Name: enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine
Uploaded: 2018-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
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Die Autoren danken Véronique de Berardinis für fruchtbare Diskussionen und Alain Perret, Christine Pellé und Peggy Sirvain für den technischen Support.

(1) Enzympräparat
<ol><li>Express und Proteine als zuvor beschriebenen26zu reinigen. Hinweis: Rekombinante Proteine wurden mit den folgenden Endkonzentrationen erhalten: αKAO von Catenulispora Acidiphila, UniProtKB-ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO von C. Pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL; PLP-DCs von S. Rumirantium, UniProtKB-ID: O50657 (LDCSrum), freie Zelle extrahieren mit insgesamt Enzym 12,44 mg/ml; PLP-DC von C. Pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM7 (DC-Cpin), 2,62 mg/mL.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Lösungen
Hinweis: Die folgenden Lösungen sind in entionisiertem Wasser bereit.
<ol><li>Bereiten Sie 1 M HEPES-Puffer, pH 7,5; mit 5 M NaOH einstellen. Hinweis: Während der pH-Wert Einstellung Schritt tragen Sie Schutzhandschuhe, Schutzkleidung, Augenschutz und Gesichtsschutz (P280). Spülen Sie bei Berührung mit den Augen (P305 P351, P338) vorsichtig mit Wasser mehrere min. entfernen Kontaktlinsen wenn möglich. Weiter spülen und rufen Sie sofort einen poison Center oder Arzt (P310). Der P-Code bezieht sich auf den Sicherheitshinweis (Gefahrenklasse und Kategorie; siehe, z.B., pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mM L-Lysin, 100 mM (5S) - hydroxy - L-Lysin, 150 mM α-Ketoglutaric Säure, 100 mM Natrium Ascorbat, 10 mM Ammonium Eisen(II) Sulfat Hexahydrat (Mohr Salz), 100 mM Pyridoxal-5-Phosphat (PLP) und 100 mM Dithiothreitol (DTT).</li>
	<li>Bereiten Sie 1 M, 2M und 6M Salzsäure (HCl) von einem 37 % HCl Lösung (ca. 12 M), Anschluss an die gleichen Sicherheitshinweise wie in 2.1 beschriebenen vor. Hinweis: Die Lösungen der α-Ketoglutaric Säure, Natrium-Ascorbat und Ammonium Eisen(II) Sulfat Hexahydrat müssen frisch am Tag der Benutzung erfolgen. Die Lysin-Lösung kann für mehrere Monate bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Die PLP-Lösung kann für einen Monat bei 4 ° c aufbewahrt werden Die DVB-t-Lösung kann für einen Monat bei-20 ° c gelagert werden</li>
</ol>3. analytische Waage Reaktionen
<ol><li>Methodenentwicklung für die Decarboxylierung Reaktion (5R) - hydroxy - L-Lysin<ol>
<li>Fügen Sie 11 µL 1 M Lösung von HEPES-Puffer pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM) zu einem 2 mL Reaktionscup. Fügen Sie 22 µL 100 mm (5S) - hydroxy - L-Lysin (Endkonzentration 10 mM), 2.2 µL 100 mm PLP (Endkonzentration 1 mM), und 2.2 µL 100 mm DTT (Endkonzentration 1 mM). Hinweis: Bei Reaktion mit LDCSrumist die Zugabe von DVB-t nicht erforderlich.</li>
		<li>Fügen Sie die gereinigte PLP-DC (Endkonzentration 0,1 mg/mL). Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 220 µL.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 3 h. Hinweis: Schütteln das Reaktionsgemisch mit offenen Deckel unter freiem Himmel sorgt für eine gute Sauerstoffversorgung der Reaktionsmedien. Es entfällt daher Sauerstoff in den Reaktionsmedien Blasen wirft.</li>
		<li>Sammle 10 µL des Reaktionsgemisches nach der Reaktion-monitoring-Verfahren in Schritt 6 beschrieben analysiert werden. Die Proben sind vorzugsweise derivatisiert und unmittelbar nach der Probenahme analysiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Methodenentwicklung für die enzymatische Kaskade Reaktion verbindet eine Hydroxylierung Schritt katalysiert durch αKAO mit Decarboxylierung katalysiert durch PLP-DC<ol>
<li>Fügen Sie 11 µL 1 m HEPES-Puffer pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM) zu einem 2 mL Reaktionscup. Fügen Sie 22 µL 150 mm von α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 5,5 µL von 100 mM von Natrium-Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM), 22 µL 10 mM von Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM), und 22 µL 100 mm L-Lysin (Endkonzentration 10 mM).</li>
		<li>Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 220 µL, unter Berücksichtigung der Volumen der Enzymlösung in Schritt 3.2.3 hinzugefügt werden.</li>
		<li>Fügen Sie die erforderlichen gereinigten αKAO Enzym nach der gezielten Regioselectivity: KDO1 für Hydroxylierung in Position c-3 oder KDO2 für Position c-4 L-Lysin. Die Endkonzentration des gereinigten Enzyms (0,05-0,5 mg/mL) wurde festgestellt, um eine komplette Umwandlung in ca. 3 h zu ermöglichen.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 3 h.</li>
		<li>2.2 µL von 100 mM von PLP hinzufügen (Endkonzentration ~ 1 mM) und 2.2 µL von 100 mM von DVB-t (Endkonzentration ~ 1 mM). Hinweis: Bei Reaktion mit LDCSrumist die Zugabe von DVB-t nicht erforderlich.</li>
		<li>Fügen Sie die gereinigte PLP-DC in einer Konzentration ermöglicht vollständige Umwandlung in 18 h: LDCSrum auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,1 mg/mL für die Kaskade Reaktion mit KDO1 und DCCpin auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL für die Kaskade-Reaktion mit KDO2.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien bei 300 u/min für 18 h.</li>
