Die Haut enthält mehrere Zelltypen, darunter Keratinozyten, Fibroblasten und Nervenschwann-Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung jedes dieser Zelltypen für In-vitro-Experimente. Die Isolierung und Etablierung einzelner primärer Zellkulturen aus einem einzigen Spender ermöglicht robuste Vergleiche und Kokulturexperimente und mildert gleichzeitig die Auswirkungen genetischer Variationen.
Mit diesem Protokoll ermöglicht die Analyse einzelner Zellen und ihrer Interaktionen die Analyse der Rolle von Schwann-Zellen in der Hauthomöostase und Pathophysiologie. Diese unterschiedlichen Zellpopulationen können verwendet werden, um Schwann-Zellen, Fibroblasten oder Keratinozyten entweder einzeln oder in Kombination in normaler Hautphysiologie, Wundheilung oder in hautkranken Zuständen zu untersuchen. Jagadeeshaprasad M G, ein Postdoktorand in meinem Labor, wird mich bei der Demonstration des Verfahrens unterstützen.
Nachdem Sie die neonatale Vorhaut nach Standardbehandlungen erworben haben, legen Sie die ausgeschnittene Vorhaut in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das acht bis 10 Milliliter eiskaltes DMEM-Basalmedium enthält, und transportieren Sie die Vorhaut sofort zur Zellkulturisolierung in das Zellkulturlabor. Spülen Sie die Vorhaut zweimal mit 20 bis 25 Millilitern Dulbecco's Phosphate Buffered Saline oder DPBS, enthalten Antibiotika und Antimykotikum. Dann tränken Sie die gewaschene Haut in 25 bis 30 Millilitern eiskaltem DMEM-Basalmedium in einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturschale.
Nach 15 Minuten die Vorhaut mit einem Skalpell aufschneiden, um die Dermis und das Unterhautfettgewebe freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette, eine Skalpellklinge und eine Schere, um das Unterhautfettgewebe zu entfernen und zu entsorgen. Anschließend die saubere Vorhaut in drei bis fünf kleinere Stücke schneiden und die Hautstücke in 16 bis 20 Milliliter Dispace one DMEM-Medium in einem sterilen konischen Schlauch inkubieren.
Während der ersten 30 Minuten der Inkubation mit Dispace mischen Sie intermittierend die Hautstücke im konischen Schlauch durch Inversion. Legen Sie dann die konische Röhre für 16 bis 18 Stunden auf vier Grad Celsius. Am nächsten Tag entfernen Sie die Hautstücke und legen Sie sie auf eine trockene sterile Kulturschale und rollen Sie jedes Stück Haut aus, so dass die äußere Epidermisschicht die Kulturschale berührt.
Beginnend am Rand des Gewebes schälen Sie die Epidermis mit zwei Pinzettensätzen von der Dermis weg. Fügen Sie die getrennten Epidermisfragmente zu fünf Millilitern HBS in einer 10 Zentimeter großen Kulturschale hinzu, um bei Raumtemperatur für 10 Minuten zu inkubieren. Dann sammeln Sie die HBS-Lösung in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie fünf Milliliter Trypsin-Neutralisationspuffer oder T und B in das konische Rohr hinzu.
Stellen Sie die Röhre beiseite. Zu den epidermalen Fragmenten in der Kulturschale fügen Sie drei Milliliter Trypsinlösung hinzu, um bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten zu inkubieren. Nach der Inkubation die epidermalen Fragmente vorsichtig mit einer Pinzette aufrühren, bis die Trypsin-Keratinozytenlösung trüb wird.
Als nächstes fügen Sie die Trypsin-Keratinozytenlösung zum HBS-T- und B-Röhrchen hinzu. Nachdem Sie unverdaute epidermale Fragmente mit Trypsin-EDTA-Lösung gelöst haben, fügen Sie zwei Milliliter FBS in das HBS-T- und B-Röhrchen mit Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und zentrifugieren Sie die beiden etwa 870-mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dann den Überstand absaugen und das Zellpellet in drei Milliliter Keratinozyten-Vollwachstumsmedium resuspendieren, gefolgt von der Filtration der Zellsuspension mit einem sterilen 100-Mikrometer-Filter in ein steriles 50-Milliliter-Konusröhrchen.
Sobald die Zellzahl und die Zelllebensfähigkeit quantifiziert sind, säen Sie die Zellen in den Kulturplatten aus, um sie bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid in einen Inkubator zu legen. Nach zwei Tagen aspirieren Sie die nicht anhaftenden Zellen und aktualisieren Sie die Zellkulturmedien jeden zweiten Tag, bis die Keratinozyten einen Zusammenfluss von 50 bis 80% für das Passieren oder nachgeschaltete Experimente erreichen. T25-Flaschen mit Poly-L-Lysin oder PLL mit fünf Millilitern DPBS beschichten und die vorbeschichteten Kolben drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius platzieren.
