Gli autori ringraziano Véronique de Berardinis per la proficua discussione e Alain Perret, Christine Pellé e Peggy Sirvain per il supporto tecnico.

1. prodotto enzimatico
<ol><li>Esprimere e purificare proteine come descritto in precedenza26. Nota: Proteine ricombinanti sono stati ottenuti con le seguenti concentrazioni finali: αKAO da Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO da c. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL; PLP-DCs da S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), Estratto di cellulare gratis con enzima totale 12,44 mg/ml; PLP-DC da c. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCCpin), 2,62 mg/mL.</li>
</ol>2. preparazione delle soluzioni
Nota: Tutte le soluzioni qui sotto vengono preparate in acqua deionizzata.
<ol><li>Preparare 1 M di tampone HEPES, pH 7.5; regolare con 5 M di NaOH. Nota: Durante la fase di regolazione del pH, indossare guanti protettivi, indumenti protettivi, occhiali protettivi e protezioni per il viso (P280). In caso di contatto con gli occhi (P305, P351, P338), sciacquare accuratamente con acqua per diversi minuti rimuovere lenti a contatto se possibile. Continuare a sciacquare e contattare immediatamente un centro antiveleni o un medico (P310). Il codice di P si riferisce alla dichiarazione precauzionale (pericolo classe e categoria; Vedi, ad esempio, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).</li>
	<li>Preparare 100 mM L-lisina, 100 mM (5S) - idrossi - L-lisina, acido α-chetoglutarico 150mm, ascorbato di sodio 100 mM, 10 mM ammonio ferro (II) solfato esaidrato (sale di Mohr), 100 mM 5-fosfato del piradossale (PLP) e 100 mM dithiothreitol (DTT).</li>
	<li>Preparare 1 M, 2M e 6M di acido cloridrico (HCl) da una soluzione di HCl 37% (circa 12 M soluzione), seguendo le stesse istruzioni di sicurezza come quelli descritti al punto 2.1. Nota: Le soluzioni di acido α-chetoglutarico, ascorbato di sodio e d'ammonio ferro (II) solfato esaidrato devono essere fatta fresche il giorno di utilizzo. La soluzione di lisina può essere conservata per diversi mesi a temperatura ambiente. La soluzione PLP può essere conservata per un mese a 4 ° C. La soluzione DTT può essere conservata per un mese a-20 ° C.</li>
</ol>3. scala analitica reazioni
<ol><li>Lo sviluppo di metodi per la reazione di decarbossilazione (5R) - idrossi - L-lisina<ol>
<li>11 µ l di soluzione 1 M di HEPES buffer pH 7,5 (concentrazione finale di 50 mM) ad una microprovetta da 2 mL. Quindi, 22 µ l di 100 mM (5S) - idrossi - L-lisina (concentrazione finale 10 mM), 2,2 µ l di 100 mM PLP (concentrazione finale di 1 mM) e 2,2 µ l di 100 mM DTT (concentrazione finale 1 mM). Nota: In caso di reazione con LDCSrum, l'aggiunta di DTT non è necessario.</li>
		<li>Aggiungere il PLP-DC purificato (concentrazione finale 0,1 mg/mL). Completare con H2O per un volume finale di 220 µ l.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 3 h. Nota: Agitando la miscela di reazione con un coperchio aperto aria aperta garantisce una buona ossigenazione di mezzi di reazione. Non è pertanto necessario di bolla di ossigeno nei mezzi di reazione.</li>
		<li>Raccogliere 10 µ l di miscela di reazione per essere analizzati secondo la procedura di controllo di reazione descritta nel passaggio 6. I campioni sono preferibilmente derivatizzati e analizzati direttamente dopo il campionamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sviluppo di metodi per la reazione di cascata enzimatica che unisce un passo di idrossilazione catalizzato da αKAO con decarbossilazione catalizzata da PLP-DC<ol>
<li>11 µ l di 1 M di tampone a pH HEPES 7,5 (concentrazione finale di 50 mM) ad una microprovetta da 2 mL. Quindi, 22 µ l di 150 mM di acido α-chetoglutarico (concentrazione finale 15 mM), 5,5 µ l di 100 mM di ascorbato di sodio (concentrazione finale 2,5 mM), 22 sale di µ l di 10 mM di Mohr (concentrazione finale 1 mM) e 22 µ l di 100 mM di L-lisina (concentrazione finale 10 mM).</li>
		<li>Completare con H2O per un volume finale di 220 µ l, prendendo in considerazione il volume della soluzione enzimatica per essere aggiunto al punto 3.2.3.</li>
		<li>Aggiungere l'enzima richiesto αKAO purificato secondo la regioselettività mirati: KDO1 per idrossilazione in posizione C-3 o KDO2 per posizione C-4 di L-lisina. La concentrazione finale dell'enzima purificato (0.05-0.5 mg/mL) è stato determinato per consentire una completa conversione in circa 3 h.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 3 h.</li>
		<li>2,2 µ l di 100 mM di PLP (concentrazione finale ~ 1 mM) e 2,2 µ l di 100 mM di DTT (concentrazione finale ~ 1 mM). Nota: In caso di reazione con LDCSrum, l'aggiunta di DTT non è necessario.</li>
		<li>Aggiungere il PLP-DC purificate ad una concentrazione che consente la completa conversione in 18 h: LDCSrum ad una concentrazione finale approssimativa di 0,1 mg/mL per la reazione di cascata con KDO1 e DCCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL per la cascata di reazione con KDO2.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto aria aperta a 300 giri/min per 18 h.</li>
		<li>Eseguire una procedura di controllo come descritto al punto 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sviluppo di metodi per la reazione di cascata enzimatica combinando due fasi di idrossilazione catalizzate da αKAOs con decarbossilazione catalizzata da PLP-DC<ol>
<li>Eseguire passaggi 3.2.1-3.2.2.</li>
		<li>Aggiungi KDO1 ad una concentrazione finale di 0,05 mg/mL. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 3h.</li>
		<li>Aggiungi KDO2 ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 18 h.</li>
		<li>Eseguire il punto 3.2.5.</li>
		<li>Aggiungere il PLP-DC DC purificataCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 18 h.</li>
		<li>Eseguire la procedura di controllo come descritto al punto 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. semi-preparatorio One-pot biocatalitici reazione
