Diese Arbeit wurde von NATIONAL INSTITUTE OF ARTHRITIS UND MUSKULOSKELETAL UND HAUTKRANKHEITEN gewährt (R01AR069653 bis Zhang LJ) und National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 bis CA).

Alle Tierversuche werden vom UCSD Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. 1. Primäre Maus KC Isolierung und Kultur aus neonatalen Haut <ol><li> Opfer der postnatalen Tag 0-2 Neugeborenen aus dem C57B / 6 Wildtyp-Maus-Stamm durch Enthauptung mit Schere. Schneide die Glieder kurz über dem Handgelenk und den Knöchelgelenken ab, schneide dann den Schwanz ab und läßt ein kleines Loch zu. </li><li> Um die ganze Haut abzuschälen, schlage die scharfe Schere durch das Loch am Schwanz und schneide die Haut entlang der dorsalen Mittellinie des Körpers auf die Öffnung am Hals. Als nächstes verwenden Sie eine Pinzette, um den freiliegenden Körper und die andere Pinzette zu fassen, um die Haut zu fassen, und schütteln Sie sanft die ganze Haut vom Körper und über die Beinstümpfe mit einer kontinuierlichen Bewegung. <ol><li> Schälen Sie die Haut als ein intaktes Stück und achten Sie darauf, die Haut nicht in Stücke zu brechen, da dies zu Zellverlust während des Disposeschrittes führen wird. </li></ol></li> &lt;Li&gt; Spülen Sie die geschälte Haut mit 15 ml sterilem PBS in einer 10 cm Petrischale und legen Sie dann die Haut von jedem Welpen in ein 2-ml-Röhrchen, gefüllt mit Eiskälteablagerungs-Verdauungspuffer, der 4 mg / mL Dispase in KC-Wachstumsmedium enthält (KC-Basalmedium hat 0,06 mM CaCl 2 , dGS und Antibiotika / Antimykotika). HINWEIS: Mehrere Hautisolate können kombiniert und in einem 15-ml-Röhrchen (bis zu 5 Skins pro Röhrchen) mit 12 ml Disposelösung inkubiert werden. Inkubieren Sie das Hautröhrchen über Nacht in einem 4 ° C Kühlschrank auf einem Rotator. <ol><li> Vergewissern Sie sich, dass die Haut nicht in der Röhre gefaltet ist, da dies zu einer unzureichenden Belichtung des gefalteten Bereichs zur Disposelösung führt. </li></ol></li><li> Am nächsten tag (nach 12-18 h in dispase), transportiere die haut zusammen mit der dispase lösung in eine petrischale Übertragen Sie jedes Gewebestück auf eine neue Petrischale mit 15 ml sterilem PBS, um überschüssige Disposition zu waschen. </li><li> Mit zwei Pinzettenpaaren greife die Haut von PBS,Heben Sie die Haut und übertragen Sie eine neue Petrischale mit der epidermalen Seite nach unten und die Dermis nach oben. Die Hautfalten sorgfältig ausdehnen, damit sie auf der Petrischale vollständig ausgezogen ist. </li><li> Platzieren Sie 500 μl einer Trypsin-basierten Aufschlusslösung für jede Haut in einer neuen Petrischale. Mit Pinzette, langsam heben Sie die Dermis auf und weg von der Epidermis, während die Epidermis nach unten halten. Die Dermis als biologisch gefährliches Material entsorgen. Übertragen Sie die getrennte Epidermis und schweben Sie auf jeden Tropfen Trypsin-Lösung mit der Basalschicht nach unten. <ol><li> Wenn die Epidermis auf die Trypsin-Lösung gefaltet ist, entfernen Sie alle Falten mit Pinzette, um eine effiziente Verdauung von basalen KCs aus dem Epithel zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Die Haut auf einer Petrischale in Trypsinlösung bei Raumtemperatur (mit Deckel bedeckt) auf einem horizontalen Schüttler mit leichtem Rühren für 20 min inkubieren. </li><li> Füge 2 ml des ergänzten KC-Wachstumsmediums pro Epidermis hinzu (ca. 1 Quadratzoll in der Größe proEpidermis) zur Petrischale. Fassen Sie die Epidermis mit Pinzette, und kräftig reiben die Epidermis hin und her, um einzelne Zellen aus dem epidermalen Blatt freizugeben. <ol><li> Beobachten Sie das Medium drehen zunehmend trübe, wie die Zellen von der Epidermis abgelöst werden. Kippen Sie die Petrischale, um die Zellsuspension zu einem neuen Röhrchen zu sammeln und zu transportieren, wobei das übrige Epidermisblatt auf dem Teller bleibt. