이 작품은 두뇌 한국 21 플러스 프로젝트 의료 과학, 연세대에 지원 됩니다. 또한,이 작품은 국립 연구 재단의 한국 (NRF-2017R1D1A1B03030315)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

모든 절차는 연 세 대학 의과대학에서 적절 한 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 연 세 대학 대학의과 대학에 실험실 동물 관리 위원회의 지침에 따라 모든 실험 동물을 희생 한다.
1입니다. 시 약의 준비
주의: Paraformaldehyde (PFA), 아크릴 및 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 개인 보호 장비 (PPE; 실험실 외 투, 장갑, 보호 안경)와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
<ol><li>4% 아크릴 (금주 모임) 솔루션 (A4P0): 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 180 ml 40% 아크릴 솔루션의 20 mL를 추가.</li>
	<li>0.25% 버지니아-044 솔루션: 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane의 0.5 g 추가] dihydrochloride (VA-044) 파우더 200 mL의 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를. 버지니아-044 분말은 실내 온도에 저장 될 수, 그러나 PBS에 가용 화 시 4 ° C에 저장 되어야 합니다. 최상의 결과 얻으려면 솔루션 실험에 필요한 만큼만 준비 합니다.</li>
	<li>협정 칵테일 솔루션: 4 %paraformaldehyde (PFA) 솔루션의 225 mL에 아크릴의 10 g를 추가 하 고 4%와 200 mL에 양을 맞추십시오 PFA. 사용 전에 40 ml 50 mL 원뿔 튜브에 혼합물의 버지니아-044 분말의 100 mg을 추가 합니다.</li>
	<li>협정 솔루션 버퍼 지우기: 0.1 M PBS의 350 mL에 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 40 g을 추가 하 고 0.1 M PBS 가진 500 mL에 양을 맞추십시오. MPACT 삭제 솔루션, 솔루션 버퍼를 삭제 하는 협정에 0.5% α-thioglycerol를 추가 합니다.</li>
	<li>이 연구에 사용 된 마우스 했다 2 주 된 BALB 남성 쥐; 이 연구에 사용 된 쥐 2 주 오래 된 남성 SD-쥐 했다.</li>
</ol>2. 마 취와 관류 수술
주의: PFA와 아크릴 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 보호구와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
<ol><li>26-게이지 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 zoletil의 30 mg/kg으로 병원 체 무료 객실에 동물 anesthetize 5 동물 모니터링-10 분.</li>
	<li>동물 마 취의 수술 평면에 도달 했습니다, 일단 마 취의 깊이 결정 하는 발가락 핀치 응답 메서드를 사용 합니다. 응답을 확인 합니다. 주: 마우스와 쥐 수술을 포함 하는 다음 단계 이전 연구11에 사용 되는 유사한 프로토콜을 따릅니다.</li>
	<li>5-6 cm 절 개 외피와 복 벽을 통해 흉 곽 아래를 확인 합니다.</li>
	<li>곡선, 무딘가 위를 사용 하 여 미리 절 개의 사이트를 찾으려고 흉부 지역 palpating 횡 경 막에 절 개를 만들기 위해.</li>
	<li>절 개 흉 흉 막 캐비티를 폭로 전체 길이 걸쳐 확장.</li>
	<li>조심 스럽게 폐 치환. 쇄 골까지 흉 곽을 통해 상처를 확인 합니다. 아이리스가 위를 사용 하 여, 좌 심 실의 후부 끝에 작은 절 개를 확인 합니다. 오름차순 대동맥, 컷된 심 통과에 무뚝뚝한 또는 올리브 밀고 관류 18 게이지 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>바늘을 장악 하 고는 hemostat로 마음을 클램핑 하 여 누설을 방지. 또는, 수정된 hemostat 사용 하 여 바늘 팁 주위 대동맥을 클램프.</li>
	<li>오른쪽 아 트리 움, 하강 대동맥에 최소한의 피해를 보장 하기 위해 돌에 큰 절 개를 확인 합니다. 쥐 관류에 대 한 준비가 지금 이다.</li>
</ol>3. 전체 관류와 쥐의 해 부
주의: PFA와 아크릴 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 보호구와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
참고: 다음 전체 관류 단계는 비슷합니다 우 외에 의해 이전 연구에서 사용 되는 프로토콜. (2016) 10 , 11.