Nota: Le reazioni enzimatiche avvengono su 0,1 mmol di L-lisina in un vetro all'aperto 250 mL flacone erlenmeyer per un volume totale di 10 mL.
<ol><li>Sintesi dei derivati monoidrossilati<ol>
<li>Aggiungere 0,5 mL di tampone HEPES di 1 M, pH 7.5 (concentrazione finale di 50 mM) al pallone. Quindi, aggiungere 1 mL di 100 mM L-lisina (concentrazione finale 10 mM), 1 mL di acido α-chetoglutarico 150 mM (concentrazione finale 15 mM), 0,25 mL di ascorbato di sodio 100 mM (concentrazione finale 2,5 mM), e sale di 1 mL di 10mm Mohr (concentrazione finale 1 mM).</li>
		<li>Completare con H2O per un volume finale di 10 mL, prendendo in considerazione il volume della soluzione enzimatica per essere aggiunto al punto 4.1.3.</li>
		<li>Aggiungere l'enzima richiesto αKAO purificato secondo la regioselettività mirati: KDO1 ad una concentrazione finale di 0,075 mg/mL per idrossilazione in posizione C-3 o KDO2 ad una concentrazione finale di 0,5 mg/mL per posizione C-4 di L-lisina. La concentrazione finale dell'enzima purificato è stata determinata per consentire una completa conversione in circa 3 h.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per la durata appropriata. Quando il monitoraggio di reazione indica una reazione di idrossilazione completato (eseguita tutti i passaggi dettagliati nel passaggio 6 per il protocollo di monitoraggio della reazione), passare al punto 4.1.5. Un tempo di reazione tipico è 3h.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di 100 mM PLP per la miscela di reazione αKAO (concentrazione finale ~ 1 mM). Quindi, aggiungere 100 µ l di 100 mM DTT (concentrazione finale ~ 1 mM), tranne quando si utilizza LDCSrum.</li>
		<li>Aggiungere purificata PLP-DC: LDCSrum ad una concentrazione finale approssimativa di 0,05 mg/mL per la reazione di cascata con KDO1 o DCCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL per la reazione di cascata con KDO2.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, 300 giri/min, per 18 h e continuare direttamente per le operazioni descritte al punto 4.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sintesi del derivato dihydroxylated<ol>
<li>Aggiungere 0,5 mL di tampone HEPES di 1 M, pH 7.5 (concentrazione finale 50 mM), 1 mL di 100 mM L-lisina (concentrazione finale 10 mM), 1 mL di acido α-chetoglutarico 150 mM (concentrazione finale 15 mM), 0,25 mL di ascorbato di sodio 100 mM (concentrazione finale 2,5 mM) , e sale di 1 mL di 10mm Mohr (concentrazione finale di 1 mM). Completare con H2O per un volume finale di 10 mL, prendendo in considerazione il volume della soluzione enzimatica per essere aggiunto al punto 4.2.2.</li>
		<li>Aggiungere KDO1 a una concentrazione finale di 0,075 mg/mL. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per la durata appropriata.</li>
		<li>Quando il monitoraggio di reazione indica una reazione di idrossilazione completata (vedere il passaggio 6 per il protocollo di monitoraggio della reazione), passare al punto 4.2.5. Un tempo di reazione tipico è 3h.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di acido α-chetoglutarico 150 mM (concentrazione finale 15 mM), 0,25 mL di ascorbato di sodio 100 mM (concentrazione finale 2,5 mM), e sale di 1 mL di 10mm Mohr (concentrazione finale di 1 mM).</li>
		<li>Aggiungi KDO2 a una concentrazione finale approssimativo di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per 18 h.</li>
		<li>Quando il monitoraggio di reazione indica una reazione diidrossilazione completata (vedere il passaggio 6 per il protocollo di monitoraggio della reazione), procedere con il passo 4.2.7. Un tempo di reazione tipico è 18 h.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di 100 mM di DTT (concentrazione finale ~ 1 mM), tranne quando si utilizza la LDCSrum.</li>
		<li>Aggiungere la DC purificataCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per 18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tempra<ol>
<li>Raffreddare la miscela di reazione posizionando il vetro 250 mL flacone erlenmeyer in un bagno di ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere con cautela, sopra circa 1 min, 0,25 mL di 6 M HCl agitando manualmente delicatamente la miscela di reazione raffreddata. Seguire le stesse istruzioni di sicurezza come quelli descritti al punto 2.1.</li>
		<li>Trasferimento la miscela acida in una centrifuga di fondo conico 50ml tubo usando un vetro pipetta Pasteur equipaggiato con una lampadina, quindi centrifugare a 1.680 x g e a 4 ° C per 15 min.</li>
		<li>Prelevare il supernatante e tenere da parte in un pallone da 250 mL.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di acqua deionizzata alla centrifuga a fondo conico contenente il pellet. Vortice per risospendere il pellet.</li>
		<li>Centrifuga a 1.680 x g, 4 ° C, per 15 min.</li>
		<li>Prelevare il supernatante e aggiungerlo il pallone a sfondo sferico 250 mL contenente il surnatante primo (punto 4.3.4).</li>
		<li>Congelare i surnatanti raccolti mediante immersione del pallone nell'azoto liquido con mano costante vorticoso e trasferire immediatamente il pallone ad un collettore di benchtop liofilizzatore per impedire al materiale di scongelamento.</li>
		<li>Al termine il processo di liofilizzazione (una notte), togliere il matraccio dal liofilizzatore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. purificazione di Amino alcoli dalla miscela di reazione enzimatica grezzo
<ol><li>Resina a scambio ionico<ol>
<li>Sciogliere il prodotto liofilizzato nella quantità minima di acquosa 0,1 M di HCl (circa 4 mL) fino a quando le particelle solide non sono visibili a occhio nudo.</li>
		<li>Condizione di una resina a scambio cationico gruppo funzionale acido solfonico, 200-400 mesh, in una colonna di vetro (20 x 250 mm) di eluizione a pressione atmosferica 1M HCl (volumi di colonna 4) seguita da 0.1 M HCl (4 volumi di colonna; colonna volume = 10 mL).</li>