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie zwei weitere Male das Reiben der epidermalen Folie nach Zugabe von 2 ml KC-Wachstumsmedium und kombinieren Sie die Zellsuspensionen in der gleichen Röhre. </li><li> Pipettieren Sie die Zelllösung vorsichtig ein paar Mal, um alle Zellklumpen mit der entsprechenden serologischen Pipette zu brechen und dann durch einen 100 μm Filter in ein neues 50 mL Zentrifugenröhrchen zu führen. </li><li> Zentrifugieren der filtrierten Zellen für 5 min bei 180 x g. </li><li> Den Überstand abtupfen und das Zellpellet vorsichtig in 1 ml kaltem KC-Wachstumsmedium / Epidermis resuspendieren. </li><li> Zähle die Zellen durch ein Hämocytometer. <br/&gt; HINWEIS: Die KCs können sich spontan in Suspension differenzieren, so dass die Zellen so schnell wie möglich nach der Isolation plattiert werden sollten, um die optimale Leistung der Zellen zu gewährleisten. Wir empfehlen, die Zellen auf Eis zu legen, während das Zählen, da dies die Rate der KC spontane Differenzierung reduzieren wird. </li><li> Pflanzensamen , die Zellen in einer Dichte von 5 x 10 4 / cm 2 in Wachstumsmedium KC in Kulturschalen vorbeschichtet mit einem extrazellulären Matrix (ECM) Produkt , das der Zellanheftung fördert. HINWEIS: Wir verwenden eine handelsübliche (zB Anbindungsfaktor, der ein Gelatine-basiertes Beschichtungsmaterial ist (siehe Tabelle der Materialien für Details). Die Zellen wurden im befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C kultiviert und es wurden frisches Medium Jeden zweiten Tag aufgefüllt <ol><li> Zur Beschichtung die Kulturschalen mit dem Zellbefestigungsbeschichtungsmaterial auf die Raumtemperatur für 10 min bis 2 h vor dem Zellseeding aufwärmen. Entfernen Sie den Befestigungsfaktor kurz vorZugabe der Zellsuspension </li></ol></li><li> Ändern Sie das Medium 24 h nach der anfänglichen Beschichtung, um ungebundene Zellen zu entfernen, und ändern Sie das Medium täglich, bis die Zellen die gewünschte Konfluenz vor dem Experiment erreichen. </li></ol> 2. Primäre Maus KC Isolierung von Erwachsenen Schwanz Haut <ol><li> Opfer einer erwachsenen C57BL / 6-Maus (vorzugsweise zwischen 6-15 Wochen alt, entweder männlich oder weiblich) nach den Tierbestimmungen. Den Schwanz von der Schwanzbasis abschneiden und ~ 2 mm der Schwanzspitze abschneiden, so dass ein sichtbares Loch an der Spitze ist. </li><li> Um die Schwanzhaut abzureißen, verwenden Sie zuerst eine scharfe Klinge, um die Schwanzhaut von der Basis bis zur Schwanzspitze zu schneiden. Als nächstes verwenden Sie eine Pinzette, um den freiliegenden Schwanzknochen und die andere Pinzette zu fassen, um die Haut zu fassen, und schütteln Sie die Schwanzhaut vorsichtig mit einer kontinuierlichen Bewegung vom Knochen ab. Schneide die geschälte Haut von der Mittellinie, so dass jedes Stück weniger als 2-3 cm lang ist. </li><li> Spülen Sie die geschälte Haut WitzH 15 ml steriles PBS in einer 10 cm Petrischale, dann platziere die Haut von jedem Schwanz in ein 2 mL Röhrchen, gefüllt mit Eiskälteablagerung Verdauungspuffer (4 mg / mL Dispase in KC Wachstumsmedium). HINWEIS: Mehrere Hautstücke können auch kombiniert und in einem 15-ml-Röhrchen (bis zu 5 Schwänze pro Röhrchen) mit 12 ml Disposelösung inkubiert werden. <ol><li> Inkubieren Sie