		<li>Führen Sie ein monitoring-Verfahren wie in Schritt 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Methodenentwicklung für die enzymatische Kaskade Reaktion verbindet zwei Hydroxylierung Schritte katalysiert durch αKAOs mit Decarboxylierung katalysiert durch PLP-DC<ol>
<li>Führen Sie Schritte 3.2.1-3.2.2.</li>
		<li>Fügen Sie KDO1 auf eine Endkonzentration von 0,05 mg/mL. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 3h.</li>
		<li>Eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, anhand der ursprünglichen Reaktionsvolumen fügen Sie KDO2 hinzu. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 18 h.</li>
		<li>3.2.5 Schritt ausführen.</li>
		<li>Fügen Sie die gereinigten PLP-DC-DC-Cpin am eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, mit der ursprünglichen Reaktionsvolumen berechnet. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 18 h.</li>
		<li>Führen Sie das monitoring-Verfahren wie in Schritt 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. semi-präparative Eintopfreaktion biokatalytische
Hinweis: Die enzymatische Reaktionen erfolgen auf 0,1 Mmol L-Lysin in einer Open-Air-250 mL Glas Erlenmeyerkolben für ein Gesamtvolumen von 10 mL.
<ol><li>Synthese von Monohydroxylated-Derivaten<ol>
<li>Fügen Sie 0,5 mL 1 M HEPES-Puffer, pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM) in den Kolben. Fügen Sie 1 mL 100 mM L-Lysin (Endkonzentration 10 mM), 1 mL 150 mM α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM Natrium Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM), und 1 mL 10 mM Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM).</li>
		<li>Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 10 mL, unter Berücksichtigung der Volumen der Enzymlösung in Schritt 4.1.3 hinzugefügt werden.</li>
		<li>Fügen Sie die erforderlichen gereinigten αKAO Enzym nach der gezielten Regioselectivity: KDO1 auf eine Endkonzentration von 0,075 mg/mL für Hydroxylierung in Position c-3 oder KDO2 auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/mL für Position c-4 L-Lysin. Die Endkonzentration des gereinigten Enzyms war entschlossen, eine komplette Umwandlung in ca. 3 h zu ermöglichen.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur bei 300 u/min, für die entsprechende Dauer. Wenn die Reaktionskontrolle zeigt eine abgeschlossene Hydroxylierung Reaktion (führen Sie die Schritte, die in Schritt 6 für die Reaktion, die Überwachung Protokoll detailliert), fahren Sie mit Schritt 4.1.5. Eine typische Reaktionszeit ist 3 h.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch αKAO 100 µL 100 mm PLP hinzufügen (Endkonzentration ~ 1 mM). Fügen Sie 100 µL 100 mm DTT (Endkonzentration ~ 1 mM), außer bei Verwendung von LDCSrum.</li>
		<li>Fügen Sie gereinigtes PLP-DC: LDCSrum auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,05 mg/mL für die Kaskade Reaktion mit KDO1 oder DCCpin auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL für die Kaskade-Reaktion mit KDO2.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur, 300 u/min, 18 h und direkt im Schritt 4.3 beschriebenen Schritte weiter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthese der Dihydroxylated Ableitung<ol>
<li>Fügen Sie 0,5 mL 1 M HEPES-Puffer, pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM), 1 mL 100 mM L-Lysin (Endkonzentration 10 mM), 1 mL 150 mM α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM Natrium Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM) , und 1 mL 10 mM Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM). Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 10 mL, unter Berücksichtigung der Volumen der Enzymlösung in Schritt 4.2.2 hinzugefügt werden.</li>
		<li>Eine Endkonzentration von 0,075 mg/mL KDO1 hinzufügen. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur, bei 300 u/min für die entsprechende Dauer.</li>
		<li>Wenn die Reaktionskontrolle zeigt eine abgeschlossene Hydroxylierung Reaktion (siehe Schritt 6 für die Reaktion, die Überwachung Protokoll), fahren Sie mit Schritt 4.2.5. Eine typische Reaktionszeit ist 3 h.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL 150 mM α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM Natrium Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM), und 1 mL 10 mM Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM).</li>
		<li>Eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, anhand der ursprünglichen Reaktionsvolumen fügen Sie KDO2 hinzu. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur bei 300 u/min für 18 h.</li>
		<li>Wenn die Reaktionskontrolle zeigt eine abgeschlossene Dihydroxylation Reaktion (siehe Schritt 6 für die Reaktion, die Überwachung Protokoll), fahren Sie mit Schritt 4.2.7. Eine typische Reaktionszeit beträgt 18 h.</li>
		<li>Hinzufügen von 100 mM von DVB-t 100 µL (Endkonzentration ~ 1 mM), außer bei Verwendung der LDC-Srum.</li>
		<li>Fügen Sie die gereinigten DCCpin am eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, mit der ursprünglichen Reaktionsvolumen berechnet.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur bei 300 u/min für 18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abschrecken<ol>