<ol><li>심장의 오른쪽 아 트리 움 어떤 기포를 소개 하지를 돌보는 18 게이지 주사 바늘에 연결 합니다.</li>
	<li>50 mL 주사기를 사용 하 여, 신속 하 고 균일 하 게 감기 0.1 M PBS 솔루션 포함 하는 헤 파 린 (10 단위/mL)의 50 mL 펌프.</li>
	<li>연동 펌프 튜브에 18-게이지 바늘을 연결 합니다.</li>
	<li>10 mL/min의 순환 속도에 헤 파 린 (10 단위/mL)에 포함 된 감기 0.1 M PBS 솔루션의 200 mL와 함께 씻으십시오.</li>
	<li>10 mL/min의 순환 속도에 찬 4 %PFA 솔루션의 250 mL와 함께 수정. 쥐가이 단계에서 뻣 뻣 한 되어야 합니다.</li>
	<li>수집 하 고 처리를 위한 나머지 PFA 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>협정, 4 %PFA, 4% 아크릴, 및 0.25% 버지니아-044 분말의 냉장 협정 칵테일 솔루션 조직 18 게이지 바늘, perfuse 및 머리와 척추를 제거. 코에는 목에서 정중 선 절 개 하 여 두개골을 노출 합니다. 이 추가 관류 단계 psPACT와 mPACT 방법;에 대 한 필요 하지 않습니다. 고정, 후 즉시 머리와 척추를 분리 하 고 두개골을 노출.</li>
	<li>어떤 잔여 목과 척추 근육을 제거 하 여 두개골의 기지를 노출 합니다.</li>
	<li>벗 겨 두개골을 rongeurs와가 위를 사용 합니다. 뇌와 척수를 제거 합니다.</li>
	<li>4%에서 조직 저장 PFA 4 ° c; 조직 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 하이드로 겔 단위체 주입 및 쥐 및 마우스 CNS의 중 합
주의: 아크릴, SDS, α-thioglycerol 및 PFA irritants 있으며 따라서 처리 연기 후드와 적절 한 오 줌.
<ol><li>
협정 (패시브 기술 삭제)
	<ol>
<li>분리 하 고 전체 CNS (뇌와 척수) 고정된 쥐 및 쥐에서 냉장된 협정 칵테일 4 %PFA, 4% 아크릴, 및 0.25% 버지니아-044 분말 및 24 h. 확인 조직 s에 완전히 몰입은 4 ° C에서 스토어의 솔루션을 포함 하는 50 mL 튜브에 문화 olution입니다.</li>
		<li>10 분 휴지를 사용 하 여 젤 질소 탱크에 연결 된 하이브리드 시스템에 대 한 질소 가스에 샘플을 포함: 37 ° c 시스템 설정 신선한 냉 (4 ° C) 협정을 포함 하는 50 mL 튜브에 조직 전송 칵테일 솔루션 관 모자, 연결한 다음 진공에 설정.</li>
		<li>유해는 하이드로 겔, 3 h, 또는 중 합 완료 될 때까지 떨고 인큐베이터 (150 rpm, 37 ° C)에서 샘플을 포함 하는 튜브를 배치 합니다.</li>
		<li>압 지를 사용 하 여 (참조 테이블의 자료), 제거 나머지 polymerized 히드로 조직을 둘러싼.</li>
		<li>50 mL 튜브 청소 솔루션 (0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS)를 포함 하는 조직 전송.</li>
		<li>조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 놓습니다. 평균적으로, 그것은 전체 선명도 달성 마우스 CNS 약 20 일 걸립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (별도 수동 삭제 기술 처리)
	<ol>
<li>뼈 절단기와 PFA-고정 마우스와 깨끗 한 벤치에 쥐가 위 전체 CNS (뇌와 척수)를 격리 합니다.</li>
		<li>조직 전송 50 mL 튜브 4% 포함 된 PFA, 및 24 h. 4 ° C에서 저장소 확인 조직은 정착 액에 완전히 잠기 다.</li>
		<li>0.1 m M PBS에서 1 시간에 대 한 고정된 조직을 세척 하 고 A4P0 솔루션 (0.1 m M PBS에 4% 아크릴)을 전송. 24 h에 대 한 37 ° C에서 저장소.</li>
		<li>0.1 m M PBS에 씻어 5 분에 대 한 조직.</li>
		<li>0.25%에서 조직 담가 0.1 M PBS에 버지니아-044. 6-24 h, 37 ° C에서 저장 하 고 신선한 0.25% 버지니아-044/PBS 솔루션을 전송.</li>
		<li>10 분 휴지를 사용 하 여 젤 교 잡에 대 한 질소 가스에 샘플을 포함 질소 탱크에 연결 ( 테이블의 자료를 참조) 시스템: 조직 신선한 감기 (4 ° C)를 포함 하는 50 mL 튜브에 전송 0.25% 버지니아-044/PBS 솔루션, 튜브 캡과 연결. 진공을 켭니다.</li>
		<li>전송 하는 조직 솔루션 (0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS) 삭제.</li>