das Hautröhrchen über Nacht in einem 4 ° C Kühlschrank auf einem Rotator. </li></ol></li><li> Führen Sie die Schritte 1.4 bis 1.13 aus, um die Einzelzellsuspension von der Schwanz-Epidermis zu isolieren. </li><li> Saatgut , die adulte Zellen in einer Dichte von 10 x 10 4 / cm 2 (von einer Zählkammer gezählt) in Wachstumsmedium KC in Kulturschalen vorbeschichtet mit Kollagen. HINWEIS: Wir verwenden ein handelsübliches kollagenbasiertes Beschichtungskit (siehe die Tabelle der Materialien für Details). Die Zellen wurden in befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C kultiviert, und frisches Medium wurde jeden zweiten Tag aufgefüllt. Im allgemeinen ist die cGeiergerichte sollten mit Kollagen für 30 min bis 1 h vor der Zellsäen beschichtet werden. Wir beobachten, dass es eine signifikante Verbesserung der erwachsenen KC-Anlagerung an die Schale gibt, wenn sie mit Kollagen beschichtet ist, verglichen mit dem Bindungsfaktor, der ein Gelatine-basiertes Beschichtungsmaterial ist. </li><li> Ändern Sie das Medium 24 h nach der anfänglichen Beschichtung, um ungebundene Zellen zu entfernen, und ändern Sie das Medium täglich, bis die Zellen die gewünschte Konfluenz vor dem Experiment erreichen. </li></ol> 3. In vitro Differenzierung von KCs durch High Calcium <ol><li> Um eine terminale Differenzierung zu induzieren, fügen Sie CaCl 2 zu 0,2 mM im Kulturmedium hinzu. </li><li> Alternativ verhungern die kultivierten KCs über Nacht ohne Zusatzwachstumsergänzungen in niedrigem Calcium-KC-Basalmedium vor der Zugabe von hohem Kalzium. HINWEIS: Wachstumsfaktor Hunger wird die Zellverpflichtung zur frühen Differenzierung und die Induktion von frühen Differenzierungsmarkern, wie K10 5, verbessern </Sup&gt;. </li></ol> 4. UVB-Bestrahlung vermittelter Zelltod und TNF &amp; agr; Freisetzung von KCs <ol><li> Kultur die Maus KCs im KC-Wachstumsmedium (im befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C) mit täglichem Medium wechseln, bis die Zellen Konfluenz erreichen. Unmittelbar vor der UVB-Bestrahlung das Wachstumsmedium entfernen und mit 500 μl PBS ersetzen. Dann die Zellen auf 25 mJ / cm 2 UVB oder Mock Control (kein UVB) unterziehen. HINWEIS: Die UVB-Bestrahlung erfolgt mit handgehaltenen UVB-Lampen mit zwei 8 W-Glühlampen (312 nm) wie zuvor beschrieben 10 . Nach UVB-Bestrahlung wird PBS aspiriert und frisches Medium zugegeben. </li><li> Messen und quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit durch den CCK-8-Zelllebensfähigkeitstest nach 6, 8 und 24 h nach der UVB-Behandlung nach der Anweisung des Herstellers 11 . </li><li> Sammeln Sie das konditionierte Medium aus den mit UVB behandelten KCs zu gewünschten Zeitpunkten und messen Sie das freigesetzte TNFαIm konditionierten Medium mit dem Maus-TNF (Mono / Mono) ELISA-Kit nach der Anleitung des Herstellers 7 , 12 . </li></ol>

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	<li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2++and+K++gradients+in+murine+epidermis:+quantitative+measurement+using+PIXE.">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li><li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis:+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry.">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li><li>Elias, P. 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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+enhances+mouse+keratinocyte+differentiation+in+vitro+to+differentially+regulate+expression+of+papillomavirus+authentic+and+codon+modified+L1+genes.">Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes.</a> Virology. 365 (1), 187-197 (2007).</li><li>Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+cell+cycle+exit,+and+onset+of+terminal+differentiation+in+cultured+keratinocytes:+pre-programmed+pathways+in+control+of+C-Myc+and+Notch1+prevail+over+extracellular+calcium+signals.">Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals.</a> J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).</li><li>Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+1.2+mmol/l+calcium,+triamcinolone+acetonide,+and+retinoids+on+low-calcium+regulated+keratinocyte+differentiation.">Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation.</a> Br J Dermatol. 111, 64-72 (1984).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Haut-Epidermis fungiert als eine kritische Barriere, um den Körper von der äußeren Umgebung zu trennen und zu schützen und Schäden durch Wasserverlust, Krankheitserreger, Hitze und UV-Bestrahlung. Die KCs sind die vorherrschende Zelllinie der Epidermis, und die Primärkultur der epidermalen KCs ist ein nützliches Werkzeug, um die biologischen Prozesse der Barrierebildung und die Reaktion von KCs auf Umweltbeleidigungen in vitro zu untersuchen und zu verstehen. Hier beschre...

Die Haut ist das größte Organ im Körper mit der Epidermis als die äußerste Schicht. Die Epidermis spielt eine entscheidende Rolle bei der Bildung einer intakten epidermalen Barriere, um den Körper von der Umwelt zu trennen und verhindert so Wasserverlust und schützt vor Umweltbeleidigungen wie Allergenen, Krankheitserregern und UVB-Exposition. Die Epidermis entwickelt sich aus einer einzigen Schicht von undifferenzierten basalen Keratinozyten (KCs) zu einem mehrschichtigen, geschichteten Epithel, bestehend aus einer Basalschicht, gefolgt von einer Dornschicht, einer körnigen Schicht und einem Stratum corneum. Basale KCs, bestehend aus epidermalen Stammzellen und transitverstärkenden Zellen, sind proliferativ und undifferenziert. Da die Basal-KCs den Zellzyklus verlassen, begehen die Zellen der Differenzierung und wandern allmählich zur Oberfläche der Epidermis, begleitet von der Reifung von Zellzellübergängen und der Bildung einer epidermalen Permeabilitätsbarriere (EPB). Die KCs an der Dornschicht drücken früh differenz ausIonenmarker wie Keratin 10 (K10); Wenn die KCs zur körnigen Schicht wandern, exprimieren die Zellen späte Differenzierungsmarker wie Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) und Involucrin (INV). Bei dem Stratum corneum werden die KCs endlich differenzierte Corneozyten, die schließlich durch Abschuppung abgebaut werden, da neue Zellen sie ersetzen. Calcium gilt als das physiologischste Mittel in der Epidermis und löst die Differenzierung in vitro und in vivo in ähnlicher Weise aus. Bei normaler Hautepidermis bilden Calciumionen einen charakteristischen &quot;Konzentrationsgradienten&quot;, der sich in der Konzentration auf die Hautoberfläche 1 , 2 , 3 erhöht. Die Calciumkonzentration steigt von niedrigen Niveaus in den untersten Teilschichten (Basal- und Dornschichten) bis zu einem Peak in der oberen Granulatschicht und fällt dann in der oberflächlichen Schicht (Stratum corneum) zu vernachlässigbaren Niveaus.