		<li>Caricare l'esempio con attenzione nella parte superiore della resina sulle pareti della colonna vetro utilizzando una micropipetta di 1.000 µ l. Poi, risciacquare la provetta da centrifuga a fondo conico che conteneva il prodotto grezzo tre volte con 1 mL 0,1 M di soluzione acquosa di HCl per lavare e caricare i volumi di risciacquo risultante sulla colonna nello stesso modo.</li>
		<li>Eluire con un non-lineare gradiente: 4 volumi di colonna di 0.1 M HCl, 4 volumi di colonna d'acqua, 4 volumi di colonna di 5% NH4OH, 4 volumi di colonna di 10% NH4OH, 4 volumi di colonna di 15% NH4OH, 4 volumi di colonna di 20% NH4OH , 4 volumi di colonna di 25% NH4OH e infine 4 colonna volumi del 28% NH4OH.</li>
		<li>Monitorare la purificazione mediante HPLC (Vedi punto 6).</li>
		<li>Piscina le frazioni contenenti il composto (NH4OH 20-28%) e liofilizzare come descritto nella procedura 4.3.8-4.3.9. Nota: La colonna di scambio ionico può essere riutilizzata dopo eluizione con acqua deionizzata alla neutralizzazione delle acque di eluizione (approssimativamente. 50 mL) seguita da ricondizionamento di eluizione con 50 mL di 1 M di HCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SPE<ol>
<li>Solubilizzare il composto liofilizzato in circa 2 mL di H3PO4/acqua (20 µ l/mL).</li>
		<li>Posto una modalità mista scambio cationico SPE 6 mL-cartuccia su un collettore di aspirazione collegata ad una pompa di acqua. Condizione della cartuccia di disegno attraverso 4 mL di metanolo sotto pressione ridotta collegata al collettore. Equilibrare la cartuccia disegnando attraverso 4 mL di H3/4acqua PO (20 µ l/mL).</li>
		<li>Caricare l'esempio sulla cartuccia utilizzando una micropipetta di 1.000 µ l nella parte superiore della resina sulle pareti della colonna di vetro e risciacquare la fiala contenente il prodotto tre volte con 0,75 mL di H3PO4/acqua (20 µ l/mL) a lavaggio. Caricare il relativo volume di risciacquo sulla colonna nello stesso modo.</li>
		<li>Lavare la cartuccia di eluizione sotto pressione ridotta, collegata al collettore, 4 mL di 2% HCOOH in acqua, poi con 4 mL di acqua. Eluire con una sfumatura di NH4OH in acqua (4 mL per ogni eluizione, a partire da 4% NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% e 28%).</li>
		<li>Monitorare la purificazione mediante HPLC analizzando ciascuna frazione secondo il protocollo descritto nel passaggio 6 di monitoraggio della reazione. Tenere tutte le frazioni contenenti puro derivato desiderato secondo cromatogramma di raggi ultravioletto (UV) e procedere con il passo 5.2.6.</li>
		<li>Pallone a piscina le frazioni contenenti il desiderato composto in un pallone da 100 mL, sciacquare le provette contenenti le frazioni con acqua e aggiungere il volume di risciacquo a 100 mL.</li>
		<li>Rimuovere il solvente sotto pressione ridotta mediante un evaporatore rotante dotata di un bollitore di bagno termostato acqua a 40 ° C e collegato ad una pompa di vuoto impostato a 10 mbar.</li>
		<li>Solubilizzare il solido in un volume minimo di acqua e trasferire la soluzione in un pallone da pesato 25 mL. Risciacquare la beuta con un volume minimo di acqua, aggiungere il volume di risciacquare il matraccio da 25 mL e procedere con il passo 5.2.9.</li>
		<li>Pesare il prodotto purificato e calcolare il rendimento.</li>
		<li>Sciogliere il prodotto purificato del volume minimo di 2M di HCl fino a particelle solide non sono visibili a occhio nudo e liofilizzare come descritto nella procedura 4.3.8-4.3.9. Nota: La amino alcoli sono composti sensibili e sono tenute come loro sali cloridrato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. reazione di monitoraggio e analisi del prodotto
<ol><li>Derivatizzazione di substrati e prodotti prima dell'analisi HPLC Nota: I substrati e i prodotti devono essere derivatizzati come derivati aromatici per aumentare la loro detectivity cromatografica di UV. Abbiamo usato 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB). Ogni campione è stato iniettato in HPLC immediatamente dopo derivatizzazione.<ol>
<li>Prendere 10 µ l della reazione enzimatica e il trasferimento ad una microprovetta 1,5 mL. Aggiungere 10 µ l di 0,25 M di NaHCO3 soluzione acquosa, 100 µ l di etanolo e 30 µ l di 2,5 mg/mL di soluzione DNFB in etanolo.</li>
		<li>Chiudere la provetta e agitare la soluzione risultante per 1 h a 65 ° C, a 1000 giri/min. Dissetare con 10 µ l 1 M di HCl.</li>
		<li>Filtrare su un filtro di siringa non sterile di diametro 4 mm con una membrana da 0,22 µm poro dimensione idrofila polivinilidene fluoruro (PVDF) utilizzando una siringa da 1 mL Luer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esegue il monitoraggio della reazione diossigenasi utilizzando qualsiasi sistema in grado di separare gli amminoacidi derivatizzati. Questo protocollo comprende rilevazione UV di amminoacidi derivatizzati dai gruppo cromoforo del dinitrobenzene (DNB)27.<ol>
<li>Montare l'HPLC con C18 con una colonna a fase inversa endcapping Silile trimetil (5 µm, 3 x 150 mm).</li>
		<li>Equilibrare la colonna C18 con l'eluente (30: 70) B (MeCN + 0,1% TFA) di eluente A (H2O + 0,1% TFA) ad un flusso di 1 mL/min e 35 ° C per 15 min (corrispondenti a circa 20 volumi di colonna).</li>
		<li>Iniettare 10 µ l della miscela di reazione derivatizzata (vedere punto 6.1) sulla colonna HPLC C18. Utilizzare una miscela di MeCN, 0,1% TFA/H2O e 0,1% TFA come eluente con una sfumatura lineare (rapporto 30: 70 a 70: 30 a 9 min, temperatura 35 ° C, portata 1 mL/min).</li>
		<li>Utilizzare la rilevazione UV fissato a 400 nm di analizzare i prodotti eluiti sulla colonna cromatografica. DNB-lisina eluisce in genere circa 6,5 min, idrossilato DNB-lisina circa 5,5 min, dihydroxylated DNB-lisina circa 4,2 min e DNB-aminodiol circa 5,3 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. NMR Analysis di purificato Amino alcoli
<ol><li>Sciogliere purificate amminoalcoli in D2O (700 µ l) e trasferire la soluzione in un tubo di risonanza magnetica nucleare (NMR).</li>
	<li>Acquisire 1H e spettri NMR C 13secondo appropriato NMR struttura protocolli28.</li>
</ol>

