עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט המוח קוריאה 21 פלוס למדעי הרפואה, אוניברסיטת Yonsei. בנוסף, עבודה זו נתמכה על ידי מענק נבחרת מחקר קרן של קוריאה (ה-NRF-2017R1D1A1B03030315).

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מחקר מתאים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Yonsei. כל החיות ניסיוני מוקרבים בהתאם לקווים המנחים של הוועדה טיפול בבעלי חיים מעבדה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Yonsei.
1. הכנת נוגדנים
התראה: Paraformaldehyde (PFA), אקרילאמיד ו נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי; חלוק, כפפות, מגן eyewear).
<ol><li>4% אקרילאמיד (א. א) פתרון (A4P0): להוסיף 20 מ של 40% אקרילאמיד פתרון עד 180 מ"ל תמיסת 0.1 M באגירה פוספט (PBS).</li>
	<li>0.25% VA-044 פתרון: להוסיף 0.5 גר' 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] אבקת dihydrochloride (VA-044) עד 200 מ"ל תמיסת 0.1 M באגירה פוספט (PBS). אמנם ניתן לאחסן את האבקה VA-044 בטמפרטורת החדר, זה להיות מאוחסן ב 4 ° C על solubilization ב- PBS. לקבלת תוצאות מיטביות, להכין רק את כמות פתרון לצורך הניסוי.</li>
	<li>פתרון קוקטייל ברית: להוסיף 10 גרם של אקרילאמיד 225 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) פתרון ולכוונן את העוצמה עד 200 מ"ל עם 4% מחברים. לפני השימוש, להוסיף 100 מ ג של אבקת VA-044 40 מ"ל של תערובת צינור חרוטי 50 מ.</li>
	<li>הסכם סליקה מאגר פתרון: להוסיף 40 גר' נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) 350 מ של 0.1 M PBS ולכוונן את העוצמה עד 500 מ"ל עם PBS 0.1 M. עבור mPACT ניקוי פתרון, להוסיף 0.5% α-thioglycerol ההסכם ניקוי מאגר פתרון.</li>
	<li>העכברים השתמשו במחקר זה היו עכברים זכרים BALB בת שבוע-2; החולדות השתמשו במחקר זה היו עכברי-SD זכר 2 בן שבועיים.</li>
</ol>2. הרדמה וניתוח זלוף
התראה: PFA אקרילאמיד הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם עיקרון השוויון הפוליטי המתאים.
<ol><li>עזים ומתנגד החיה בחדר נטול הפתוגן עם 30 מ"ג/ק"ג של zoletil באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26-מד. לפקח על החיה עבור 5-10 דקות.</li>
	<li>ברגע החיה הגיעה מטוס כירורגי של הרדמה, השתמש בשיטה הבוהן-קמצוץ תגובה כדי לקבוע את העומק של הרדמה. לאשר בעיית חוסר. הערה: השלבים הבאים לערב עכבר ועכברוש, ניתוח בצע דומה פרוטוקול המשמש במחקר הקודם11.</li>
	<li>עושים חתך 5-6 ס מ מתחת לצלעות, דרך דופן הבטן בעור.</li>
	<li>להשתמש במספריים מעוגלים, בוטה לבצע חתך הסרעפת, palpating את אזור בית החזה כדי לאתר את האתר של החתך מראש.</li>
	<li>להרחיב את החתך מעבר לכל אורכה של קשת הצלעות לחשוף את חלל הצדר.</li>
	<li>תחסיר בקפידה את הריאות. לעשות חתך דרך. קשת הצלעות עד לעצם הבריח. באמצעות מספריים איריס, לבצע חתך קטן בקצה האחורי של החדר השמאלי. הכנס של המחט אל תדאגי בלאנט או זית-שקצהו זלוף אבי העורקים, עובר דרך החדר חתוכה.</li>
	<li>לאבטח את המחט ולמנוע זליגת מאת מחבר חובק למעקה הלב עם עוצר דימום. לחלופין, השתמש עוצר דימום ששונה כדי לצבוט העורקים סביב קצה המחט.</li>
	<li>עושים חתך גדול באטריום ימין, מטפל על מנת להבטיח מינימום נזק העורקים. העכברוש מוכן כעת זלוף.</li>
</ol>3. כל זלוף, דיסקציה של עכברוש
התראה: PFA אקרילאמיד הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם עיקרון השוויון הפוליטי המתאים.
הערה: השלבים הבאים זלוף כל דומים פרוטוקול המשמש במחקר הקודם מאת Woo ואח. (2016) 10 , 11.
<ol><li>לצרף את העלייה הימנית של הלב מחט בקוטר 18, מקפיד לא להציג את כל בועות האוויר.</li>
	<li>באמצעות מזרק 50 מ ל, במהירות ובצורה שווה לשאוב 50 מ של קר 0.1 M PBS לאודנום הפארין (היחידות 10/mL).</li>
	<li>לחבר את המחט אל תדאגי הצינור של המשאבה ממברנות.</li>
	<li>לשטוף עם 200 מ של 0.1 M קר PBS פתרון המכיל הפארין (היחידות 10/mL) במהירות זרימת הדם של 10 מ"ל לדקה.</li>
	<li>לתקן עם 250 מ של 4% קר PFA פתרון במהירות זרימת הדם של 10 מ"ל לדקה. העכברוש צריך להיות נוקשה בשלב זה.</li>
	<li>לאסוף ולאחסן את הפתרון PFA הנותרים עבור סילוק.</li>
	<li>עבור ברית, perfuse רקמות עם פתרון קוקטייל צונן ברית של 4% מחברים, אקרילאמיד 4% ו- 0.25% VA-044 אבקה עם מחט בקוטר 18 ולאחר מכן הסר את הראש ועמוד השדרה. לחשוף את הגולגולת על ידי ביצוע חתך קו האמצע של הצוואר האף. שלב נוסף זלוף זה מיותר עבור השיטות psPACT ו- mPACT; לאחר קיבוע, מיד לבודד את הראש ועמוד השדרה ולחשוף את הגולגולת.</li>
	<li>לחשוף את בסיס הגולגולת על-ידי הסרת כל שריר עמוד השדרה והצוואר שיורית.</li>
	<li>השתמש rongeurs ומספריים כדי לקלף את הגולגולת. הסר את המוח ואת חוט השדרה.</li>
	<li>לאחסן את הרקמה 4% מחברים ב 4 ° C; רקמות ניתן לאחסן עד 1 לשבוע.</li>
</ol>4. הידרוג מונומר אינפוזיה, פלמור של מערכת העצבים עכבר ועכבר
התראה: אקרילאמיד, למען חברה דמוקרטית, α-thioglycerol ו- PFA המגרים, וכך צריך להיות מטופל ברדס fume ועם שתן המתאים.
<ol><li>
ברית (פסיב פינוי טכניקה)
	<ol>
<li>לבודד, תרבות של כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) מ קבוע עכברים וחולדות לרכבת התחתית 50 מ ל המכיל פתרון קוקטייל צונן ברית של 4% מחברים, אקרילאמיד 4%, ו- 0.25% VA-044 אבקה, חנות ב 4 ° C עבור ה 24 ודא כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין ה-s olution.</li>