<li>Das Reaktionsgemisch indem man das Glas 250 mL Erlenmeyerkolben im Eisbad abkühlen.</li>
		<li>Fügen Sie sorgfältig über ca. 1 min., 0,25 mL 6 M HCl durch das abgekühlte Reaktionsgemisch manuell sanft schütteln. Befolgen Sie die gleichen Sicherheitshinweise wie in Schritt 2.1 beschrieben.</li>
		<li>Übertragung der saure Mischung in ein 50 mL konischen Boden Zentrifuge tube mit einem Glas Pasteurpipette ausgestattet mit einer Glühbirne, dann auf 1.680 x g und 4 ° C für 15 min zentrifugieren.</li>
		<li>Zurückziehen des Überstands und in einem 250 mL Rundboden Kolben beiseite stellen.</li>
		<li>Die konischen Boden Zentrifugenröhrchen mit Pellet fügen Sie 10 mL entionisiertem Wasser hinzu. Wirbel, die Pellets wieder auszusetzen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 1.680 x g, 4 ° C für 15 Minuten.</li>
		<li>Zurückziehen des Überstands und fügen Sie es in der 250 mL Rundboden Kolben mit der ersten überstand (Schritt 4.3.4).</li>
		<li>Frieren Sie der gesammelten Überstände durch Eintauchen des Kolbens in flüssigem Stickstoff mit konstanter Hand wirbeln ein, und übertragen Sie die Flasche sofort auf vielfältige Benchtop Einfrieren-Trockner zu verhindern, dass das Material Auftauen.</li>
		<li>Nach Abschluss der Gefriertrocknung (über Nacht), entfernen Sie die Flasche aus der Freeze-Trockner.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Reinigung der Amino-Alkohole aus Rohöl enzymatische Reaktionsmischung
<ol><li>Ionenaustausch-Harz<ol>
<li>Das gefriergetrocknete Produkt in den Mindestbetrag von wässrigen 0,1 M HCl (ca. 4 mL) auflösen bis feste Partikel nicht mehr für das nackte Auge sichtbar sind.</li>
		<li>Zustand eine Sulfonsäure Funktionsgruppe Kationenaustauschermembran Harz, in eine Glassäule (20 x 250 mm) 200-400 Mesh von eluierenden bei atmosphärischem Druck 1 M HCl (4 Spalte Bände) gefolgt von 0,1 M HCl (4 Spalte Bände; Spalte Volumen = 10 mL).</li>
		<li>Laden Sie die Probe sorgfältig an der Spitze des Harzes an den Wänden der Glassäule mit einer Mikropipette 1.000 µL. Spülen Sie die konischen Boden Zentrifugenröhrchen, die das Rohprodukt enthalten dreimal mit 1 mL 0,1 M HCl wässrigen Lösung pro waschen und die daraus resultierende spülen Volumes auf die Säule in der gleichen Weise zu laden.</li>
		<li>Eluieren mit einer nicht-linearen Farbverlauf: 4 Spalte Volumen von 0,1 M HCl, 4 Spalte Volumen Wasser, 4 Spalte Volumen von 5 % NH4OH, 4 Spalte Volumen von 10 % NH4OH, 4 Spalte Volumen von 15 % NH4OH, 4 Spalte Volumen von 20 % NH4OH , 4 Spalte Volumen von 25 % NH4OH und schließlich 4 Spalte Volumen von 28 % NH4OH.</li>
		<li>Die Reinigung mittels HPLC zu überwachen (siehe Schritt 6).</li>
		<li>Bündeln Sie die Fraktionen mit der Verbindung (NH4OH 20-28 %) und Gefriertrocknen Sie beschriebenen Schritte 4.3.8-4.3.9. Hinweis: Die Ionenaustausch Spalte kann nach der Elution mit entionisiertem Wasser zur Neutralisation der Elution Wasser (ca. 50 mL) gefolgt von Aufarbeitung von eluierenden mit 50 mL 1 M HCl wiederverwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SPE<ol>
<li>Lösen Sie die gefriergetrocknete Substanz in ca. 2 mL H3PO4/water (20 µL/mL).</li>
		<li>Statt einer gemischten Modus Kationenaustausch SPE 6 mL-Patrone auf eine Extraktion Verteiler angeschlossen ist eine Wasserpumpe. Zustand der Patrone durch Zeichnung durch 4 mL Methanol unter vermindertem Druck von dem Verteiler zur Verfügung gestellt. Equilibrate die Patrone von Zeichnung bis 4 mL H3PO4/water (20 µL/mL).</li>
		<li>Laden Sie die Probe auf die Patrone mit einem 1.000 µL Mikropipette an der Spitze des Harzes an den Wänden der Glassäule und spülen Sie das Fläschchen mit dem Produkt dreimal mit 0,75 mL H3PO4/water (20 µL/mL) pro Waschgang. Laden Sie die resultierende spülen-Lautstärke auf die Säule auf die gleiche Weise.</li>
		<li>Waschen Sie die Patrone mit der eluierenden unter vermindertem Druck, bereitgestellt durch das mannigfaltige, 4 mL 2 % HCOOH in Wasser, dann mit 4 mL Wasser. Eluieren mit einem Gefälle von NH4OH im Wasser (4 mL für jede Elution, ab 4 % NH4OH: 10 %, 15 %, 15 %, 20 % und 28 %).</li>
		<li>Überwachen Sie die Reinigung mittels HPLC analysiert jede Fraktion nach der Reaktion, die Überwachung Protokoll in Schritt 6 beschrieben. Halten Sie alle Fraktionen, die mit reinen gewünschte Ableitung nach ultravioletter (UV)-Chromatogramm und fahren Sie mit Schritt 5.2.6.</li>
		<li>Pool der Fraktionen mit der gewünschten Verbindung in eine 100 mL Runde untere Kolben, spülen Sie die Rohre mit den Fraktionen mit Wasser und 100 mL Spülung Volume hinzufügen runden unteren Kolben.</li>
		<li>Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit Drehverdampfer ausgestattet mit einem Thermostat Bad Wasserkocher bei 40 ° C und verbunden mit einer Vakuumpumpe auf 10 Mbar eingestellt.</li>
		<li>Lösen Sie der Feststoff in eine Mindestmenge an Wasser und übertragen Sie die Lösung in einer gewogenen 25 mL Runde untere Kolben. Spülen Sie die Flasche mit einem Mindestvolumen von Wasser, 25 mL Flasche spülen Volumen hinzu, und fahren Sie mit Schritt 5.2.9.</li>
		<li>Wiegen Sie das gereinigte Produkt und berechnen Sie die Ausbeute.</li>