<ol>
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Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).</li><li>Kohls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Access+to+All+Four+Diastereomers+of+a+1,3-Amino+Alcohol+by+Combination+of+a+Keto+Reductase-+and+an+Amine+Transaminase-Catalysed+Reaction.">Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction.</a> Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).</li><li>Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+synthesis+strategies+towards+1,2-amino+alcohols+with+special+emphasis+on+phenylpropanolamines.">Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines.</a> J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114, 65-71 (2015).</li><li>Martinez, S., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+Mechanisms+of+Fe(II)-+and+2-Oxoglutarate-dependent+Oxygenases.">Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases.</a> J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).</li><li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Mono&#8208;and+Dihydroxylated+Amino+Acids+with+New+&#945;&#8208;Ketoglutarate&#8208;Dependent+Dioxygenases:+Biocatalytic+Oxidation+of+C-H+Bonds.">Synthesis of Mono&#8208;and Dihydroxylated Amino Acids with New &#945;&#8208;Ketoglutarate&#8208;Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds.</a> ChemCatChem. , (2014).</li><li>Suzuki, H., Kurihara, S., Kusano, T., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+4.">Ch. 4.</a> Polyamines. 4, 47-59 (2015).</li><li>Kind, S., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+production+of+the+platform+chemical+1,5-diaminopentane.">Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).</li><li>Schneider, J., Wendisch, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnological+production+of+polyamines+by+bacteria:+recent+achievements+and+future+perspectives.">Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).</li><li>Qian, Z. -. G., Xia, X. -. X., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+Escherichia+coli+for+the+production+of+cadaverine:+A+five+carbon+diamine.">Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).</li><li>Shin, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+microorganisms+for+the+production+of+L-arginine+and+its+derivatives.">Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives.</a> Microb. Cell. Fact. 13, (2014).</li><li>Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+Production+of+the+Diamine+Putrescine:+System+Metabolic+Engineering+of+Corynebacterium+Glutamicum.">Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum.</a> Metabolites. 5 (2), 211 (2015).</li><li>Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Classification+of+Amino+Acid+Decarboxylases+from+the+Alanine+Racemase+Structural+Family+by+Phylogenetic+Studies.">Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies.</a> Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).</li><li>Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Characteristics+of+Selenomonas+ruminantium+Lysine+Decarboxylase+Capable+of+Decarboxylating+Both+L-Lysine+and+L-Ornithine.">Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).</li><li>Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Amino+Acid+Residues+Conferring+Substrate+Specificity+upon+Selenomonas+ruminantium+Lysine+Decarboxylase.">Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).</li><li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Approaches+towards+the+Synthesis+of+Chiral+Amino+Alcohols+from+Lysine:+Cascade+Reactions+Combining+alpha-Keto+Acid+Oxygenase+Hydroxylation+with+Pyridoxal+Phosphate-+Dependent+Decarboxylation.">Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation.</a> Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).</li><li>Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chiral+derivatizing+agents+in+the+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+amino+acid+enantiomers:+a+review.">Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).</li><li>. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy</a> (2017)</li><li>Hibi, M., Ogawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+biotechnology+applications+of+aliphatic+amino+acid+hydroxylases+belonging+to+the+Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent+dioxygenase+superfamily.">Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).</li><li>H&#252;ttel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Production+of+Chemical+Building+Blocks+in+Technical+Scale+with+&#945;-Ketoglutarate-Dependent+Dioxygenases.">Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with &#945;-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases.</a> Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).</li><li>Kourist, R., Guterl, J. -. K., Miyamoto, K., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Decarboxylation-An+Emerging+Reaction+for+Chemicals+Production+from+Renewable+Resources.">Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources.</a> ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).</li><li>Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+diversity+and+the+structural+basis+of+substrate+specificity+in+the+beta/alpha-barrel+fold+basic+amino+acid+decarboxylases.">Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases.</a> J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).</li><li>Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Enzymes+for+Industrial+Biocatalysis.">Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis.</a> ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Derivati e amino alcoli chirali hanno una vasta gamma di applicazioni, da ausiliari chirali per la sintesi organica di terapia farmaceutica. Multistep sintesi per la produzione di alcoli aminoacidi di sintesi organica convenzionali sono numerose, ma potrebbe non essere sempre efficiente a causa di passaggi noioso protezione/deprotezione insieme con un sensibile controllo della stereochimica16. Un approccio biocatalitico che eroga con le operazioni di protezione/deprotezione ed è solitamente altam...