		<li>להטביע את הדגימה גז חנקן במשך 10 דקות בעזרת טישו ג'ל מערכת הכלאה מחובר למיכל חנקן: הגדר את המערכת 37 מעלות צלזיוס. להעביר לרקמות שפופרת 50 מ ל המכיל טרי קר (4 ° C) ברית פתרון קוקטייל, להתחבר עם הצינורית, לאחר מכן את הריב.</li>
		<li>כדי פולימריזציה של הידרוג, במקום הצינור המכיל את מדגם חממה חזק (150 סל ד, 37 ° C) במשך 3 שעות, או עד הפילמור הושלם.</li>
		<li>באמצעות נייר סופג (ראה טבלה של חומרים), הסר הידרוג polymerized הנותרים של הרקמות הסובבות.</li>
		<li>להעביר את רקמת צינור 50 מ ל המכיל פתרון סליקה (8% מרחביות ב 0.1 M PBS, pH 8.0).</li>
		<li>מקם את הדגימה חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח בערך 20 ימים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (תהליך נפרד טכניקת ניקוי פסיבי)
	<ol>
<li>לבודד את כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) עם עצם קאטר ומספריים של כדורגלן-קבוע עכברים וחולדות על ספסל נקי.</li>
		<li>העברת רקמות לרכבת התחתית 50 מ ל המכיל 4% מחברים, וחנות ב 4 ° C עבור 24h. להבטיח כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין מקבע.</li>
		<li>לשטוף את הרקמה קבוע עבור 1 h ב- PBS 0.1 M, ולאחר מכן להעביר A4P0 פתרון (4% אקרילאמיד ב- PBS 0.1 M). חנות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
		<li>לשטוף את הרקמה במשך 5 דקות ב- PBS 0.1 M.</li>
		<li>לטבול את הרקמה ב- 0.25% VA-044 ב- PBS 0.1 M. לאחסן ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6-24 שעות, ולאחר מכן להעביר לפתרון VA-044/PBS טריים של 0.25%.</li>
		<li>להטביע את הדגימה גז חנקן במשך 10 דקות בעזרת טישו ג'ל הכלאה המערכת (ראה טבלה של חומרים) מחובר למיכל חנקן: להעביר לרקמות שפופרת 50 מ ל המכיל טרי קר (4 ° C) פתרון VA-044/PBS 0.25%, ולהתחבר עם הצינורית. הפעל את שואב האבק.</li>
		<li>העבר את הרקמה ניקוי פתרון (8% מרחביות ב 0.1 M PBS, pH 8.0).</li>
		<li>דגירה על מדגם חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח כ- 17 ימים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (ששונה פסיבי פינוי טכניקה)
	<ol>
<li>לבודד את כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) עם עצם קאטר ומספריים של כדורגלן-קבוע עכברים וחולדות על ספסל נקי.</li>
		<li>בצע את שלבים 4.2.2 - 4.2.8 של הפרוטוקול psPACT.</li>
		<li>העבר את הרקמה ניקוי פתרון. שים לב כי בניגוד הפרוטוקולים ברית ו- psPACT, mPACT מחייב פתרון סליקה בהיקף של 0.5% α-thioglycerol בנוסף מרחביות 8% ב- 0.1 M PBS, pH 8.0. Α-thioglycerol הוא סוכן האו ם browning המסייעת לנקות רקמות יותר במהירות וביעילות. ודא כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין הפתרון.</li>
		<li>מקם את הדגימה חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח כשבועיים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. מקדם שבירה התאמה ו Immunostaining של CNS שנוקה
הערה: nחישוקים (מבוסס-Nycodenz השבירה התאמת פתרון) מורכב אבקת Nycodenz 0.8 g/mL מומס מאגר הבסיס 30 מ ל (אזיד הנתרן 0.01% ו- Tween-20 ב 0.1 M PBS, pH 8.0). מומלץ כי הפתרון נמצא במחלקה של 37 ° C רועד חממה כדי לאפשר יוצרות נאותה של האבקה.
<ol><li>דגירה רקמות ב- 0.1% טריטון X-100 ב 0.1 M PBS כבר שעתיים, ואז לחסום עם 2% שור אלבומין (BSA) ב- PBS 0.1 M עבור 6-אייץ '.</li>
	<li>לשטוף את סעיפים 3 פעמים ב- PBST (0.1% Tween-20 ב- PBS 0.1 M) עבור ה 2 כתם מקטעים עם נוגדנים הראשי (במקרה זה, נוגדן אנטי-ארנב PECAM-CD31, אשר את כתמי הדם) במשך יומיים.</li>
	<li>כתם מקטעים עם נוגדנים משניים (בבמקרה זה, עז ארנב אנטי Cy3 אג פלורסנט המספר המשלים) ב- 2% BSA במשך יומיים.</li>
	<li>שטיפת בתווית רקמות שלוש פעמים ב- PBST עבור 2 h, חנות 15 מ"ל חישוקים n2-10 ימים.</li>
	<li>לפני הדמיה, להעביר רקמות שכותרתו כמות קטנה של nחישוקים על מנות תרביות רקמה 35 או 60-מ מ. לתקן עם סיליקון סביב הקצה התחתון של המנה.</li>
	<li>להוסיף 1.5-2 מ"ל של המכון טריים n.</li>
</ol>6. עיבוד תמונה
<ol><li>לרכוש תמונות של רקמות שנוקה עם אריח סריקה באמצעות של קונפוקלי סורק לייזר microscopewith 10 x הגדלה (ראה טבלה של חומרים). עבור התווית על-ידי Cy3 רקמות, השתמש אורכי הגל של 550-600 ננומטר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+brain+imaging:+A+powerful+tool+for+neuroscience.">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810 (2017).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY.">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY.">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75 (2014).</li><li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+(ENStem-A)+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats.">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53 (2013).</li><li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe/PS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li><li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis.">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בעוד בשיטות חילוץ פאסיביים, שאינם electrophoretic המועסקים ברית לשפר באופן משמעותי את עקביות מושגת עם רקמת הקודם ניקוי שיטות כגון בהירות2,3,4,7 , 8, הטכניקה עדיין נושאת מספר חסרונות, הקשה ביותר של אשר הוא משך הז?...