		<li>조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 품 어. 평균적으로, 그것은 마우스 전체 선명도 달성 하는 CNS에 대 한 약 17 일 걸립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (수정된 수동 삭제 하는 기법)
	<ol>
<li>뼈 절단기와 PFA-고정 마우스와 깨끗 한 벤치에 쥐가 위 전체 CNS (뇌와 척수)를 격리 합니다.</li>
		<li>단계-4.2.2 4.2.8 psPACT 프로토콜의 수행 합니다.</li>
		<li>전송 하는 조직 솔루션을 지우기. 협정 및 psPACT 프로토콜 달리 mPACT 0.5% α-thioglycerol 0.1 M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS 이외에 구성 된 개간 솔루션이 필요한 note. Α-thioglycerol는 더 신속 하 고 효과적으로 조직을 취소 하는 데 도움이 유엔 브라우닝 에이전트. 조직의 솔루션에 완전히 포장 되어 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 놓습니다. 평균적으로, 그것은 마우스 전체 선명도 달성 하는 CNS에 대 한 약 2 주 걸립니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 굴절률 매칭과 허가 CNS의 Immunostaining
참고: n바퀴 (Nycodenz 기반 굴절률 매칭 솔루션) 0.8 g/mL Nycodenz 분말 30 mL 기본 버퍼 (0.01% 나트륨 아 지 드와 0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 트윈-20)에 녹아 있는 이루어져 있다. 솔루션 파우더의 적절 한 solvation 수 있도록 인큐베이터 떨고 37 ° C에 배치 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>0.1%에서 조직 품 어 2 h, 0.1 m M PBS에 Triton X-100 다음 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 0.1 m M h 6에 대 한 PBS에와 차단.</li>
	<li>PBST에 세 번 섹션을 세척 (0.1 %0.1 M PBS에 트윈-20) 2 헤에 대 한 일에 대 한 섹션 주요 항 체 (이 경우, 혈관 얼룩는 반대로 토끼 PECAM CD31 항 체)에 얼룩.</li>
	<li>2 일에 대 한 2 차 항 체 (이 경우는 염소-토끼 IgG Cy3 형광 공액)에 2 %BSA 섹션을 얼룩.</li>
	<li>워시 분류 2 h, PBST에 세 번 조직 및 저장소 15 ml에서 n바퀴 2-10 일.</li>
	<li>이미징, 전에 35 또는 60 m m 조직 문화 접시에 레이블이 조직 n바퀴의 작은 금액을 이동 합니다. 접시의 아래쪽 가장자리 주위 실리콘 수정.</li>
	<li>신선한 n바퀴의 1.5-2 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>6. 이미지 처리
<ol><li>타일 confocal 레이저 스캐닝 microscopewith 10 배 확대를 사용 하 여 검색 이미지 삭제 조직의 취득 ( 재료의 표참조). 조직 Cy3 표시의 사용 하 여 550-600 nm의 파장.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+brain+imaging:+A+powerful+tool+for+neuroscience.">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810 (2017).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY.">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. 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R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY.">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75 (2014).</li><li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+(ENStem-A)+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats.">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53 (2013).</li><li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe/PS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li><li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis.">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).</li></ol>