Nonostante i vantaggi offerti da biocatalisi, l'integrazione di biocatalitici passi nelle vie sintetiche o rotte biocatalitici totale rimane per lo più limitata a risoluzioni di cinetiche enzimatiche. Questi percorsi sono stati ampiamente utilizzati come un primo passo nella sintesi asimmetrica chemo-enzimatica, ma biocatalisi offre molte più possibilità nel gruppo funzionale interconversioni con elevata stereoselettività1,2,3 . Inoltre, come reazioni biocatalitici sono condotte in condizioni simili, pertanto è possibile eseguire reazioni a cascata della moda uno-pentola4,5.
Amino alcoli chirali sono molecole versatili per l'utilizzo come ausiliari o impalcature in sintesi organica6. La frazione di alcool amminico è trovata frequentemente in metaboliti secondari e ingredienti farmaceutici attivi (API). Alcoli primari β-amminici sono prontamente disponibili dagli acidi α-amminici corrispondenti di sintesi chimica convenzionale, ma l'accesso a γ-amino alcoli chirali o amminoalcoli secondari richiede spesso noiose vie sintetiche insieme sensibile controllo della stereochimica7,8,9,10. A causa della sua elevata stereoselettività, biocatalisi possono fornire un percorso sintetico superiore a questi blocchi chirali11,12,13,14.
Precedentemente abbiamo segnalato la sintesi di mono - e di-idrossi-L-lisine di diastereoselettiva idrossilazione enzimatica catalizzata da diossigenasi del ferro (II) / α-chetoacido-dipendente famiglia ossigenasi (αKAO) (Figura 1)15. In particolare, a partire da L-lisina, la KDO1 dioxygenase catalizza la formazione di (3S) - derivato idrossilato (1), mentre il (4R) - derivato (2) è costituito dalla reazione con KDO2 diossigenasi. Regiodivergent successivi idrossilazioni da KDO1 e KDO2 portano alla formazione dei (3R, 4R) - diidrossi - L-lisina (3) in forma otticamente puro. Tuttavia, la gamma limitata di substrato di questi enzimi impedisce loro ampio utilizzo in sintesi chimica, soprattutto nell'idrossilazione di ammine semplici, come una molecola di acido carbossilico nella α-posizione del gruppo amminico è essenziale per attività16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg"> Figura 1: biocatalitici conversioni di L-lisina. Conversione in (3S) - idrossi - L-lisina (1) catalizzata da KDO1 dioxygenase; (4R) - idrossi - L-lisina (2) catalizzata da KDO2 dioxygenase; e (3R, 4R) - diidrossi - L-lisina (3) da reazione a cascata catalizzata successivamente da KDO1 e KDO2 diossigenasi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Decarbossilazione è una reazione comune nel metabolismo17. In particolare, dell'amminoacido DCs (EC 4.1.1) sono privo di cofattore (piruvoil-dipendente) o enzimi PLP-dipendenti e catalizzano la decarbossilazione degli aminoacidi nelle poliammine corrispondente in batteri e più alti organismi18,19 , 20 , 21 , 22. la mono - diidrossi composti (Figura 3) 4–7, 10-11 corrispondono ai idrossilati cadaverina, diammina ottenuta mediante decarbossilazione della L-lisina. La cadaverina è un elemento chiave per l'industria chimica, in particolare è un componente di polimeri in poliammide e poliuretano. Di conseguenza, produzione biologica di questo diammina da risorse rinnovabili ha attirato l'attenzione come un'alternativa al percorso a base di petrolio, e vari microrganismi sono stati progettati per questo scopo. In queste vie metaboliche, lisina DC (LDC) è l'enzima chiave. LDC è un enzima di PLP-dipendenti appartenenti al alanina racemasi (AR) strutturali famiglia23. I controller di dominio di PLP-dipendenti (PLP-DCs) sono noti per essere altamente substrato specifico. Tuttavia, alcuni enzimi proprio la capacità di promiscuità leggera, essendo attivo verso gli aminoacidi L-ornitina e la L-lisina, come ad esempio la LDC da Selenomonas rumirantium (LDCSrum), che ha simili costanti cinetiche per lisina e ornitina decarbossilazione24,25. Questo substrato esteso specificità rende questo enzima un buon candidato per la decarbossilazione di mono - e di-idrossi-L-lisina. Inoltre, per trovare DCs attivo verso i derivati dell'idrossile di lisina, abbiamo esaminato il contesto genomico dei geni che codificano gli enzimi αKAO. Infatti, nei genomi procariotici i geni che codificano per enzimi coinvolti nella via biosintetica del stessa generalmente sono co-localizzati in cluster genici. Il gene KDO2 (da Chitinophaga pinensis) è stato trovato co-localizzato con un gene che codifica per presunti PLP-DC (Figura 2). Al contrario, nessun gene che codifica per la DC è stato trovato quando si analizza il contesto genomico di dioxygenase del KDO1. La proteina PLP-DC da c. pinensis (DCCpin) pertanto è stata selezionata come candidato promising per catalizzare il passo di decarbossilazione della reazione cascade.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg"> Figura 2: contesto Genomic del gene KDO2 in c. pinensis. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Di conseguenza, abbiamo progettato reazioni cascata enzimatica che coinvolgono diossigenasi e DCs per realizzare la sintesi di alcoli alifatici chirali β e γ-amminico da amminoacidi (Figura 3). Come precedentemente segnalato, l'ossidazione di C-H catalizzata dalla αKAO introduce il centro stereogenico idrossi-sostituiti con totale diastereoselettività; la chiralità Cβ/γ verrà mantenuta nel passaggio decarboxylative, che colpisce solo il carbonio Cα della molecola dell'amminoacido16.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg"> Figura 3: analisi retrosintetica. (A) Retrosynthesis di β e γ-amino alcoli (R) - 1,5 - diaminopentan-2-olo (4) da (5R) - idrossi - L-lisina e diaminopentan (S) - 1,5--2-ol (5) e 1,5-diaminopentan-3-ol (6) da L-lisina. (B) Retrosynthesis di β, γ e β, δ-amino dioli (2S, 3S) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diolo (10) e (2R, 4S) - 1,5 - diaminopentane-2,4-diolo (11) a partire da (5R)- idrossi-L-lisina e (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diolo (7) a partire da L-lisina. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
A partire da L-lisina e i suoi (5R)-derivato idrossilato, qui segnaliamo un due/tre step, una pentola, procedura enzimatica che unisce diossigenasi e PLP-DCs per ottenere l'obiettivo amino alcoli. Prima la sintesi a scala di laboratorio delle molecole bersaglio, il metodo è stato sviluppato presso la scala analitica per regolare le condizioni di reazione, ad esempio, le concentrazioni di enzimi, necessari per consentire la conversione completa dei materiali di partenza; Presentiamo questa procedura pure.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(5S)-hydroxy-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GPS NONH</td>
			<td>Out sourcing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-ketoglutaric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>201370250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal phosphate (PLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>82870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20825.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 37%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>435570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 0.1M</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>35335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83640.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-trifluoroacetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>153112E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia 28%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21182.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83638.32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Acros</td>
			<td>270480010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid 85%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>201145000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Acros</td>
			<td>320,710,075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4601-Y0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accela UHPLC System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accela PDA detector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4mm syringe filters - 0,22&#181;m - PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HSWA5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange resin 100-200&#160;mesh</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>217506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi</td>
			<td>531-0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer alpha 1-2 LDplus</td>
			<td>Christ</td>
			<td>L083302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 20 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 500 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtube</td>
			<td>CLEARLine</td>
			<td>CL20.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical-bottom centrifuge tube</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>05-539-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask 14/23</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10353331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL round-bottom flask 29/32</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11786183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL round-bottom flask 29/32</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11786183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL erlenmeyer flask</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>15496143</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine

Amino alcoli sono composti versatili con una vasta gamma di applicazioni. Per esempio, essi sono stati usati come impalcature chirali in sintesi organica. Loro sintesi di chimica organica convenzionale spesso richiedono processi di noioso sintesi multi-step, con controllo difficile del risultato stereochemical. Vi presentiamo un protocollo per sintetizzare enzimaticamente amino alcoli a partire dalla L-lisina prontamente disponibile in 48 h. Questo protocollo combina due reazioni chimiche che sono molto difficili da condurre di sintesi organica convenzionali. Nel primo passaggio, il regio - e diastereoselettiva ossidazione di un legame C-H unactivated della lisina catena laterale è catalizzata da un dioxygenase; un secondo regio - e diastereoselettiva ossidazione catalizzata da un dioxygenase di regiodivergent può portare alla formazione di 1,2-dioli. Nell'ultimo passaggio, il gruppo carbossilico dell'amminoacido alfa viene scisso da una decarbossilasi del fosfato del piradossale (PLP) (DC). Questo passaggio decarboxylative riguarda solo il carbonio alfa dell'amminoacido, mantenendo il centro stereogenico idrossi-sostituiti in posizione beta/gamma. La risultante amino alcoli otticamente sono pertanto arricchiti. Il protocollo è stato applicato con successo alla sintesi semipreparative-scala di quattro amino alcoli. Monitoraggio delle reazioni è stata condotta mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) dopo derivatizzazione di 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Semplice purificazione di estrazione in fase solida (SPE) conferita la amino alcoli con ottimi rendimenti (93% di > 95%).