המטרה הבסיסית חקירה מדעית וקלינית כרוכה השגת הבנה מלאה של איבר מבנה ותפקוד; עם זאת, האופי המורכב ביותר של איברים יונקים לעתים קרובות מגישה כמחסום להשגת המטרה הזו1באופן מלא. בהירות (החלפת השומנים ברור hybridized אקרילאמיד נוקשה הדמיה תואמי Tisssue-הידרוג)2,3,4, הכוללת בנייה של היברידית הידרוג מבוססי אקרילאמיד רקמות ללא פגע, משיגה סיווג אופטי מגוון רחב של איברים, כולל את המוח, הכבד, הטחול, תוך שמירה על שלמות המבנה שלהם5. בהירות אפשרה ובכך לא רק ויזואליזציה, אלא גם הזדמנות דק לנתח רשתות הסלולר מורכבות מורפולוגיות רקמות ללא צורך חלוקתה.
כדי להשיג את סיווג רקמות, בהירות מעסיקה electrophoretic שיטות להסרת התוכן השומנים המדגם בהישג יד. בעוד בהירות נרשמה לייצור רקמות במצב יציב-הידרוג כלאיים, מחקרים הראו כי בזכות השימוש בשיטות ניקוי (וכו ') רקמת electrophoretic מפיקה את התוצאות משתנה מבחינת איכות לרקמות, לרבות, בראונינג, נזק epitope, ו איבוד חלבון5,6. כדי לטפל בבעיות אלה, ששונה פרוטוקולים כגון ברית (טכניקה פסיבי של בהירות), אשר מחליף את הטיפול וכד' עם טכניקה הפסיבי, חומרי יוניים delipidation מבוסס, כבר מפותחת7,8,9. למרות השגת עקביות יותר תוצאות, עם זאת, ההסכם דורש יותר זמן כדי לקבל אישור מקסימלי. יתר על כן, אף אחת משיטות אלה טרם הוחלו את כל הטופס CNS או לפי דגמים גדולים מכרסמים כגון עכברים, שרקנים.
המחקר הנוכחי מבקשת להתייחס הגבלות אלה על-ידי מציע מתודולוגיות הרומן, psPACT (ברית נפרדת תהליך) ו mPACT (שהשתנה ההסכם), להקלה על פינוי מהיר של כל מערכת העצבים המרכזית ואיברים פנימיים מודלים גם העכבר וגם עכברוש10. באופן ספציפי, psPACT מעבד רקמות אקרילאמיד 4% ו- 0.25% VA-044 בשני שלבים נפרדים במהלך היווצרות הידרוג; mPACT בעיקרו של דבר כרוך אותם שלבים, אבל תוספי תזונה פתרון סליקה מבוססי מרחביות עם 0.5% α-thioglycerol כמו מפתח תגובה כימית. בשתי הטכניקות לרתום את אנדוגני מערכתית cerebrospinal הדם ומערכות תפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי לייצר סיווג אופטי. מהווה הוכחה של עיקרון, נדגים את השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית לנתח כלי דם דפוסים רקמות שנוקה10.