저자는 공개 없다.

수동, 전기 이동 비 추출 방법에 고용 하는 동안 협정 크게 이전 조직 삭제 선명도2,3,,47 같은 방법으로 달성 일관성 향상 , 8, 기술은 여전히 가장 눌러 최대한 조직 선명도12를 달성 하는 데 필요한 시간의 길이 여러 가지 단점을 맺는 다. 현재 연구에서 선물...

과학 및 임상 조회의 근본적인 목적은 관련 기관의 구조와 기능;의 완벽 한 이해를 달성 그러나, 포유류 장기의 상당히 복잡 한 자연 완전히이 목표1을 달성 하는 방 벽으로 수시로 제공 합니다. 명확성 (명확한 지질 교환 아크릴 때 교배 엄밀한 이미징 호환 Tisssue-하이드로 겔)2,3,4, 건물 그대로 조직에서 히드로 아크릴 기반 하이브리드 포함, 달성 다양 한 기관, 뇌, 간, 그리고 비장를 포함 하 여5그들의 구조적 무결성 유지 하면서 광학 정리. 선명도 시각화 뿐만 아니라 복잡 한 셀룰러 네트워크 및 단면 필요 없이 조직 형태학을 정밀 하 게 해 부를 기회에 따라서 사용할 수 있습니다.
조직 허가 달성 하기 위해 선명도 샘플의 지질 콘텐츠 제거 하 전기 이동 방법을 사용 합니다. 물리적으로 안정적인 조직-히드로 하이브리드 생산에 대 한 선명도 지적 하는 동안 연구 전기 이동 조직 개간 (등) 방법의 사용 조직 품질, 브라우닝, epitope 손상을 포함 한 변수 결과 산출 하 고 단백질 손실5,6. 이러한 문제를 해결 하려면 수동, 이온-세제 기반된 delipidation 기술 등 치료를 대체 하는 협정 (수동 선명도 기술) 등 수정된 프로토콜 개발된7,,89되었습니다. 그러나 결과에 더 일관성을 달성에 불구 하 고, 협정 최대한 정리를 얻기 위해 더 많은 시간이 필요 합니다. 또한, 이러한 기술의 아무도 아직 적용 되었을 전체 CNS 양식 또는 쥐 및 기니 피그와 같은 큰 설치류 모델.
현재 연구는 psPACT (프로세스 별도 협정) 및 mPACT (수정 된 협정), 전체 CNS와 마우스와 쥐 모델10에 내부 장기의 빠른 통관을 촉진을 위한 새로운 방법론을 제안 하 여 이러한 한계를 해결 하고자 합니다. 특히, psPACT 처리 조직 4% 아크릴에 0.25% 하이드로 겔 형성; 하는 동안 두 개의 별도 단계에서 버지니아-044 mPACT는 기본적으로 동일한 단계를 수행 하지만 키 시 약으로 서 0.5% α-thioglycerol와 개간 SDS 기반 솔루션을 보완. 두 기술을 마구 크게 광학 클리어런스를 생산 하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 내 생 적인 조직 및 cerebrospinal 순환 시스템. 원리의 증거로, 허가 조직10혈관 패턴 분석에 confocal 현미경 검사 법의 사용을 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix, Inc.</td>
			<td>75819</td>
			<td>Clearing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz</td>
			<td>Axia-Shield</td>
			<td>1002424</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>161-0140</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#180;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>017-19362</td>
			<td>Polymerization (VA-044)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1753-100ML</td>
			<td>Clearing solution (mPACT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Georgiachem</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>BSA100</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>375095</td>
			<td>Perfusion (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-CD31 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-28188</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPP-9004</td>
			<td>Perfusion, Polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPB-9121</td>
			<td>Perfusion, Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL stripette</td>
			<td>Coatar</td>
			<td>4488</td>
			<td>Solution transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Clearing tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Cell culture dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>20035</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>211350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>26G 1/2</td>
			<td>Anesthetize&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>21G1 1/4</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 3MM paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z270849</td>
			<td>Blotting paper for gel removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN lite Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN 2012</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>BT100-1F</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Lifecanvas Technologies</td>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Tissue gel hybridization system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue

선명도의 개발 이후 기술 삭제 bioelectrochemical 수 있는 3 차원 표현 형 매핑 투명 한 조직 내의 다양 한 큐빅 (명확 하 고 가리지 뇌 이미징 등 새로운 개간 방법론에 대 한 칵테일 및 전산 분석), 스위치 (상호 작용 시간의 시스템 제어) 및 화학 제품의 활동, 지도 (확대는 프로테옴의 분석), 및 협정 (수동 선명도 기술)에 대 한 기존의 툴킷 확대 설립 되었습니다 생물학 직물의 현미경 분석입니다. 현재 향상 하 고 전체 중앙 신경 시스템 (CNS), 신장, 비장, 그리고 전체 마우스 배아를 포함 하 여 그대로 설치류 조직의 배열에 대 한 원래 협정 절차를 최적화 하는 것을 목표로 공부 합니다. PsPACT (프로세스 별도 협정) 및 mPACT (수정 된 협정) 되 나, 이러한 소설 기법 셀 회로 고 그대로 정상 및 병 적인 조직에서 subcellular 구조 시각화의 높은 효능 수단을 제공 합니다. 다음 프로토콜에서 우리는 psPACT 및 mPACT 통해 그들의 구조적 무결성의 최소한의 침공으로 최대한 조직 허가 달성 하는 방법에 세부, 단계별 개요를 제공 합니다.

최적화 된 수동 청소 기술을 사용 하 여 전체 CNS의 투명 한 모델의 생성
마우스와 쥐 전체 CNS 조직의 광 정리 빠른 속도로 다양 한 수동 개간 기법 (그림 1)를 사용 하 여 달성 되었다. 조직 시간이 지남에 비운의 회로도 그림 2A에 표시 됩니다. 원래 협정 메서드와 달리 psP...

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Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제

여기, 선물이 두 소설 방법론, psPACT 및 최대 광학 투명성과 조직 맥 관 구조에 그대로 설치류의 후속 현미경 분석을 달성 하기 위한 mPACT 전체 CNS.

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K 조회수.  Yonsei University College of Medicine. 여기, 선물이 두 소설 방법론, psPACT 및 최대 광학 투명성과 조직 맥 관 구조에 그대로 설치류의 후속 현미경 분석을 달성 하기 위한 mPACT 전체 CNS.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

연구

신경과학

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the identification of novel molecules active in preclinical assays from an in vitro recombinant receptor to their pharmacological effects at native receptors in rodent brain slices. For compounds binding at the benzodiazepine site of the receptor, the first step is to set up a primary screen that consists of developing radioligand binding assays on cell membranes expressing the major GABAA subtypes. Then, taking advantage of the heterologous expression of rodent and human GABAA receptors in Xenopus oocytes or HEK 293 cells, it is possible to explore, in electrophysiological assays, the physiological properties of the different receptor subtypes and the pharmacological properties of the identified compounds. The Xenopus oocyte system will be presented here, starting with the isolation of the oocytes and their microinjection with different mRNAs, up to the pharmacological characterization using two-electrode voltage clamps. Finally, recordings conducted in rodent brain slices will be described that are used as a secondary physiological test to assess the activity of molecules at their native receptors in a well-defined neuronal circuit. Extracellular recordings using population responses of multiple neurons are demonstrated together with the drug application.

Here, we present protocols to discover compounds active at GABAA receptors, from the binding to the physiology and pharmacology.

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

일반적인 마모 셋에 전체 피 질 Electrocorticographic 배열의 만성 이식

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

쥐 뇌 조직을 위한 소수성 조직 청산 방법

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

선명도 조직 클리어링 방법으로 전산 망막의 면역 염색

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제

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