Precedentemente abbiamo segnalato la sintesi di mono - e di-idrossi-L-lisine di diastereoselettiva idrossilazione enzimatica catalizzata da diossigenasi del ferro (II) / αKAO famiglia (Figura 1)16. Per ottimizzare il protocollo delle cascate intere qui presentato, che combinano uno o due passaggi di idrossilazione catalizzate da una αKAO seguita da una fase di decarbossilazione catalizzata da un PLP-DC, le condizioni di reazione sono...

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Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcoli chirali sono molecole versatili per l'utilizzo come scaffold in sintesi organica. A partire da L-lisina, sintetizziamo amino alcoli da una reazione a cascata enzimatica combinando diastereoselettiva C-H ossidazione catalizzata da diossigenasi seguita dalla scissione della parte dell'acido carbossilico dell'amminoacido corrispondente dell'idrossile di un decarbossilasi.

Reazioni a cascata enzimatica per la sintesi di Amino alcoli chirali da L-lisina

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

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12.0K Views.  CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay. Amino alcoli chirali sono molecole versatili per l'utilizzo come scaffold in sintesi organica. A partire da L-lisina, sintetizziamo amino alcoli da una reazione a cascata enzimatica combinando diastereoselettiva C-H ossidazione catalizzata da diossigenasi seguita dalla scissione della parte dell'acido carbossilico dell'amminoacido corrispondente dell'idrossile di un decarbossilasi.

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Microwave-assisted Intramolecular Dehydrogenative Diels-Alder Reactions for the Synthesis of Functionalized Naphthalenes/Solvatochromic Dyes

Functionalized naphthalenes have applications in a variety of research fields ranging from the synthesis of natural or biologically active molecules to the preparation of new organic dyes. Although numerous strategies have been reported to access naphthalene scaffolds, many procedures still present limitations in terms of incorporating functionality, which in turn narrows the range of available substrates. The development of versatile methods for direct access to substituted naphthalenes is therefore highly desirable.
The Diels-Alder (DA) cycloaddition reaction is a powerful and attractive method for the formation of saturated and unsaturated ring systems from readily available starting materials. A new microwave-assisted intramolecular dehydrogenative DA reaction of styrenyl derivatives described herein generates a variety of functionalized cyclopenta[b]naphthalenes that could not be prepared using existing synthetic methods. When compared to conventional heating, microwave irradiation accelerates reaction rates, enhances yields, and limits the formation of undesired byproducts.
The utility of this protocol is further demonstrated by the conversion of a DA cycloadduct into a novel solvatochromic fluorescent dye via a Buchwald-Hartwig palladium-catalyzed cross-coupling reaction. Fluorescence spectroscopy, as an informative and sensitive analytical technique, plays a key role in research fields including environmental science, medicine, pharmacology, and cellular biology. Access to a variety of new organic fluorophores provided by the microwave-assisted dehydrogenative DA reaction allows for further advancement in these fields.

Microwave-assisted intramolecular dehydrogenative Diels-Alder (DA) reactions provide concise access to functionalized cyclopenta[b]naphthalene building blocks. The utility of this methodology is demonstrated by one-step conversion of the dehydrogenative DA cycloadducts into novel solvatochromic fluorescent dyes via Buchwald-Hartwig palladium-catalyzed cross-coupling reactions.

Di micro-onde intramolecolari Dehydrogenative Diels-Alder reazioni per la sintesi di naftaleni funzionalizzati / Colori Solvatochromic

Functionalized naphthalenes have applications in a variety of research fields ranging from the synthesis of natural or biologically active molecules to ...

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Chimica

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as an intrinsic probe to characterize virtually every chemical process. Nowadays, this technique is extensively applied to determine thermodynamic parameters of biomolecular binding equilibria. In addition, ITC has been demonstrated to be able of directly measuring kinetics and thermodynamic parameters (kcat, KM, &#916;H) of enzymatic reactions, even though this application is still underexploited. As heat changes spontaneously occur during enzymatic catalysis, ITC does not require any modification or labeling of the system under analysis and can be performed in solution. Moreover, the method needs little amount of material. These properties make ITC an invaluable, powerful and unique tool to study enzyme kinetics in several applications, such as, for example, drug discovery.
In this work an experimental ITC-based method to quantify kinetics and thermodynamics of enzymatic reactions is thoroughly described. This method is applied to determine kcat and KM of the enzymatic hydrolysis of urea by Canavalia ensiformis (jack bean) urease. Calculation of intrinsic molar enthalpy (&#916;Hint) of the reaction is performed. The values thus obtained are consistent with previous data reported in literature, demonstrating the reliability of the methodology.

Isothermal titration calorimetry measures heat flow released or absorbed in chemical reactions. This method can be used to quantify enzyme-catalysis. In this paper, the protocol for instrumental setup, experiment running, and data analysis is generally described, and applied to the characterization of enzymatic urea hydrolysis by jack bean urease.

Hot Catalisi biologica: Calorimetria isotermica di titolazione per caratterizzare reazioni enzimatiche

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of trifluoromethoxylated aromatic compounds remains a formidable challenge in organic synthesis. Conventional approaches often suffer from poor substrate scope, or require use of highly toxic, difficult-to-handle, and/or thermally labile reagents. Herein, we report a user-friendly protocol for the synthesis of methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate using 1-trifluoromethyl-1,2-benziodoxol-3(1H)-one (Togni reagent II). Treating methyl 4-(N-hydroxyacetamido)benzoate (1a) with Togni reagent II in the presence of a catalytic amount of cesium carbonate (Cs2CO3) in chloroform at RT afforded methyl 4-(N-(trifluoromethoxy)acetamido)benzoate (2a). This intermediate was then converted to the final product methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate (3a) in nitromethane at 120 &#176;C. This procedure is general and can be applied to the synthesis of a broad spectrum of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives, which could serve as useful synthetic building blocks for the discovery and development of new pharmaceuticals, agrochemicals, and functional materials.

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

An operationally simple procedure for the synthesis of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives via a two-step sequence of O-trifluoromethylation of N-aryl-N-hydroxyacetamide followed by thermally induced intramolecular OCF3-migration is reported.

