37 ° C mit 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2. Ändern Sie das Medium nach 2 Tagen und dreimal wöchentlich. Durchgang-Zellen, wenn die Kultur Zusammenfluss von 70-80 %, was ungefähr 2 Wochen je nach die Proliferationsrate der Keratinozyten dauert.</li>
</ol>
(2) Passagierung der Keratinozyten
<ol>
	<li>Erhitzen Sie die entsprechende Menge an Trypsin-EDTA-Lösung 0,05 % auf 37 ° C im Brutschrank. Verwenden Sie 4,5 mL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung für eine 75 cm2 Kultur Kolben.</li>
	<li>Entfernen Sie Mittel aus den Zellen zu, und fügen Sie 4,5 mL/75 cm2 Kultur Flasche 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen vorgewärmt. Legen Sie den Kultur-Kolben in den Inkubator (37 ° C) und nach ca. 5 min unter dem Mikroskop zu prüfen Sie, ob die Zellen lösen gestartet haben.</li>
	<li>Bei etwa 50 % der Zellen gelockert haben, schlagen Sie sanft den Kultur-Kolben gegen die Hand, die restlichen Zellen zu lösen. Fügen Sie dann um die Trypsin zu inaktivieren, 6 mL RPMI-1640 + 2 % FBS (37 ° C) in den 75 cm2 Kultur Kolben und übertragen Sie die Zellsuspension auf 50 mL Röhrchen.</li>
	<li>Spülen Sie die Kulturflaschen mit 3 mL RPMI 1640 + 2 % FBS und Hinzufügen der 50 mL-Tuben. Zentrifugieren Sie Zellen für 10 min bei 450 X g bei Raumtemperatur.
	<ol>
		<li>Aufschwemmen der gebeizte Zellen in 10 mL KSFM (37 ° C). Zählen der Zellen und 3 x 106 Zellen auf ein 150 cm2 Kultur Fläschchen mit 20 mL KSFM (37 ° C) übertragen. Schütteln Sie den Kultur-Kolben um gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Einfrieren der Zellen, wenn die Kultur ist 80-90 % konfluierende, die dauert ca. 4-6 Tage je nach die Proliferationsrate der Keratinozyten (siehe Abschnitt 3, Einfrieren Protokoll unten). Erweitern Sie die Keratinozyten um entsprechende gefrorenen Vorräte zu generieren.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
(3) Einfrieren von Keratinozyten
<ol>
	<li>Erhitzen Sie die entsprechende Menge an Trypsin-EDTA-Lösung 0,05 % auf 37 ° C im Brutschrank. Verwenden Sie 9 mL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung für ein 150 cm2 Kultur Kolben.</li>
	<li>Entfernen Sie Mittel aus den Zellen zu, und fügen Sie 9 mL/150 cm2 Kultur Flasche 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen vorgewärmt. Legen Sie den Kultur-Kolben in den Inkubator (37 ° C) und nach ca. 5 min unter dem Mikroskop zu prüfen Sie, ob die Zellen lösen gestartet haben.</li>
	<li>Bei etwa 50 % der Zellen gelockert haben, schlagen Sie sanft den Kultur-Kolben gegen die Hand um die verbleibenden Zellen zu lösen. Fügen Sie dann um die Trypsin zu inaktivieren, 12 mL RPMI-1640 + 2 % FBS (37 ° C) in den 150 cm2 Kultur Kolben und aspirieren der Zellsuspension auf 50 mL Röhrchen.</li>
	<li>Spülen Sie die Kulturflaschen mit 6 mL RPMI 1640 + 2 % FBS und Hinzufügen der 50 mL-Tuben. Zentrifugieren Sie die Rohre für 10 min bei 450 X g bei 4 ° C. Bereiten Sie eiskalte Zelle Medium (KSFM + 10 % DMSO) Einfrieren.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in KSFM + 10 % DMSO, zählen die Zellen und Zellen bei einer Dichte von 6 x 106 Zellen/mL mit standard langsam-Einfrieren Kryokonservierung Methoden12einfrieren.</li>
	<li>Die Keratinozyten in flüssigem Stickstoff (Dampfphase) erst unmittelbar vor Gebrauch zu speichern.</li>
</ol>
(4) Auftauen und Kultivierung gefrorenen Keratinozyten
<ol>
	<li>Tauen Sie schnell die entsprechenden gefrorenen Fläschchen in einem 37 ° C-Wasserbad. Verwenden Sie 70 % Ethanol, reinigen Sie die Außenseite der Cryoröhrchen. Die entsprechende Anzahl von Zellen (ca. 15.000 Zellen/cm2) auf einem Kultur-Kolben übertragen und sofort den Kultur-Kolben vorgewärmt Wachstumsmedium (KSFM) hinzufügen. Jede Größe von Kulturflaschen kann je nach Aufbau des Experiments verwendet werden.</li>
	<li>Verwenden Sie 5 mL Kulturmedium für eine 25 cm2 Kultur Kolben.</li></ol>Die Anzahl der Zellen hinzugefügt, dass die Kultur-Flasche variieren kann, da das Wachstum der Zellen vom Spender, Spender variiert. Inkubieren Sie Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
	<li>Änderung des Mediums nach 2 Tagen und dreimal Verwendung wöchentlich frisch vorgewärmte KSFM. Hinweis: Unsere Daten haben gezeigt, dass durchschnittlich 95 % der Zellen isoliert von dem hier beschriebenen Protokoll positiv für die Keratinozyten-Marker-Cytokeratine-14-13 sind.</li>