		<li>Lösen Sie das gereinigte Produkt in das Mindestvolumen von 2M HCl auf, bis feste Partikel nicht mehr für das nackte Auge sichtbar sind und Gefriertrocknen Sie beschriebenen Schritte 4.3.8-4.3.9. Hinweis: Die Amino-Alkohole sind sensible Verbindungen und als deren Hydrochlorid Salze erhalten bleiben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Reaktionskontrolle und Produktanalyse
<ol><li>Derivatisierung der Substrate und Produkte vor der HPLC-Analytik Hinweis: Die Substrate und Produkte müssen als aromatische Derivate zu erhöhen Sie ihre UV chromatographische Ansprechempfindlichkeit derivatisiert. Wir haben 1-Fluor-2,4-Dinitrobenzene (DNFB). Jede Probe wurde unmittelbar nach Derivatisierung in der HPLC injiziert.<ol>
<li>Nehmen Sie 10 µL der enzymatischen Reaktion und Transfer nach einer 1,5 mL Reaktionscup. Fügen Sie 10 µL von 0,25 M Nahco33 wässrige Lösung, 100 µL Ethanol und 30 µL von 2,5 mg/mL DNFB-Lösung in Ethanol.</li>
		<li>Schließen Sie die Reaktionscup und schütteln Sie die resultierende Lösung für 1 h bei 65 ° C, bei 1.000 u/min. Stillen mit 10 µL 1 M HCl.</li>
		<li>Filtern Sie über einen 4 mm Durchmesser nicht sterile Spritze Filter mit einer 0,22 µm Pore Größe hydrophilen Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran mit einer 1 mL Luer-Spritze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachverfolgung der Dioxygenase Reaktion mit jedem System in der Lage, derivatisierte Aminosäuren zu trennen. Dieses Protokoll beinhaltet UV-Detektion von Aminosäuren, die von den Dinitrobenzene (DNB) Chromophor Gruppe27derivatisiert.<ol>
<li>Passen Sie die HPLC mit C18 mit einer Trimethyl Silyl Endcapping reversed-Phase Säule (5 µm, 3 x 150 mm).</li>
		<li>Equilibrate die C18-Säule mit Laufmittel (30: 70) B (MeCN + 0,1 % TFA), Laufmittel A (H2O + 0,1 % TFA) bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min und 35 ° C für 15 Minuten (entsprechend etwa 20 Spalte Bände).</li>
		<li>10 µL der derivatisierte Reaktionsmischung zu injizieren (siehe Punkt 6.1) auf die HPLC C18-Säule. Verwenden Sie eine Mischung von MeCN, 0,1 % TFA/H2O und 0,1 % TFA als Eluent mit einem linearen Farbverlauf (Verhältnis 30: 70, 70: 30 in 9 min., Temperatur 35 ° C, fließen 1 mL/min).</li>
		<li>Verwenden UV-Detektion setzen bei 400 nm, die Produkte auf der chromatographischen Säule eluiert zu analysieren. DNB-Lysin elutes in der Regel rund 6,5 min, hydroxylierten DNB-Lysin ca. 5,5 min Dihydroxylated DNB-Lysin rund 4,2 min und DNB-Aminodiol rund 5,3 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(7) NMR-Analyse des gereinigten Amino-Alkohole
<ol><li>Gereinigte Amino-Alkohole in D2O auflösen (700 µL) und die Lösung auf einem Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Rohr übertragen.</li>
	<li>Erwerben Sie 1H und 13C-NMR-Spektren nach entsprechenden NMR-Anlage Protokolle28.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Generation+of+Biocatalysts+for+Organic+Synthesis.">New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis.</a> Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).</li><li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysis+in+Organic+Chemistry+and+Biotechnology:+Past,+Present,+and+Future.">Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li><li>Turner, N. J., O'Reilly, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+retrosynthesis.">Biocatalytic retrosynthesis.</a> Nat. Chem. 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Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).</li><li>Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chiral+derivatizing+agents+in+the+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+amino+acid+enantiomers:+a+review.">Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).</li><li>. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy</a> (2017)</li><li>Hibi, M., Ogawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+biotechnology+applications+of+aliphatic+amino+acid+hydroxylases+belonging+to+the+Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent+dioxygenase+superfamily.">Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily.</a> Appl. Microbiol. 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J., Phillips, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+diversity+and+the+structural+basis+of+substrate+specificity+in+the+beta/alpha-barrel+fold+basic+amino+acid+decarboxylases.">Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases.</a> J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).</li><li>Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Enzymes+for+Industrial+Biocatalysis.">Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis.</a> ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Chirale Alkohole Aminosäuren und Derivate haben eine breite Palette von Anwendungen, von chiralen Hilfsmittel für die organische Synthese zur medikamentösen Therapie. Mehrstufigen Synthese zur Herstellung von Amino-Alkohole durch herkömmliche organische Synthese sind zahlreich, aber möglicherweise nicht immer effizient durch mühsame Schutz/Deprotection Schritte zusammen mit eine feinfühlige Steuerung der Stereochemie16. Ein biokatalytische Ansatz, der die Schutz/Deprotection Schritte verzic...