Später waschen Sie die PLL-Beschichtungsmatrix zweimal mit DPBS. Nachdem Sie die isolierten Stücke der Dermis mit fünf Millilitern DMEM-Basalmedium gewaschen haben, zerkleinern Sie die Dermis mit einer Schere in kleine Stücke. Verdauen Sie die gehackte Dermis mit fünf Millilitern Kollagenase bei 37 Grad Celsius für zweieinhalb Stunden, mit sanfter Titration mit einer Pipettenspitze alle 30 Minuten, bis sich die Dermis vollständig dissoziiert.
Nach der Verdauung filtern Sie die Zellsuspension mit einem 70-Mikrometer-Zellsieb, gefolgt von einer Verdünnung der gefilterten Zellsuspension mit fünf Millilitern vollständigem DMEM-Medium, um die enzymatische Aktivität der Kollagenase zu stoppen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 870 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur und suspendieren Sie den Zellstimmzettel in zwei Millilitern DMEM-Vollmedium, um die Zellen zu teilen. Nachdem Sie den Zentrifikationsprozess wie beschrieben wiederholt haben, aspirieren Sie den Überstand, um das Zellpellet zu verwenden, um die Schwann-Zellen oder Fibroblasten zu isolieren.
Um die Schwan-Zellen zu isolieren, suspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern frischem DMEM-Vollmedium und quantifizieren Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit, bevor Sie fünf Milliliter der resuspendierten Zellen in vorcodierten T25-Kolben mit einer Dichte von 4,0 mal 10 zu den drei Zellen pro Milliliter aussäen. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nach 16 Stunden bestätigen Sie die Zelladhäsion durch Mikroskopie bei 10-facher Vergrößerung.
Entfernen Sie dann die Nicht-Adhärenzzellen und waschen Sie den Kolben dreimal mit fünf Millilitern DPBS. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern 10 mikromolaren Cytosin-Arabinosid in einem DMEM-Vollmedium. Nach 24 Stunden aspirieren Sie das Cytosin-Arabinosid-haltige Medium, bevor Sie den Kolben wie zuvor gezeigt spülen.
Füllen Sie den Kulturkolben mit fünf Millilitern Schwann-Zellen komplettem Kulturmedium auf, um 48 Stunden zu inkubieren, während Sie das Medium jeden zweiten Tag erfrischen, bis die Schwann-Zellen eine Konfluenz von 80% erreichen. Um die Fibroblasten zu isolieren, resuspendieren Sie das gesammelte Pellet in fünf Milliliter Fibroblasten vollständiges Medium. Um die Zellen in nicht codierten T25-Kulturflaschen für 24 Stunden zu kultivieren, wie für die Schwann-Zellen demonstriert.
Nach dem Absaugen der Nicht-Adhärenzzellen und dem Waschen des Kolbens inkubieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern frischem Fibroblasten-Komplettmedium bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 48 Stunden. Da die isolierten Primärzellen in entsprechenden Zellkulturmedien kultiviert wurden, erreichten die primären Keratinozyten am siebten Tag eine Konfluenz von 85% und zeigten eine charakteristische Zellmorphologie mit einer Kopfsteinpflasterform. Die Schwann-Zellen erreichten am fünften Tag einen Zusammenfluss von 95% und schienen bipolar oder tripolar in der Form zu sein.
Die Fibroblastenkulturen erreichten am vierten Tag einen Zusammenfluss von 95% und die meisten Zellen zeigten eine Spindelformmorphologie. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte die zelltypspezifische Proteinexpression in den Zellkulturen. Die Keratinozyten waren positiv auf K10- und K14-Protein.
Die zusammengeführten Bilder der Keratin-Immunfluoreszenz und der DAPI-Kernfärbung zeigten eine Reinheit der Zellkulturen von 97,8%. In ähnlicher Weise waren die Schwann-Zellen positiv für S100 und P75 NTR und hatten eine Reinheit von 95,2% in der Kultur. Die Fibroblasten exprimierten positiv Vimentin, exprimierten aber nicht alpha glatte Muskulatur Actin, einen Myofibroblastenmarker.
Die Reinheit der Kultur betrug etwa 97,2%Um Shanses Beweise zu verbessern, kann eine vorbeschichtete Poly-L-Lysin-Schale verwendet werden. Und um die fibröse Kontamination weiter zu mildern, wurde Cytosin-Arabinosid und Antimykotikum hinzugefügt, nachdem Zellen für kurze Zeit hinzugefügt worden waren. Dies ist ein einfaches, kostengünstiges experimentelles Verfahren, um die drei Primärzellen, wie Schwannzellen, Keratinozyten und Fibroblasten, aus einer einzigen menschlichen Vorhaut zu gewinnen.
Dieses Protokoll ist ideal für In-vitro-Experimente mit Zellzellkommunikation oder Übersprechen zwischen Zelltypen.
