Diese Arbeit wurde durch das Gehirn Korea 21 PLUS Projekt für die medizinische Wissenschaft, Yonsei Universität unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Arbeit durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315) unterstützt.

Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der entsprechenden Forschung an der Yonsei University College of Medicine genehmigt. Alle Versuchstiere sind nach den Richtlinien des Ausschusses Labor Tierbetreuung Yonsei University College of Medicine geopfert.
1. Vorbereitung der Reagenzien
Achtung: Paraformaldehyd (PFA), Acrylamid und Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) sind giftige Reizstoffe und somit in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA, Kittel, Handschuhe, Schutzbrille) behandelt werden.
<ol><li>4 % Acrylamid (A.A.) Lösung (A4P0): 180 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 20 mL 40 % Acrylamid-Lösung hinzufügen.</li>
	<li>0,25 % VA-044 Lösung: Fügen Sie 0,5 g 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride (VA-044) Pulver auf 200 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Während das VA-044-Pulver bei Raumtemperatur gelagert werden kann, muss es bei 4 ° C bei der Solubilisierung mit PBS-Puffer gespeichert werden. Bereiten Sie um beste Ergebnisse zu erzielen nur die Menge der Lösung für das Experiment benötigt.</li>
	<li>Pakt cocktail Lösung: 225 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung 10 g Acrylamid hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 200 mL mit 4 % PFA. Vor dem Einsatz fügen Sie 100 mg VA-044-Pulver 40 mL der Mischung in einem 50 mL konische Röhrchen hinzu.</li>
	<li>Clearing-Lösung Puffer Pakt: 350 mL 0,1 M PBS 40 g Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 500 mL mit 0,1 M PBS. Fügen Sie 0,5 % α-Thioglycerol mPACT clearing-Lösung hinzu des Pakts Lösung Puffer löschen.</li>
	<li>Die Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden 2 Wochen alten BALB männliche Mäuse; die Ratten, die in dieser Studie verwendet wurden 2 Wochen alten männlichen SD-Ratten.</li>
</ol>(2) Anästhesie und Chirurgie der Perfusion
Achtung: PFA Acrylamid giftige Reizstoffe und sind somit unter einem Abzug mit geeignete PSA behandelt werden.
<ol><li>Betäuben Sie das Tier in einem Pathogen-freies Zimmer mit 30 mg/kg Zoletil mit einer 1 mL Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel. Überwachen Sie das Tier für 5-10 min.</li>
	<li>Sobald das Tier eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht hat, verwenden Sie die Zehe-Prise Antwort-Methode, die Tiefe der Narkose bestimmen. Bestätigen Sie Reaktionsmangel. Hinweis: Die folgenden Schritte mit Maus und Ratte Chirurgie folgen ein ähnliches Protokoll in einer früheren Studie11verwendet.</li>
	<li>Machen Sie einen ca. 5-6 cm Schnitt unterhalb des Brustkorbs durch das Integument und Bauchwand.</li>
	<li>Geschwungene, stumpfe Scheren ein Schnitt in das Zwerchfell, Abtasten der thorakalen Bereich um die Website der Schnitt vorher zu suchen zu verwenden.</li>
	<li>Erstrecken Sie sich des Schnittes über die gesamte Länge des Brustkorbs, der Pleurahöhle verfügbar zu machen.</li>
	<li>Verdrängen Sie sorgfältig die Lunge. Machen Sie einen Schnitt durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Mit Iris-Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des linken Ventrikels. Legen Sie eine Blunt - oder Olive-Kreissägeblätter Perfusion 18-Gauge-Nadel in der Aorta ascendens, durch den Schnitt Ventrikel.</li>
	<li>Sichern Sie die Nadel und klemmend Herzen mit einer Gefäßklemme verhindern Sie auslaufen zu. Alternativ können Sie eine modifizierte Gefäßklemme Klemmen die Aorta auf die Nadelspitze.</li>
	<li>Machen Sie einen großen Schnitt im rechten Vorhof, kümmert sich um minimale Schäden an der absteigenden Aorta zu gewährleisten. Die Ratte ist nun betriebsbereit Perfusion.</li>
</ol>(3) ganze Perfusion und Präparation der Ratte
Achtung: PFA Acrylamid giftige Reizstoffe und sind somit unter einem Abzug mit geeignete PSA behandelt werden.
Hinweis: Ganze Perfusion folgendermaßen ähneln einem ein Protokoll in einer früheren Studie von Woo Et al.verwendet. (2016) 10 , 11.
<ol><li>Legen Sie den rechten Vorhof des Herzens auf ein 18-Gauge-Nadel, kümmert sich um eventuelle Luftblasen nicht vorstellen.</li>
	<li>Mit einer 50 mL-Spritze, Pumpen Sie schnell und gleichmäßig 50 mL kalten 0,1 M-PBS-Lösung mit Heparin (10 Einheiten/mL).</li>
	<li>Die 18-Gauge-Nadel an das Rohr der peristaltischen Pumpe anschließen.</li>
	<li>Mit 200 mL kalte 0,1 M-PBS-Lösung mit Heparin (10 Einheiten/mL) bei einer Umlaufgeschwindigkeit von 10 mL/min waschen.</li>
	<li>Befestigen Sie mit 250 mL kaltem 4 % PFA-Lösung auf eine Umlaufgeschwindigkeit von 10 mL/min. Die Ratte sollte in diesem Stadium steif sein.</li>
	<li>Erheben Sie und speichern Sie die restliche PFA-Lösung für die Entsorgung.</li>
	<li>Pakt perfundieren Sie Gewebe mit einer gekühlten Pakt cocktail Lösung von 4 % PFA, 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044-Pulver mit einem 18-Gauge-Nadel, und entfernen Sie dann den Kopf und Wirbelsäule. Setzen Sie den Schädel durch eine Mittellinie Schnitt vom Hals, die Nase. Diese zusätzliche Perfusion Schritt ist nicht erforderlich für die PsPACT und mPACT Methoden; nach der Fixierung sofort isolieren Sie des Kopfes und der Wirbelsäule und setzen Sie des Schädels aus.</li>
	<li>Setzen Sie die Basis des Schädels durch Entfernen alle restlichen Hals und Wirbelsäule Muskel aus.</li>
	<li>Verwenden Sie Rongeurs und Schere zum abschälen des Schädels. Entfernen Sie das Gehirn und das Rückenmark.</li>
	<li>Speichern Sie das Gewebe in 4 % PFA bei 4 ° C; Gewebe können bis zu 1 Woche aufbewahrt werden.</li>
</ol>4. Hydrogel Monomer-Infusion und Polymerisation der Ratte und Maus CNS
Achtung: Acrylamid, SDS, α-Thioglycerol und PFA sind Reizstoffe und sollte so behandelt werden, in einer Dampfhaube und mit entsprechenden PINKELN.
<ol><li>
Pakt (passiv Clearing-Technik)
	<ol>