Trotz der Vorteile der Biokatalyse bleibt die Integration der biokatalytische Schritte in synthetischen Wege oder total biokatalytische Routen meist auf enzymatische kinetische Entschließungen beschränkt. Diese Routen haben weithin als ein erster Schritt in asymmetrischen Chemo-enzymatische Synthese, sondern Biokatalyse bietet viel mehr Möglichkeiten in der Funktionsgruppe Interconversions mit hoher Stereoselektivität1,2,3 . Darüber hinaus da biokatalytische Reaktionen unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt werden, ist es daher möglich, Kaskade Reaktionen in einem ein-Topf-Mode4,5durchführen.
Chirale Amino-Alkohole sind vielseitige Moleküle für den Einsatz als Hilfsstoffe oder Gerüste in organische Synthese6. Die amino Alkohol glyko-wird häufig in sekundären Pflanzenstoffen und pharmazeutische Wirkstoffe (API) gefunden. Primären β-amino Alkohole sind leicht zugänglich von der entsprechenden α-Aminosäuren durch konventionelle chemische Synthese, sondern Zugang zu chirale Alkohole γ-amino oder sekundäre amino Alkohole erfordert oft mühsame synthetischen Wege zusammen mit empfindlichen Kontrolle über die Stereochemie7,8,9,10. Aufgrund seiner hohen Stereoselektivität vorsehen Biokatalyse eine überlegene Syntheseweg auf diese chirale Bausteine11,12,13,14.
Wir haben bereits berichtet, die Synthese von Mono - und di-hydroxy-L-Lysines durch enzymatische Hydroxylierung Diastereoselective katalysiert durch Dioxygenases des Eisens (II) / α-Ketoacid-abhängigen Cyclooxygenase Familie (αKAO) (Abbildung 1)15. Vor allem ausgehend von L-Lysin, KDO1 Dioxygenase katalysiert die Bildung von (3S) - hydroxy-Derivat (1), während (4R) - Derivat (2) entsteht durch die Reaktion mit KDO2 Dioxygenase. Aufeinanderfolgenden Regiodivergent Hydroxylations KDO1 und KDO2 führen zur Bildung von (3R, 4R) - Dihydroxy - L-Lysin (3) in optisch reinen Form. Jedoch behindert Bereich begrenzt Substrat dieser Enzyme ihre große Auslastung in der chemischen Synthese, vor allem in die Hydroxylierung von einfachen Aminen, da eine Carbonsäure glyko-in der α-Position der amino-Gruppe für Aktivität16unverzichtbar ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg"> Abbildung 1: biokatalytische Umbauten von L-Lysin. Umwandlung in (3S) - hydroxy - L-Lysin (1) katalysiert durch KDO1 Dioxygenase; (4R) - hydroxy - L-Lysin (2) katalysiert durch KDO2 Dioxygenase; und 3R, 4R- Dihydroxy - L-Lysin (3) durch Kaskade Reaktion katalysiert sukzessive durch KDO1 und KDO2 Dioxygenases. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Decarboxylierung ist eine häufige Reaktion im Stoffwechsel17. Insbesondere Aminosäure DCs (EG 4.1.1) sind Kofaktor-frei (Pyruvoyl-abhängig) oder PLP-abhängige Enzyme und katalysieren die Decarboxylierung von Aminosäuren in den entsprechenden Polyamine in Bakterien und höheren Organismen18,19 , 20 , 21 , 22. die Mono - Dihydroxy Verbindungen (Abbildung 3) 4–7, 10–11 entsprechen hydroxylierten Cadaverin, das Diamin durch Decarboxylierung von L-Lysin erhalten. Cadaverin ist ein wichtiger Baustein für die chemische Industrie, speziell eine Komponente von Polyamid und Polyurethan Polymere. Daher biobasierte Herstellung von diesem Diamin aus nachwachsenden Rohstoffen hat Aufmerksamkeit als Alternative zum Erdöl-basierten Weg, und verschiedene Mikroorganismen haben für diesen Zweck entwickelt worden. In diese Stoffwechselwege ist Lysin DC (LDC) das Schlüsselenzym. LDC ist ein PLP-abhängige Enzym, Alanin Racemase (AR) strukturelle Familie23angehören. PLP-Abhängige DCs (PLP-DCs) sind dafür bekannt, hochspezifische Substrat sein. Jedoch wenige Enzyme besitzen die Fähigkeit, leichten Promiskuität, aktiv in Richtung L-Ornithin und L-Lysin Aminosäuren, wie zum Beispiel das LDC aus Selenomonas Rumirantium (LDCSrum), die hat ähnlicher kinetische Konstanten für Lysin und Ornithin zu Decarboxylierung24,25. Dieses erweiterte Substrat Spezifität macht dieses Enzym einen guten Kandidat für die Decarboxylierung von Mono - und di-hydroxy-L-Lysin. Darüber hinaus untersucht, um DCs aktiv in Richtung der Hydroxyl-Derivate von Lysin finden, wir die genomische Kontext der Gene kodieren die αKAO Enzyme. In der Tat sind in prokaryotischen Genomen die Genen Codierung an der gleichen biosynthetische Bahn beteiligten Enzyme in der Regel in gen-Cluster Co lokalisiert. Gens KDO2 (von Chitinophaga Pinensis) fand man zusammen mit einem Gen Kodierung vermeintliche PLP-DC (Abbildung 2) lokalisiert. Im Gegensatz dazu ist keine gen-Codierung für DC gefunden worden, bei der Analyse von genomischen Rahmen KDO1 Dioxygenase. Das PLP-DC-Protein aus C. Pinensis (DCCpin) wurde daher als ein viel versprechender Kandidat ausgewählt, um die Decarboxylierung Schritt der Kaskade Reaktion katalysieren.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg"> Abbildung 2: genomische Kontext des KDO2-Gens in C. Pinensis. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Infolgedessen haben wir entwickelt enzymatische Kaskade Reaktionen, Dioxygenases und DCs, die Synthese von aliphatischen chiralen β - und γ-amino Alkohole aus Aminosäuren (Abbildung 3) zu erreichen. Wie bereits berichtet führt die C-H-Oxidation, katalysiert durch die αKAO die Hydroxyl ersetzt Stereogenic Mitte mit insgesamt Diastereoselectivity; die Cβ/γ Chiralität erhalten im decarboxylative Schritt betrifft nur das Cα Carbon der Aminosäure glyko-16.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg"> Abbildung 3: Analyse der retrosynthetischen. (A) Retrosynthesis β - und γ-amino Alkohole (R) - 1,5 - Diaminopentan-2-Ol (4) (5R) - hydroxy - L-Lysin, und (S) - 1,5 - Diaminopentan-2-Ol (5) und 1,5-Diaminopentan-3-Ol (6) aus L-Lysin. (B) Retrosynthesis β, γ und δ-amino Diole (2S, 3S) β - 1,5 - Diaminopentane-2,3-Diol (10) und (2R, 4S) - 1,5 - Diaminopentane-2,4-Diol (11) ab (5R)- Hydroxy-L-Lysin, und 2R, 3R- 1,5 - Diaminopentane-2,3-Diol (7) ab L-Lysin. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
L-Lysin und seine (5R) ab-hydroxy-Derivat, berichten wir hierin eine zwei/drei Schritt, einen Topf, enzymatischen Verfahren, die Kombination von Dioxygenases und PLP-DCs, das Ziel Amino-Alkohole zu erhalten. Vor der Synthese im Labormaßstab der Zielmoleküle, die Methode wurde entwickelt auf der analytischen Ebene Anpassung der Reaktionsbedingungen, z.B., die Enzymkonzentrationen erforderlich, um vollständige Umwandlung der Ausgangsstoffe; ermöglichen Wir präsentieren dieses Verfahrens sowie.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>(5&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-hydroxy-L-lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GPS NONH</td><td>Out sourcing</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-ketoglutaric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75892</td><td></td></tr><tr><td>Sodium ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate</td><td>Acros</td><td>201370250</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal phosphate (PLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82870</td><td></td></tr><tr><td>3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1529</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20825.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71631</td><td></td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td></td></tr><tr><td>HCl 0.1M</td><td>Fluka</td><td>35335</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83640.320</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-trifluoroacetic acid</td><td>VWR</td><td>153112E</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia 28%</td><td>VWR</td><td>21182.294</td><td></td></tr><tr><td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.32</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Acros</td><td>270480010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid 85%</td><td>Acros</td><td>201145000</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Acros</td><td>320,710,075</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>C18 HPLC column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4601-Y0</td><td></td></tr><tr><td>Accela UHPLC System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accela PDA detector</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4mm syringe filters - 0,22&amp;micro;m - PVDF</td><td>Merck</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip</td><td>VWR</td><td>HSWA5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Cation exchange resin 100-200&amp;nbsp;mesh</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217506</td><td></td></tr><tr><td>Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL</td><td>Waters</td><td>186000776</td><td></td></tr><tr><td>Extraction manifold</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td>531-0103</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer alpha 1-2 LDplus</td><td>Christ</td><td>L083302</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000031</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000074</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 500 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000112</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000120</td><td></td></tr><tr><td>300 MHz spectrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL microtube</td><td>CLEARLine</td><td>CL20.002.0500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical-bottom centrifuge tube</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>25 mL round-bottom flask 14/23</td><td>Fischer Scientific</td><td>10353331</td><td></td></tr><tr><td>100 mL round-bottom flask 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL round-bottom flask 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL erlenmeyer flask</td><td>Fischerbrand</td><td>15496143</td><td></td></tr></tbody></table>

enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine

Amino-Alkohole sind vielseitige Verbindungen mit einer Vielzahl von Anwendungen. Beispielsweise haben sie als chirale Gerüste in der organischen Synthese eingesetzt. Ihre Synthese von herkömmlichen organischen Chemie erfordert oft mühsame mehrstufigen Syntheseverfahren mit schwierigen Steuerung der stereochemischen Ausgang. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zum enzymatisch Programmbenutzer Amino-Alkohole leicht verfügbaren L-Lysin in 48 h ab. Dieses Protokoll verbindet zwei chemische Reaktionen, die sehr schwer von herkömmlichen organischen Synthese durchzuführen sind. Bei der ersten Schritt, der Regio und Diastereoselective Oxidation von einer nicht aktivierten C-H-Bindung der Lysin ist-Seitenkette durch ein Dioxygenase katalysiert; eine zweite Regio und Diastereoselective Oxidation, katalysiert durch ein Regiodivergent-Dioxygenase führt zur Bildung von 1,2-Diole. Im letzten Schritt ist die carboxylic Gruppe der alpha Aminosäure durch eine Pyridoxal-Phosphat (PLP)-Decarboxylase (DC) abgespalten. Dieser decarboxylative Schritt betrifft nur die alpha Kohlenstoff der Aminosäure, Beibehaltung der Hydroxyl ersetzt Stereogenic Mitte in der Beta/Gamma-Lage. Die daraus resultierende Amino-Alkohole sind daher optisch bereichert. Das Protokoll wurde auf der Semipreparative-Skala-Synthese von vier Amino-Alkohole erfolgreich angewendet. Überwachung der Reaktionen wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) nach Derivatisierung von 1-Fluor-2,4-Dinitrobenzene durchgeführt. Einfache Reinigung durch Festphasen-Extraktion (SPE) gewährt die Amino-Alkohole mit sehr guten Ausbeuten (93 %, > 95 %).