<html> Der Kalziumgradient entwickelt sich auch zufällig mit der Entstehung einer Komponentenpermeabilitätsbarriere, die die Calcium-Signalisierung eine kritische Rolle der KC-Differenzierung spielt. In vitro behält das niedrige Kalzium (0,02-0,1 mM) die Proliferation von basalen KCs als Monoschicht bei, während ein hohes Kalzium (&gt; 0,1 mM) eine rasche und irreversible Verpflichtung der Zellen zur terminalen Differenzierung induziert, wie durch eine enge Kreuzung und Induktion gezeigt wird Von LOR und INV bei hoher Kalziumbehandlung zu den basalen KCs 4 , 5 . Neben der Barrierebildung sind auch epidermale KCs ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems der Haut. Als Reaktion auf Pathogene oder beschädigte assoziierte molekulare Muster (DAMPs), die bei UVB-Bestrahlung oder Verletzung freigesetzt werden, können KCs große Mengen an entzündlichen Zytokinen wie TNF &amp; agr ;, IL 6 und IFN &amp; bgr; erzeugen, was zu einer Aktivierung des Immunsystems führt&gt; 6 , 7 , 8 , 9 Obwohl eine korrekte entzündliche Signalisierung von KCs für die Pathogen-Clearance erforderlich ist, kann eine unkontrollierte Entzündungsreaktion die Entwicklung von entzündungshemmenden Hauterkrankungen wie Psoriasis und Rosacea 6 , 8 auslösen. Insgesamt spielen KCs eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der intakten Hautbarriere und initiieren eine Immunantwort auf Pathogeninvasion oder Umweltbeleidigungen. Daher ist die primäre Kultur der epidermalen KCs eine nützliche Technik, um die Epithelbiologie, KC-Differenzierung sowie KC-stimulierte angeborene Immunantworten zu untersuchen. Die Isolierung und Kultur der primären Maus epidermalen KCs kann ein anspruchsvoller Prozess aufgrund der KC-Anfälligkeit und Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen externen Stimulanzien sein. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultur von KCs aus der neonatalen Maushaut oderErwachsene Maus Schwanz Haut. Für die erwachsene KC-Isolation verwenden wir keine Maus-Dorsal-Haut, da die Isolierung von ausreichenden Mengen an lebensfähigen KCs aus diesem Gewebe aus folgenden Gründen schwierig sein kann: Erstens besteht die erwachsene Dorsalhaut in der Ruhephase des Haarzyklus (Telogen) aus a Dünne Epidermis mit nur 1-2 Schichten von Zellen, was zu einer niedrigen Zelle Ausbeute und ineffiziente Trennung der Epidermis aus der Dermis, die der kritische Schritt für eine erfolgreiche KC-Isolation ist. Zweitens trägt die hohe Haarfollikeldichte, die auf der erwachsenen Dorsalhaut vorhanden ist, weiter zur Schwierigkeit bei der Trennung der Epidermis von der Dermis bei. Stattdessen verwenden wir routinemäßig die Schwanzhaut als Quelle für erwachsene Maus-KCs, da dieses Epithel mit 3-5 Schichten epidermalen KCs dicker ist. Es hat auch eine niedrigere Haarfollikel-Dichte, die nicht mit der epidermalen Trennung stört, so dass KC-Isolierung von jeder erwachsenen Maus Schwanz Haut unabhängig von der Alter und Haare Radfahren Stadium der Maus. Die isolierte neonaTal KCs werden zu gelatinebeschichteten Kulturschalen ausgesät, während kollagenbeschichtete Schalen verwendet werden, um isolierte erwachsene KCs zu säen, da die beeinträchtigten Fähigkeiten der erwachsenen Zellen im Vergleich zu ihren neonatalen Gegenstücken haften. Zur Kombination von Maus-KCs wird ein niedriges Calcium-Basalmedium mit dGS ergänzt, das epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Rindertransferrin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor c1 (IGF1), Prostaglandin E2 (PGE2), Rinderserumalbumin (BSA) und Hydrocortison enthält. Zwischen 2-4 Tagen nach der anfänglichen Beschichtung können die meisten der differenzierten KCs während der täglichen mittleren Veränderungen weggewaschen werden, und die verbleibenden adhärenten Zellen zeigen eine typische Kopfsteinmorphologie 4 , sind proliferierend und exprimieren nicht den frühen Differenzierungsmarker K10.