Protocollo per la sintesi di<em&gt; Ortho</em&gt; Derivati ​​all&#39;anilina -trifluoromethoxylated

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins with the synthesis of a hydrophilic poly(oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) (POEGMA) homopolymer using reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization. Under mild visible light irradiation (&#955; = 460 nm, 0.7 mW/cm2), this macro-chain transfer agent (macro-CTA) in the presence of a ruthenium based photoredox catalyst, Ru(bpy)3Cl2 can be chain extended with a second monomer to form a well-defined block copolymer in a process known as Photoinduced Electron Transfer RAFT (PET-RAFT). When PET-RAFT is used to chain extend POEGMA with benzyl methacrylate (BzMA) in ethanol (EtOH), polymeric nanoparticles with different morphologies are formed in situ according to a polymerization-induced self-assembly (PISA) mechanism. Self-assembly into nanoparticles presenting POEGMA chains at the corona and poly(benzyl methacrylate) (PBzMA) chains in the core occurs in situ due to the growing insolubility of the PBzMA block in ethanol. Interestingly, the formation of highly pure worm-like micelles can be readily monitored by observing the onset of a highly viscous gel in situ due to nanoparticle entanglements occurring during the polymerization. This process thereby allows for a more reproducible synthesis of worm-like micelles simply by monitoring the solution viscosity during the course of the polymerization. In addition, the light stimulus can be intermittently applied in an ON/OFF manner demonstrating temporal control over the nanoparticle morphology.

This article describes a process for producing polymeric self-assembled nanoparticles using visible light mediated dispersion polymerization. Using low energy visible light to control the polymerization allows for the reproducible formation of self-assembled worm-like micelles at high solids content.

Sintesi facile di micelle vermiforme dalla luce visibile mediata polimerizzazione in dispersione Utilizzando Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from benzimidazolium salts. Detailed and generalized protocols are also presented for testing the catalytic activity of such complexes in arylation and Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions. Representative results are shown for the catalytic activity of the four complexes in arylation and Suzuki-Miyaura type reactions. For each of the reactions investigated, at least one of the four complexes successfully catalyzed the reaction, qualifying them as promising candidates for catalysis of many carbon-carbon bond-forming reactions. The protocols presented are general enough to be adapted for the synthesis, purification and catalytic activity testing of new palladium N-heterocyclic carbene complexes.

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from benzimidazolium salts. The complexes were tested for catalytic activity in arylation and Suzuki-Miyaura reactions. For each reaction investigated, at least one of the four complexes successfully catalyzed the reaction.

Palladio<em&gt; N</em&gt; Complessi di Carbene eterocicliche: Sintesi dei sali di benzimidazolium e attività catalitica in reazioni di formazione di legame di carbonio-carbonio

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Intuizioni le interazioni di aminoacidi e peptidi con materiali inorganici Uso singola molecola Forza Spettroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic nanostructures. The high spatial precision of a DNA origami-templated assembly allows controlling the coupling between plasmonic resonances of individual particles and enables tailoring optical properties of the constructed nanostructures. Recently, chiral plasmonic systems attracted a lot of attention due to the strong correlation between the spatial configuration of plasmonic assemblies and their optical responses (e.g., circular dichroism [CD]). In this protocol, we describe the whole workflow for the generation of DNA origami-based chiral assemblies of gold nanorods (AuNRs). The protocol includes a detailed description of the design principles and experimental procedures for the fabrication of DNA origami templates, the synthesis of AuNRs, and the assembly of origami-AuNR structures. In addition, the characterization of structures using transmission electron microscopy (TEM) and CD spectroscopy is included. The described protocol is not limited to chiral configurations and can be adapted for the construction of various plasmonic architectures.

We describe the detailed protocol for the DNA origami-based assembly of gold nanorods into chiral plasmonic metamolecules with strong chiroptical responses. The protocol is not limited to chiral configurations and can be easily adapted for the fabrication of various plasmonic architectures.

Assemblaggio di nanorod oro in Metamolecules plasmoniche chirale utilizzando modelli di Origami del DNA

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These metabolites are produced endogenously by the cytochrome P450 class of enzymes. Because of their diverse and potent biological effects, there is considerable interest in studying these metabolites. Determining the unique roles of these metabolites in the body is a difficult task, as the epoxy fatty acids must first be obtained in significant amounts and with high purity. Obtaining compounds from natural sources is often labor intensive, and soluble epoxide hydrolases (sEH) rapidly hydrolyze the metabolites. On the other hand, obtaining these metabolites via chemical reactions is very inefficient, due to the difficulty of obtaining pure regioisomers and enantiomers, low yields, and extensive (and expensive) purification. Here, we present an efficient enzymatic synthesis of 19(S),20(R)- and 16(S),17(R)-epoxydocosapentaenoic acids (EDPs) from DHA via epoxidation with BM3, a bacterial CYP450 enzyme isolated originally from Bacillus megaterium (that is readily expressed in Escherichia coli). Characterization and determination of purity is performed with nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), high-performance liquid chromatography (HPLC), and mass spectrometry (MS). This procedure illustrates the benefits of enzymatic synthesis of PUFA epoxy metabolites, and is applicable to the epoxidation of other fatty acids, including arachidonic acid (AA) and eicosapentaenoic acid (EPA) to produce the analogous epoxyeicosatrienoic acids (EETs) and epoxyeicosatetraenoic acids (EEQs), respectively.

We present a method useful for large-scale enzymatic synthesis and purification of specific enantiomers and regioisomers of epoxides of arachidonic acid (AA), docosahexaenoic acid (DHA), and eicosapentaenoic acid (EPA) with the use of a bacterial cytochrome P450 enzyme (BM3).

Sintesi ezimatica dei metaboliti epossidici degli acidi docosahexaenoici, eicosapentaenoici e aracidonici

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...