Wir haben bereits berichtet, die Synthese von Mono - und di-hydroxy-L-Lysines durch enzymatische Hydroxylierung Diastereoselective katalysiert durch Dioxygenases des Eisens (II) / αKAO Familie (Abbildung 1)16. Um das Protokoll der gesamten Kaskaden das hier vorgestellte zu optimieren, die ein oder zwei Hydroxylierung Schritte katalysiert durch ein αKAO gefolgt von einer Decarboxylierung Schritt katalysiert durch ein PLP-DC verbinden,...

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Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Chirale Amino-Alkohole sind vielseitige Moleküle für den Einsatz als Gerüste in der organischen Synthese. Ausgehend von L-Lysin, synthetisieren wir amino Alkohole durch eine enzymatische Kaskade Reaktion kombiniert Diastereoselective C-H-Oxidation katalysiert durch Dioxygenase gefolgt von Spaltung der Carbonsäure glyko-der entsprechenden Hydroxyl Aminosäure durch eine Decarboxylase.

Enzymatische Kaskade Reaktionen für die Synthese von chirale Alkohole Aminosäure L-Lysin

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

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12.0K Aufrufe.  CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay. Chirale Amino-Alkohole sind vielseitige Moleküle für den Einsatz als Gerüste in der organischen Synthese. Ausgehend von L-Lysin, synthetisieren wir amino Alkohole durch eine enzymatische Kaskade Reaktion kombiniert Diastereoselective C-H-Oxidation katalysiert durch Dioxygenase gefolgt von Spaltung der Carbonsäure glyko-der entsprechenden Hydroxyl Aminosäure durch eine Decarboxylase.

Serie: Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Vorbereitung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Verwendung eines aktivitätsbasierte Sonde für<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Säure Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Forschung

Biochemie

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Eine effiziente Methode zur Synthese von Peptoide mit gemischten Lysine-Typ / Arginin-Monomeren und die Bewertung der Anti-Leishmania-Aktivität

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Hydrolyse eines Ni-Schiff-Base-Komplex unter Verwendung von Bedingungen, die für Retention von säurelabilen Schutzgruppen

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Highly Stereoselective Synthesis of 1,6-Ketoesters Mediated by Ionic Liquids: A Three-component Reaction Enabling Rapid Access to a New Class of Low Molecular Weight Gelators

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form catalytically active N-Heterocyclic Carbenes (NHCs). Here we have used ILs as precatalysts in the addition of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes to chalcones to form 1,6-ketoesters, incorporating an anti-diphenyl moiety in a highly stereoselective fashion. The reaction has a broad substrate scope and several functional groups and heteroaromatics can be integrated into the ketoester backbone in generally good yields with maintained stereoselectivity. The reaction protocol is robust and scalable. The starting materials are inexpensive and the products can be obtained after simple filtration, avoiding solvent-demanding chromatography. Furthermore, the IL can be recycled up to 5 times without any loss of reactivity. Moreover, the 1,6-ketoester end product is a potent gelator in several hydrocarbon based solvents. The method enables rapid access to and evaluation of a new class of low molecular weight gelators (LMWGs) from recyclable and inexpensive starting materials.

Ionic liquids (ILs) mediate fast, simple and cheap access to 1,6-ketoesters in high diastereoselectivities and good yields. The reaction protocol is robust and the 1,6-ketoesters can be obtained in gram scale after a simple filtration protocol. Moreover, the 1,6-ketoesters are potent gelators in hydrocarbon solvents.

Hochstereoselektive Synthese von 1,6-Ketoester durch Ionische Flüssigkeiten vermittelte: Ein Dreikomponentenreaktion zur raschen Zugang zu einer neuen Klasse von niedermolekularen Gelbildner

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form ...

Chemie

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Efficient Construction of Drug-like Bispirocyclic Scaffolds Via Organocatalytic Cycloadditions of &#945;-Imino &#947;-Lactones and Alkylidene Pyrazolones

Bispirocyclic scaffolds are one of the important structural subunits in many natural products that exhibit diverse and attractive biological activities. Recently, we have developed an efficient organocatalytic strategy, which provides facile access to a variety of enantiomerically enriched bispiro[&#947;-butyrolactone-pyrrolidin-4,4&#39;-pyrazolone] skeletons. In this paper, we demonstrate a detailed protocol for the asymmetric synthesis of drug-like bispirocyclic compounds with two spirocyclic carbon centers via an organocatyltic 1,3-dipolar cycloaddition reaction. Spirocyclization synthons &#945;-imino &#947;-lactones and alkylidene pyrazolones are prepared first, which are then subjected to a cycloaddition reaction in the presence of a bifunctional squaramide organocatalyst to afford the desired bispirocycles in high yields and excellent stereoselectivities. Chiral high-performance liquid chromatography (HPLC) is carried out to determine the enantiomeric purity of the products, and the d.r. value is examined by proton nuclear magnetic resonance (1H NMR). The absolute configuration of the product is assigned according to an X-ray crystallographic analysis. This synthetic strategy allows scientists to prepare a diversity of bispirocyclic scaffolds in high yields and excellent diastereo- and enantioselectivities.