<li>Isolieren und Kultur ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) aus festen Mäuse und Ratten zu einem 50 mL Röhrchen mit einer gekühlten Pakt cocktail Lösung von 4 % PFA, 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044 Pulver und Speicher bei 4 ° C für 24 h stellen Sie sicher, dass das Gewebe in der s vollständig eingetaucht ist. ösung.</li>
		<li>Die Probe in Stickstoffgas einbetten, für 10 min mit einem Gewebe Hybridisierung System an einen Stickstofftank angeschlossen gel: Stellen Sie das System auf 37 ° C. Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit frisch kalt (4 ° C) Pakt übertragen cocktail Lösung und verbinden mit Rohr Kappe, dann schalten Sie das Vakuum.</li>
		<li>Um das Hydrogel polymerisieren, platzieren Sie das Rohr mit der Probe in einem schütteln Inkubator (150 u/min, 37 ° C) für 3 h oder bis Polymerisation abgeschlossen ist.</li>
		<li>Mit Löschpapier (siehe Tabelle der Materialien), entfernen Sie die restlichen polymerisierten Hydrogel umgebenden Gewebe.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit Clearing-Lösung (8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0).</li>
		<li>Legen Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es etwa 20 Tage für die Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PsPACT (Prozess getrennten passiven Clearing-Technik)
	<ol>
<li>Das ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) mit Knochen Cutter und Schere aus PFA-behoben: Mäuse und Ratten auf einer sauberen Werkbank zu isolieren.</li>
		<li>Gewebe zu übertragen, eine 50 mL-Tube mit 4 % PFA und Store bei 4 ° C für 24 h sicherstellen, dass das Gewebe vollständig in das Fixiermittel eingetaucht ist.</li>
		<li>Das fixierte Gewebe für 1 h in 0,1 M PBS waschen und dann übertragen auf A4P0 Lösung (4 % Acrylamid in 0,1 M PBS). Shop bei 37 ° C für 24 h.</li>
		<li>Waschen Sie das Gewebe für 5 min in 0,1 M PBS.</li>
		<li>Tauchen Sie das Gewebe in 0,25 % VA-044 in 0,1 M PBS. Bei 37 ° C für 6-24 h speichern Sie und übertragen Sie dann auf frischen 0,25 % VA-044/PBS-Lösung.</li>
		<li>Die Probe in Stickstoffgas einbetten, für 10 min mit einem Gewebe Hybridisierung gel System (siehe Tabelle der Materialien) an einen Stickstofftank angeschlossen: übertragen Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit frisch kalt (4 ° C) 0,25 % VA-044/PBS-Lösung, und in Verbindung mit Rohr Kappe. Schalten Sie das Vakuum.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf clearing-Lösung (8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0).</li>
		<li>Inkubieren Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es etwa 17 Tage für Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (modifizierte Passive Clearing-Technik)
	<ol>
<li>Das ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) mit Knochen Cutter und Schere aus PFA-behoben: Mäuse und Ratten auf einer sauberen Werkbank zu isolieren.</li>
		<li>Führen Sie die Schritte 4.2.2 - 4.2.8 des PsPACT-Protokolls.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf clearing-Lösung. Beachten Sie, dass im Gegensatz zu den Pakt und PsPACT Protokolle mPACT eine Clearing-Lösung bestehend aus 0,5 % α-Thioglycerol zusätzlich 8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0 benötigt. Α-Thioglycerol ist ein UN-Bräunung Mittel, das hilft Gewebe deutlich schneller und effektiver. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig in die Lösung getaucht ist.</li>
		<li>Legen Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es ca. 2 Wochen für Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Brechungsindex Matching und Immunostaining geräumte CNS
Hinweis: nFelgen (Nycodenz-basierte Brechungsindex passende Lösung) besteht aus 0,8 g/mL Nycodenz Pulver, gelöst in 30 mL Basis-URI Puffer (0,01 % Natriumazid und Tween 20 in PBS 0,1 M, pH 8,0). Es wird empfohlen, dass die Lösung sich in einem 37 ° C schütteln Inkubator befindet, um richtige Solvatation des Pulvers zu ermöglichen.
<ol><li>Inkubieren Sie Gewebe in 0,1 % Triton x-100 in 0,1 M PBS für 2 h, dann blockieren Sie mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in 0,1 M PBS für 6 h.</li>
	<li>Abschnitte in PBST dreimal waschen (0,1 % Tween 20 in PBS 0,1 M) für 2 h. Fleck Abschnitte mit primären Antikörper (in diesem Fall, ein Anti-Kaninchen PECAM-CD31 Antikörper, die Blutgefäße Flecken) für 2 Tage.</li>
	<li>Färben Sie Abschnitte mit Sekundärantikörper (in diesem Fall eine Ziege Anti-Kaninchen IgG Cy3 fluoreszierende Konjugat) in 2 % BSA für 2 Tage.</li>
	<li>Waschen mit der Bezeichnung Gewebe dreimal in PBST für 2 h und laden in 15 mL nFelgen für 2-10 Tage.</li>
	<li>Bewegen Sie vor Bildgebung beschrifteten Gewebe, eine kleine Menge von n-Felgen auf 35 oder 60 mm Gewebekultur Schalen. Befestigen Sie mit Silikon am unteren Rand der Schale.</li>
	<li>1,5-2 mL frische nFelgen hinzugeben.</li>
</ol>6. Bildbearbeitung
<ol><li>Abrufen von Bildern der geräumten Gewebe mit Kachel Scannen mit einem konfokalen Laserscanning-Microscopewith 10 X Vergrößerung (siehe Tabelle der Materialien). Für Cy3 beschriftet Gewebe, verwenden Sie Wellenlängen von 550-600 nm.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+brain+imaging:+A+powerful+tool+for+neuroscience.">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810 (2017).</li><li>Lee, H., Park, J. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. 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R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY.">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Ke, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+(ENStem-A)+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats.">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53 (2013).</li><li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe/PS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li><li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis.">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während die passive, nicht elektrophoretischen Extraktionsmethoden beschäftigt verbessert Pakt deutlich die Konsistenz erreicht mit früheren Gewebe clearing-Methoden wie Klarheit2,3,4,7 , 8, trägt die Technik noch mehrere Mängel auf, die dringendsten davon die Länge der Zeit benötigt, um maximale Gewebe Klarheit12zu erreichen ist...

