Unser Protokoll würde die Untersuchung neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis zu Komponentenskalen erleichtern, was für ein besseres Verständnis der Gehirnfunktionen unerlässlich ist. Unsere Clearing-Technik, ScaleSF, übt eine starke Clearing-Fähigkeit sowie ein hohes Maß an Gewebekonservierung aus, das für die gleichzeitige Visualisierung von großen und kleinen Strukturen erforderlich ist. Unser Protokoll ist besonders effektiv im Gehirn, wo neuronale Zellen ausgeklügelte Prozesse und enorme Verbindungen aufweisen und spezialisierte feine subzelluläre Strukturen anordnen.
Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, bereiten Sie Sca/eS-Lösungen wie in dieser Tabelle gezeigt vor und bedecken Sie die Proben mit Folie. Beginnen Sie den Vorgang, indem Sie jeweils acht Milliliter ScaleS0- und ScaleS4-Lösungen zu zwei separaten Vertiefungen einer Zellkulturplatte mit sechs Bohrlöchern hinzufügen und die Platte in einem Inkubator auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Übertragen Sie die Gehirnscheiben mit einem Spatel auf die vorgewärmte ScaleS0-Lösung und inkubieren Sie die Scheiben zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator bei 90 U / min.
Als nächstes übertragen Sie die permeabilisierten Gehirnschnitte in acht Milliliter PBS minus in eine Zellkulturplatte mit sechs Bohrlöchern und waschen Sie sie 15 Minuten lang, indem Sie sie in einem Orbitalschüttler bei 40 bis 60 U / min halten. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Übertragen Sie dann die Gehirnschnitte in acht Milliliter vorgewärmter ScaleS4-Lösung und inkubieren Sie sie acht bis 12 Stunden lang bei 90 U / min bei 37 Grad Celsius.
Für die Kammervorbereitung drucken Sie den Kammerrahmen und die Mikroskop-Tischadapter in 3D. Befestigen Sie den Kammerrahmen mit einem Haftkleber an einem Deckglas. Bereiten Sie 1,5% Agarose in ScaleS4D25(0)Lösung vor.
Mischen Sie die Lösung und mikrowellieren Sie sie, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Dann lassen Sie die Lösung auf 37 Grad Celsius abkühlen. Montieren Sie die gereinigte Gehirnscheibe mit einem Spatel auf das untere Deckglas der Bildgebungskammer.
Entfernen Sie die überschüssige Lösung mit einem sauberen Tuch aus der gereinigten Scheibe. Fügen Sie das ScaleS4-Gel mit einer Mikropipette in die Gehirnscheibe ein, um die Bildgebungskammer zu füllen. Legen Sie ein weiteres Deckglas mit einer Pinzette darauf, gefolgt von einem Stück Seidenpapier und einem Glasobjektträger.
Überführen Sie die Bildgebungskammer bei vier Grad Celsius in einen Kühlschrank. Legen Sie Metallgewichte auf den Glasschieber und lassen Sie sie 30 Minuten stehen. Entfernen Sie nach der Inkubation das Material aus der Bildgebungskammer und wischen Sie überschüssiges Gel ab.
Legen Sie die Abbildungskammer in eine 60 Millimeter große Petrischale aus Glas und befestigen Sie den Rand der Bildkammer an mehreren Stellen mit einem Haftkleber an der Schale. Gießen Sie die ScaleS4-Lösung in die Schale und schütteln Sie sie vorsichtig für eine Stunde bei 40 bis 60 U / min bei 20 bis 25 Grad Celsius. Ersetzen Sie es durch frische Lösung und entfernen Sie Luftblasen auf der Geloberfläche, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit einer Pipettenspitze abkratzen.
Montieren Sie die Bildgebungskammer auf einem Mikroskoptisch. Bereiten Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop vor, das mit einer Multi-Immersionsobjektivlinse mit 2,5 Millimetern Arbeitsabstand, 16-facher Vergrößerung und 0,60-numerischer Blende ausgestattet ist. Schalten Sie alle relevanten Bildgebungsgeräte wie Workstation, Mikroskop, Scanner, Laser und Quecksilberlampe ein und starten Sie eine Bildgebungssoftware.
Stellen Sie den Korrekturkragen des Multi-Immersionsobjektivs auf 1,47 ein. Tauchen Sie die Objektivlinse in die Lösung ein und lassen Sie sie sich langsam der Scheibe nähern. Entfernen Sie alle Luftblasen, die an der Spitze der Objektivlinse eingeschlossen sind.
Finden Sie Regionen von Interesse in gereinigten Geweben mit Epifluoreszenz. Um Bildaufnahmeparameter festzulegen, bestimmen Sie zunächst die Bittiefe für die Bildaufnahme, da die Größe des Bildes mit dem Bit zunimmt. Stellen Sie dann die Detektionswellenlänge entsprechend dem Emissionsspektrum ein.
Stellen Sie die XY-Auflösung, die Scangeschwindigkeit und die Pinhole-Größe ein. Passen Sie auch die Laserleistung, die Verstärkung des Detektorverstärkers und den Offset an, bis ein geeignetes Bild erhalten wird. Bestimmen Sie die Kachelgröße basierend auf der Größe des ROI und stellen Sie sicher, dass die gesamte Länge und Breite des ROI erfasst wird.
Navigieren Sie durch das Gewebe in allen Ebenen und legen Sie den Start und die Endpunkte des Stapels fest. Stellen Sie die Z-Schrittgröße entsprechend der gewünschten Z-Auflösung ein. Sammeln Sie die Bilder und verarbeiten Sie sie mit einer Bildanalysesoftware.
Mit diesem Protokoll wurde das optische Clearing einer Maus-Hirnscheibe von einem Millimeter Dicke erreicht. Die EGFP-Expression in der Großhirnrinde von PV-FFL-Mäusen zeigte, dass die Fluoreszenz und strukturelle Integrität der Gewebe erhalten blieb. Brechungsindex-Mismatch-induzierte Aberrationen verursachten einen spürbaren Verlust der Bildhelligkeit und Auflösung von EGFP-positiven Neuronen.
Diese Neuronen wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop deutlich visualisiert, als der Korrekturkragen an diese ScaleS4-Lösung angepasst wurde. Die 3D-Rekonstruktion von EGFP-markierten Neuronen im primären somatosensorischen Kortex der Maus wurde in einem einen Millimeter dicken Gehirnschnitt durchgeführt. Einzelne dendritische Lauben, die mit dendritischen Stacheln verziert waren, wurden bei höherer Vergrößerung gesehen.
Axon Terminal Arborization und axonale Boutons wurden ebenfalls in den Scheiben beobachtet. Der Abgleich des Reflexionsindex zwischen Bildgebungsflüssigkeit und Objektlinse ist für die 3D-Bildgebung in gereinigtem Gewebe von entscheidender Bedeutung. Unsere Technik würde es erleichtern, die Neuronenstruktur von Schaltkreis- zu Komponentenskalen zu integrieren und Einblicke in Neuronenmechanismen und Informationen über die Verarbeitung im Gehirn zu liefern.