Enantiomerically enriched bispiro[&#947;-butyrolactone-pyrrolidin-4,4&#39;-pyrazolone] skeletons are asymmetrically synthesized through a simple organocatalytic 1,3-dipolar cycloaddition reaction.

Energieeffizientes bauen Drogen wie Bispirocyclic Gerüste über Organocatalytic Cycloadditions von α-Imino γ-Lactone und Alkylidene Pyrazolones

Bispirocyclic scaffolds are one of the important structural subunits in many natural products that exhibit diverse and attractive biological activities. ...

Preparation of Enantiopure Non-Activated Aziridines and Synthesis of Biemamide B, D, and epiallo-Isomuscarine

Nitrogen-containing heterocycle aziridines are synthetically very valuable for the preparation of azacyclic and acyclic molecules. However, it is very difficult and laborious to make aziridines in optically pure forms on a large scale to apply asymmetric synthesis of aza compounds. Fortunately, we successfully achieved both enantiomers (2R)- and (2S)-aziridine-2-carboxylates with the electron-donating &#945;-methylbenzyl group at the ring nitrogen as non-activated aziridines. These starting aziridines have two distinct functional groups-highly reactive three-membered ring and versatile carboxylate. They are applicable in ring-opening or ring-transformation with aziridine and in functional group transformation to others from carboxylate. Both of these enantiomers were utilized in the preparation of biologically important amino acyclic and/or aza-heterocyclic compounds in an asymmetric manner. Specifically, this report describes the first expedient asymmetric synthesis of both enantiomers of 5, 6-dihydrouracil-type marine natural products biemamide B and D as potential TGF-&#946; inhibitors. This synthesis consisted of regio- and the stereoselective ring-opening reaction of aziridine-2-carboxylate and subsequent formation of 4-aminoteterahydropyrimidine-2,4-dione. One more example in this protocol dealt a highly stereoselective Mukaiyama reaction of aziridine-2-carboxylate and silyl enol ether, following intramolecular aziridine ring-opening to provide easy and facile access to (-)-epiallo-isomuscarine.

Preparation of Enantiopure Non-Activated Aziridines and Synthesis of Biemamide B, D, and epiallo-Isomuscarine

In this study, we prepare both enantiomers of aziridine-2-carboxylate, which are used in the asymmetric synthesis of alkaloids, including biemamide B and D, and (-)-epiallo-isomuscarine.

Herstellung von enantiopuren nicht-aktivierten Aziridinen und Synthese von Biemamid B, D und Epiallo-Isomuscarin

Nitrogen-containing heterocycle aziridines are synthetically very valuable for the preparation of azacyclic and acyclic molecules. However, it is very ...

Organocatalysis

Source: Vy M. Dong and Faben Cruz, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
This experiment will demonstrate the concept of organocatalysis by illustrating the proper setup of a reaction that utilizes enamine catalysis. Organocatalysis is a form of catalysis that uses substoichiometric amounts of small organic molecules to accelerate reactions. This type of catalysis is complementary to other forms of catalysis such as transition metal or biocatalysis. Transition metal catalysis involves transition metals as catalysts and biocatalysis uses enzymes as catalysts. Some advantages of organocatalysis include the low toxicity and cost of the organocatalysts in comparison to many metal catalysts. In addition, most organocatalysts are not sensitive to air and moisture, unlike metal catalysts. In contrast to enzymes found in living organisms, the small molecules that act as organocatalysts are typically easy to access. Furthermore, organocatalysis offers complementary and new reactivity not observed with other forms of catalysis.

Organocatalysis: Principles and Applications

Organokatalyse

Source: Vy M. Dong and Faben Cruz, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
This experiment will demonstrate the concept of ...

Lehre

JoVE Science Education

Organische Chemie II

Acid Halides to Esters: Alcoholysis

Alcoholysis is a nucleophilic acyl substitution reaction in which an alcohol functions as a nucleophile. Acid halides react with alcohol to produce esters. The mechanism proceeds in three steps:
<ol>
	<li>First, the alcohol acts as a nucleophile and attacks the acyl carbon to form a tetrahedral intermediate.</li>
	<li>Next, the carbonyl re-forms with the loss of a chloride ion.</li>
	<li>Lastly, the positively charged intermediate loses a proton to give an ester as the final product along with H3O+, making HCl an overall byproduct of the reaction.</li>
</ol>
<img alt="Figure1" src="/files/ftp_upload/12362/12362_PT_Figure_1.svg" style="text-align: center; height: 200px;" />
Pyridine is used as a base to neutralize the acidic reaction mixture.
Alcoholysis of sulfonyl chlorides follows a similar pattern and forms sulfonic acid esters.
<img alt="Figure2" src="/files/ftp_upload/12362/12362_PT_Figure_2.svg" style="text-align: center; height: 75px;" />

Säurehalogenide zu Estern: Alkoholyse

Alcoholysis is a nucleophilic acyl substitution reaction in which an alcohol functions as a nucleophile. Acid halides react with alcohol to produce ...