Ein grundlegendes Ziel der wissenschaftlichen und klinischen Untersuchung beinhaltet ein vollständiges Verständnis der Orgel Struktur und Funktion zu erreichen; die überaus komplexe Natur der Säugetier-Organe dient jedoch oft als Hindernis für voll und ganz diesem Ziel1zu erreichen. Klarheit (klare Lipid ausgetauscht Acrylamid-hybridisiert starre Imaging-kompatible Tisssue-hYdrogel)2,3,4, der beinhaltet den Aufbau einer Acrylamid-basierte Hydrogel-Hybrid von intakten Gewebe, erreicht optische Clearance von verschiedenen Organen, einschließlich Gehirn, Leber und Milz, unter Beibehaltung ihrer strukturellen Integrität-5. Klarheit konnte somit nicht nur die Visualisierung, sondern auch die Möglichkeit, komplexe Mobilfunknetze und Gewebe Morphologien ohne Schnitt fein sezieren.
Um Gewebe Abstand zu erreichen, setzt Klarheit elektrophoretische Methoden zum Entfernen von Lipidgehalt der Probe zur Verfügung. Während Klarheit gemerkt worden ist, für die Herstellung von physikalisch stabile Gewebe-Hydrogel Hybriden, Studien haben gezeigt, dass seine Verwendung der elektrophoretischen Gewebe Clearing (ETC) Methoden unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf Qualität Gewebe, einschließlich gebräunt, Epitop Schaden ergibt und Protein Verlust5,6. Um diese Probleme zu beheben, wurden modifizierte Protokolle wie Pakt (PAssive Technik, Klarheit), der die usw. Behandlung mit einer passiven, Ionische Spülmittel auf der Grundlage delipidierung-Technik ersetzt, entwickelten7,8,9. Trotz eine größere Konsistenz in Ergebnisse zu erreichen, erfordert jedoch Pakt mehr Zeit zum maximalen Abstand zu erhalten. Darüber hinaus wurden keine dieser Techniken noch auf das ganze CNS-Formular oder in größere Nager-Modelle wie Ratten und Meerschweinchen übernommen.
Die vorliegende Studie versucht, diese Einschränkungen zu beheben, indem er vorschlägt neuartige Methoden, PsPACT ("Prozess-separater Pakt") und mPACT (modifizierte Pakt), für erleichtern die schnelle Abfertigung von die ganze CNS und inneren Organe bei Maus und Ratte Modelle10. Im einzelnen verarbeitet PsPACT Gewebe in 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044 in zwei getrennten Schritten während Hydrogel Bildung; mPACT im Wesentlichen die gleichen Schritte beinhaltet, sondern ergänzt die SDS-basierte Clearing-Lösung mit 0,5 % α-Thioglycerol als zentrale Reagens. Beide Techniken nutzen die endogenen systemische und Liquor Kreislaufsystem um den Zeitaufwand zum optischen Freiraum produzieren deutlich zu reduzieren. Als Beweis des Prinzips zeigen wir den Einsatz der konfokalen Mikroskopie, Blutgefäß-Muster in den geräumten Gewebe10zu analysieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix, Inc.</td>
			<td>75819</td>
			<td>Clearing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz</td>
			<td>Axia-Shield</td>
			<td>1002424</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>161-0140</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#180;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>017-19362</td>
			<td>Polymerization (VA-044)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1753-100ML</td>
			<td>Clearing solution (mPACT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Georgiachem</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>BSA100</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>375095</td>
			<td>Perfusion (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-CD31 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-28188</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPP-9004</td>
			<td>Perfusion, Polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPB-9121</td>
			<td>Perfusion, Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL stripette</td>
			<td>Coatar</td>
			<td>4488</td>
			<td>Solution transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Clearing tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Cell culture dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>20035</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>211350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>26G 1/2</td>
			<td>Anesthetize&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>21G1 1/4</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 3MM paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z270849</td>
			<td>Blotting paper for gel removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN lite Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN 2012</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>BT100-1F</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Lifecanvas Technologies</td>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Tissue gel hybridization system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue

Seit der Entwicklung von Klarheit ermöglicht ein Bioelectrochemical clearing-Technik, die für die dreidimensionale Phänotyp Zuordnung in den transparenten Geweben, eine Vielzahl von neuartigen Clearing Methoden einschließlich KUBISCH (klar, unverbaute bildgebenden Cocktails und computergestützte Analyse), SWITCH (systemweite Kontrolle der Interaktionszeit) und die Kinetik der Chemikalien, Karte (vergrößerte das Proteom-Analyse) und Pakt (passive Klarheit-Technik), eingerichtet, um das bestehende Instrumentarium für weiter ausbauen die mikroskopische Analyse von biologischen Geweben. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, bei der Verbesserung und Optimierung der ursprünglichen Pakt-Prozedur für ein Array intakt Nagetier Gewebe, einschließlich das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS), Nieren, Milz und ganze mausembryonen. PsPACT (Prozess-separater Pakt) und mPACT ("modifizierte Pakt") bezeichnet, bieten diese neuartige Techniken hochwirksamen Mittel mapping Zelle Schaltung und subzelluläre Strukturen in intakten normalen und pathologischen Geweben zu visualisieren. Das folgende Protokoll bieten wir eine ausführliche, schrittweise Gliederung wie maximale Gewebe Abstand mit minimaler Invasion ihre strukturelle Integrität über PsPACT und mPACT zu erreichen.