<table><tbody><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>Clearing solution</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>40% Acrylamide Solution</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>Polymerization (A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&amp;acute;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>Polymerization (VA-044)</td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>Clearing solution (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>Perfusion (PBS)</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>PECAM-CD31 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-28188</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td>Perfusion, Polymerization</td></tr><tr><td>20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPB-9121</td><td>Perfusion, Buffer</td></tr><tr><td>10 mL stripette</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>Solution transfer</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Clearing tube</td></tr><tr><td>35 mm Cell culture dish</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Confocal dish</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>26G 1/2</td><td>Anesthetize&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 mL syringe</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>Polymerization (A4P0)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>Blotting paper for gel removal</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>ZEN lite Software</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>EasyGel</td><td>Tissue gel hybridization system</td></tr></tbody></table>

novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue

מאז הפיתוח של בהירות, bioelectrochemical פינוי טכניקה המאפשרת למיפוי פנוטיפ תלת מימדי בתוך רקמות שקוף, שפע של מתודולוגיות סליקה הרומן כולל מעוקב (הדמיה מוחית ברור, בלא הפרעה קוקטיילים וניתוח חישובית), מתג (פקד-מערכתיות של אינטראקציה עם הזמן) וקינטיקה של כימיקלים, מפה (מוגדל ניתוח של פרוטאום) ו ברית (טכניקה בהירות פסיבי), הוקמו להרחיב את ערכת הכלים הקיימים עבור ניתוח מיקרוסקופי של רקמות ביולוגיות. מטרות המחקר הנוכחי כדי לשפר ולמטב את הנוהל ההסכם המקורי עבור מערך של רקמות מכרסמים שלם, כולל את כל מערכת העצבים המרכזית (CNS), הכליות, הטחול העכבר כל העוברים. כינה psPACT (ברית נפרדת תהליך) ו mPACT (שהשתנה ההסכם), טכניקות הרומן אלה מספקים אמצעי מניעה תכופה מיפוי תא המעגלים והצגה של מבנים subcellular ברקמות נורמליים ופתולוגיים ללא פגע. בפרוטוקול הבא, אנו מספקים מתווה מפורט, צעד אחר צעד כיצד להשיג סיווג רקמות מקסימלי עם הפלישה מינימלי של המבנית שלהם דרך psPACT ו- mPACT.