<table width="633">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="width:171px;height:100px;">C57BL/6 neonates or adult wildtype mice</td>
			<td style="width:177px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">000664</td>
			<td style="width:167px;">Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">KC basal medium (EpiLife)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">MEPICF500</td>
			<td style="width:167px;">basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">Defined Growth Supplement (dGS)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S0125</td>
			<td style="width:167px;">defined growth supplements for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Dispase powder</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">17105041</td>
			<td style="width:167px;">enzyme to dissociate the epidermis from dermis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S006100</td>
			<td style="width:167px;">gelatin-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Coating Matrix</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">R011K</td>
			<td style="width:167px;">Collagen-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="width:171px;height:80px;">TrypLE</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">12604-013</td>
			<td style="width:167px;">A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">100 &#956;m Cell Strainer Nylon mesh</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">CCK-8 cell viability Kit</td>
			<td style="width:177px;">Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td>
			<td style="width:119px;">CK04-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:119px;">555268</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Corded Hand-Held UV Lamps</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">EB-280C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">8-watt UV tubes</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">BLE-8T312</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Light Inverted Microscope for cell culture</td>
			<td style="width:177px;">ZEISS, Jena, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Axio Observer</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX41</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary mouse keratinocytes from neonatal and adult mouse skin

Der Keratinozyt (KC) ist der vorherrschende Zelltyp in der Epidermis, der äußersten Schicht der Haut. Epidermale KCs spielen eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von Hautverteidigung durch die Bildung einer intakten Hautbarriere gegen Umwelt-Beleidigungen, wie UVB-Bestrahlung oder Pathogene, und auch durch die Einleitung einer entzündlichen Reaktion auf diese Beleidigungen. Hier beschreiben wir Methoden, um KCs von der neonatalen Maushaut und von der erwachsenen Mausschwanzhaut zu isolieren. Wir beschreiben auch Kultivierungsbedingungen mit definierten Wachstumsergänzungen (dGS) im Vergleich zu Chelex-fötalem Rinderserum (cFBS). Funktionell zeigen wir, dass sowohl neonatale als auch erwachsene KCs in hohem Maße auf eine hohe Calcium-induzierte terminale Differenzierung, eine enge Kreuzungsbildung und -schichtung ansprechen. Darüber hinaus sind kultivierte erwachsene KCs anfällig für UVB-ausgelösten Zelltod und können große Mengen an TNF bei UVB-Bestrahlung freisetzen. Gemeinsam sind die hier beschriebenen Methoden für Forscher für den Aufbau des In-vitro- Modells von NutzenS, um die epidermale Biologie in der neonatalen Maus und / oder der erwachsenen Maus zu studieren.

Hohe Calcium-induzierte terminale Differenzierung von neonatalen und erwachsenen KCs. Die primäre Maus epidermalen KCs ausplattiert und gehalten bei 0,06 mM CaCl 2 wuchs als Monoschicht, und einzelne Zellen hatten eine polygonale Form mit deutlichen Interzellularraum, zeigt einen Pflasterstein Aussehen , wenn konfluent (1A und 2A). Anheben des CaCl 2 bis 0,2 mM induziert eine rasche Änder...

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Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Epidermale Keratinozyten bilden eine funktionelle Hautbarriere und sind an der Frontlinie der Wirtsverteidigung gegen äußere Umweltbeleidigungen positioniert. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Primärkultur von epidermalen Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Maushaut und Induktion der terminalen Differenzierung und UVB-ausgelösten Entzündungsreaktionen von Keratinozyten.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.4K Aufrufe.  UC San Diego.  Epidermale Keratinozyten bilden eine funktionelle Hautbarriere und sind an der Frontlinie der Wirtsverteidigung gegen äußere Umweltbeleidigungen positioniert. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Primärkultur von epidermalen Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Maushaut und Induktion der terminalen Differenzierung und UVB-ausgelösten Entzündungsreaktionen von Keratinozyten. 

Serie: Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...