Generation ein transparentes Modell des gesamten ZNS mit optimierten passiven Clearing-Techniken
Optische Clearance von Maus und Ratte ganze CNS-Gewebe wurde schnell erreicht mit verschiedenen Techniken der passiven Clearing (Abbildung 1). Abbildung 2Azeigt eine schematische Darstellung des Gewebes im Laufe der Zeit löschen. Im Gegensatz zu der Origina...

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Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Hier stellen wir zwei neue Methoden, PsPACT und mPACT zur Erreichung maximaler optischer Transparenz und anschließende mikroskopische Analyse des Gewebes Gefäßsystem in das intakte Nagetier ganze CNS.

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Aufrufe.  Yonsei University College of Medicine. Hier stellen wir zwei neue Methoden, PsPACT und mPACT zur Erreichung maximaler optischer Transparenz und anschließende mikroskopische Analyse des Gewebes Gefäßsystem in das intakte Nagetier ganze CNS.

Serie: Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Methoden für die experimentelle Manipulationen nach Optic Nerve Durchtrennung im Säuger-ZNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Forschung

Neurowissenschaften

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Beurteilung der Gefäß Regeneration im ZNS Verwenden der Maus Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the identification of novel molecules active in preclinical assays from an in vitro recombinant receptor to their pharmacological effects at native receptors in rodent brain slices. For compounds binding at the benzodiazepine site of the receptor, the first step is to set up a primary screen that consists of developing radioligand binding assays on cell membranes expressing the major GABAA subtypes. Then, taking advantage of the heterologous expression of rodent and human GABAA receptors in Xenopus oocytes or HEK 293 cells, it is possible to explore, in electrophysiological assays, the physiological properties of the different receptor subtypes and the pharmacological properties of the identified compounds. The Xenopus oocyte system will be presented here, starting with the isolation of the oocytes and their microinjection with different mRNAs, up to the pharmacological characterization using two-electrode voltage clamps. Finally, recordings conducted in rodent brain slices will be described that are used as a secondary physiological test to assess the activity of molecules at their native receptors in a well-defined neuronal circuit. Extracellular recordings using population responses of multiple neurons are demonstrated together with the drug application.

Here, we present protocols to discover compounds active at GABAA receptors, from the binding to the physiology and pharmacology.

Methoden für die Entdeckung der neuartige Substanzen modulieren einen Gamma - Aminobuttersäure-Rezeptor geben eine Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Chronische Implantation des gesamten kortikalen Electrocorticographic Arrays in der Weißbüschelaffe

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Zusammenfassung

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