הדור של דגם שקוף של מערכת העצבים כל באמצעות טכניקות אופטימיזציה סליקה פסיבי
סיווג אופטי של עכבר, חולדה רקמות CNS כל הושג במהירות תוך שימוש בטכניקות שונות סליקה פסיבי (איור 1). תיאור סכמטי של רקמות ניקוי במשך הזמן מו?...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue at JoVE.com

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS

כאן, אנו מציגים שתי מתודולוגיות הרומן, psPACT, mPACT, להשגת שקיפות אופטית מקסימלי וניתוח מיקרוסקופיים עוקבות של רקמות להערכת למכרסמים שלם כל מערכת העצבים המרכזית.

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

novel-passive-clearing-methods-for-rapid-production-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Views.  Yonsei University College of Medicine. כאן, אנו מציגים שתי מתודולוגיות הרומן, psPACT, mPACT, להשגת שקיפות אופטית מקסימלי וניתוח מיקרוסקופיים עוקבות של רקמות להערכת למכרסמים שלם כל מערכת העצבים המרכזית.

Video: Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Microsurgical Dissection and Tissue Clearing for High Resolution Intact Whole Retina and Vitreous Imaging

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole retina imaging techniques compared to conventional retinal flat mount preparations and sections. However, immunofluorescent imaging of intact whole retina is hindered by the opaque coatings of the eyeball, i.e., sclera, choroid, and retinal pigment epithelium (RPE) and the light scattering properties of retinal layers that prevent full thickness high resolution optical imaging. Chemical bleaching of the pigmented layers and tissue clearing protocols have been described to address these obstacles; however, currently described methods are not suitable for imaging endogenous fluorescent molecules such as green fluorescent protein (GFP) in intact whole retina. Other approaches bypassed this limitation by surgical removal of pigmented layers and the anterior segment of the eyeball allowing intact eye imaging, though the peripheral retina and hyaloid structures were disrupted. Presented here is an intact whole retina and vitreous immunofluorescent imaging protocol that combines surgical dissection of the sclera/choroid/retina pigment epithelium (RPE) layers with a modified tissue clearing method and light sheet fluorescent microscopy (LSFM). The new approach offers an unprecedented view of&#160;unperturbed vascular and neuronal elements of the retina as well as the vitreous and hyaloid vascular system in pathologic conditions.

Presented here is a protocol for intact whole retina imaging in which the outer opaque/pigmented layers of the eyeball are surgically removed, and optical clearing is applied to render retina transparent enabling the visualization of the peripheral retina and hyaloid vasculature in intact retina using light sheet fluorescent microscopy.

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Medicine

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-Presto: סליקה רקמות ביולוגיות ושיטות immunolabeling הדמיה נפח

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Biology

שחזור תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של המוח האנושי עם SHORT ו-LSFM

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its dimensions and complexity, which make imaging with micrometer resolution particularly difficult. This paper presents a protocol to perform the reconstruction of volumetric portions of the human brain by simultaneously processing tens of sections with the SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) tissue transformation protocol, which enables clearing, labeling, and sequential imaging of the samples with light-sheet fluorescence microscopy (LSFM). SHORT provides rapid tissue clearing and homogeneous multi-labeling of thick slices with several neuronal markers, enabling the identification of different neuronal subpopulations in both white and grey matter. After clearing, the slices are imaged via LSFM with micrometer resolution and in multiple channels simultaneously for a rapid 3D reconstruction. By combining SHORT with LSFM analysis within a routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain the 3D cytoarchitecture reconstruction of large volumetric areas at high resolution in a short time, thus enabling comprehensive structural characterization of the human brain.

מחבר זרקור: קידום ניתוח ציטוארכיטקטורה תלת מימדית - שחזור נפחי מהיר של המוח האנושי 

The present protocol provides a step-by-step procedure for rapid and simultaneous optical clearing, muti-round labeling, and 3D volumetric reconstruction of tens of postmortem human brain sections by combining the (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT tissue transformation technique with light-sheet fluorescence microscopy imaging in a routinely high-throughput protocol.