<ol>
	<li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation.">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li><li>Nickoloff, B. J., Turka, L. 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C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture.">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li><li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms.">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li><li>Watt, F. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment:+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases.">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li><li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment.">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li></ol>

. Der Autor hat keinen Interessenskonflikt.

Hier beschreiben wir, wie primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen Haut leicht zu isolieren und sie in-vitro-Kultur. Dieses Modell kann nützlich sein für Forscher, die Interesse an einem Studium Haut-Krankheiten kann haben eine breite Anwendung für die Untersuchung der epidermalen Zelle Biologie
Einige der Vorteile von dem hier beschriebenen Protokoll ist, dass im Gegensatz zu Keratinozyten isoliert von Neugeborenen Vorhaut erhalten von Neugeborenen männlichen Beschnei...

Die Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers und dient als eine schützende Barriere gegen die Außenwelt. Die Haut besteht aus zwei Schichten: die Dermis und Epidermis, wo die Epidermis die äußerste Schicht der Haut bildet. Die am häufigsten vorkommenden Zelltyp in der Epidermis ist die Keratinozyten, bestehend aus mehr als 95 % der Zelle Masse1,2. Die Keratinozyten werden in verschiedenen Stadien der Differenzierung in der Epidermis und gliedern sich in basalen, abstehenden, körnige und verhornten Schichten, die bestimmte Phasen der Differenzierung3entsprechen. Die primäre Funktion der Keratinozyten soll die strukturelle Integrität der Epidermis, wodurch eine intakte Barriere nach außen zur Verfügung zu stellen.
Die Keratinozyten auch die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger in der Haut darstellen und daher eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunantwort4,5. Exposition der Keratinozyten auf äußere Reize führt zu einer Aktivierung der intrazellulären Signalwege und anschließend Produktion einer Reihe von verschiedenen Entzündungsmediatoren wie Zytokine, Chemokine und antimikrobielle Peptide. Diese Keratinozyten gewonnenen Proteinen beteiligt die entzündliche Reaktion durch die Rekrutierung und Aktivierung von Immunzellen wie dendritische Zellen, Neutrophilen und spezifische T-Zellen6,7. So weil Keratinozyten in vielen biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen, war das Grundprinzip hinter der hier vorgestellten Technik erzeugen eine in-Vitro -Modell, um die Haut Biologie zu studieren. Primären Keratinozyten Kulturen gewonnenen neonatale Vorhaut werden häufig verwendet, um Haut Biologie8,9zu studieren. Jedoch mit der hier beschriebenen Technik Keratinozyten aus beiden Geschlechtern ergeben sich wiederum eine höhere biologische Vielfalt der Zellen.
Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Generierung von primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Haut, einschließlich Wartung und das Einfrieren der Keratinozyten. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die primären menschlichen Keratinozyten zu generieren, die als Modell kann, zur kutanen Biologie in-vitro-Studie verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>KSFM supplements</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Supplements for KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS without Calcium and Magnesium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Dimethyl sulfoxid</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Cell culture medium additive</td></tr><tr><td>Sterilization filter</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Syringe filter with a pore size of 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Used to trypsinize cells</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>-</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>-</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Used to inactivate trypsin</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>-</td><td>-</td><td>Forceps from any company can be used</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>-</td><td>-</td><td>Scissors from any company can be used</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>Scalpels from any company can be used</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Gauze pads</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>Gauze pads from any provider can be used</td></tr><tr><td>Foot planer</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>Foot planer from any provider can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Petri dishes from any provider can be used</td></tr><tr><td>Metal filter</td><td>-</td><td>-</td><td>In-house 1 mm hole size metal filter</td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>NUNC</td><td>156499</td><td>-</td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>TTP</td><td>90151</td><td>-</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Used to trypsinize cells when passaging</td></tr></tbody></table>

generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin

Die Hauptfunktion der Keratinozyten soll die strukturelle Integrität der Epidermis, eine mechanische Barriere für die Außenwelt erhalten bleibt. Darüber hinaus spielen die Keratinozyten eine wesentliche Rolle bei der Initiierung, Wartung und Regelung der epidermalen Immunantworten als Teil des angeborenen Immunsystems Reaktion auf Antigene Reize schnell und unspezifisch. Wir beschreiben hier, ein Protokoll für die Isolierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen Haut und zeigen, dass diese Zellen auf Kalzium-induzierte terminal Differenzierung, gemessen durch eine erhöhte Expression von Differenzierung Marker Involucrin reagieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass die isolierte Keratinozyten, IL-1β-induzierte Aktivierung des intrazellulären Signalwege reagieren, wie durch die Aktivierung der p38 MAPK Weg gemessen. Zusammengenommen, beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Da die Keratinozyten die vorherrschenden Zelltyp in der Epidermis sind, eignet sich diese Methode zu molekulare Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-Studie.

Kalzium-induzierte Terminal Differenzierung Menschlichen Keratinozyten unterziehen terminal Differenzierung bei der Behandlung mit Kalzium14,15,16. Primären menschlichen Keratinozyten waren isoliert und kultiviert wie im obigen Protokoll beschrieben. Bei ca. 50-60 % Zusammenfluss, die Zellen wurden mit Kalzium (1,2 mM) stimuliert oder Fahrzeug und Bilder der Zellen wurden am Tag 0, 1 und 2. <strong class="xf...

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Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Die menschliche Haut wirkt als eine erste Verteidigungslinie gegen die Außenumgebung. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Diese isolierten Keratinozyten eignen sich zahlreiche Versuchsaufbauten und sind ein sehr geeignetes Modell für die Untersuchung der molekularer Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-.

Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.2K Aufrufe.  Aarhus University Hospital. Die menschliche Haut wirkt als eine erste Verteidigungslinie gegen die Außenumgebung. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Diese isolierten Keratinozyten eignen sich zahlreiche Versuchsaufbauten und sind ein sehr geeignetes Modell für die Untersuchung der molekularer Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-.

Serie: Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Biologie

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Biotechnik

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in vitro.&#160;Live-cell imaging has allowed for significant advances in the ability to identify differences between keratinocyte stem cells and committed progenitor behavior. Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. This protocol has been developed to culture keratinocytes at low seeding density, enabling relatively long-term time-lapse photography and monitoring of individual cell behavior. Passage 0 keratinocytes are grown at clonal density, and time-lapse photography allows documentation of individual cell divisions and the time of their occurrence. For maximum biological relevance, freshly isolated human keratinocytes are placed in vitro. This approach focuses on proliferation. However, this protocol can be adapted for use in other live cell imaging applications measuring individual cell behavior, such as measuring cell migration, wound healing, and motility.

This protocol outlines the culture of freshly obtained (passage 0) keratinocytes for use in live cell imaging.

Generierung von Primärkulturen für die Bildgebung lebender Keratinozyten

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

Isolierung, Kultur und Charakterisierung von primären Schwann-Zellen, Keratinozyten und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

Keratinozytenisolierung in der menschlichen Haut: Eine Methode zur Kultivierung primärer Keratinozyten aus Hautproben

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...