Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen des SOX5-Gens auf die Komplexität der dendritischen Arborisationsneuronen während der neuronalen Entwicklung in Drosophila zu beobachten. Diese Methode kann helfen, die Morphogenese von Neurodendriten und die Genfunktion bei der Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen, um neurodegenerative Krankheitsgene besser zu verstehen. Letztlich bietet diese Technik eine quantitative Analyse der Dendriten-Komplexität, die in vielen verschiedenen Arten von Neurodendriten verwendet werden kann.
Die Implikationen dieser Technik reichen auf den genetischen Mechanismus neurodegenerativer Erkrankungen, da Mutation den Schlüssel zum Verständnis der Genfunktion innehat. Set-up-Kreuze von UAS-GFP;ppk-GAL4 mit dem UAS-Sox102F-RNAi-Stamm fliegen oder W118-Steuerungen. Kultur die Fliegen unter Standardbedingungen bei 25 Grad Celsius.
In etwa fünf bis sechs Tagen verwenden Sie Zangen, um die dritte Instar-Larven sorgfältig zur Zerlegung zu sammeln. Legen Sie eine Larve in eine Sezierschale aus Siliziumelastomerbasis und eine Gewebekultur Petrischale. Legen Sie dann die Schale unter das Seziermikroskop.
Nun stecken Sie den Schwanz der Larve, um die Mittellinie freizulegen. Dann pin die Larven Mundhaken, so dass die Larve dorsale Seite ist oben. Nun fügen Sie 200 Mikroliter PBS in die Schale, um die Larve in Lösung einzutauchen.
Als nächstes schneiden Sie den Schwanz und den Mund von Larven mit kleinen Schnitten. Dann schneiden Sie die Larve entlang der dorsalen Mittellinie und zwischen den beiden Luftröhren, von kaudal zu rostral. Legen Sie dann einen Stift an jeder der vier Ecken des Körpers, so dass der Körper flach liegt.
Fixieren Sie nun die Larvenkörperwand in vier Prozent PFA für 25 Minuten bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Larve mit PBS dreimal für fünf Minuten pro Wäsche. Nach dem Einheben entfernen Sie die Stifte und übertragen Sie das Gewebe auf eine Glasrutsche.
Dann tauchen Sie das Gewebe in Antifade Montagemedium, und montieren Sie es mit einem Abdeckung supg. Lassen Sie das montierte Gewebe eine Stunde lang trocknen, bevor Sie den Deckel mit Fingernagellack versiegeln. Bewahren Sie diese Dias bei vier Grad Celsius im Dunkeln auf.
Erfassen Sie Bilder der Z-Serie mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv. Legen Sie zunächst den Bereich der Z-Schritte fest, um alle DA-Neuronen in die Larvenkörperwand einzubeziehen, und legen Sie die Schrittgröße auf ein halbes Mikrometer fest. Speichern Sie dann die Bilder als TIF- oder ND2-Dateien zur Verarbeitung.
Als Nächstes bewerten Sie die Anzahl und Morphologie der Dendriten auf den DA-Neuronen. Beginnen Sie mit der Bewertung ihrer Längen. Zuerst, in Fidschi ImageJ, teilen Sie die Bilder in separate Kanäle, wenn nötig.
Nur der GFP-Kanal muss bewertet werden. Als nächstes machen Sie eine Z-Projektion. Wählen Sie im neuen Fenster die maximale Intensität für den Projektionstyp aus, und wählen Sie die Start- und Stopp-Slices aus.
Klicken Sie dann auf OK, um ein Z-Projektionsbild mit klaren Dendritenprojektionen zu erzeugen. Verfolgen Sie nun die Neuriten mit dem Plug-In-Tool. Gehen Sie zunächst zum Soma des Neurons von Interesse und klicken Sie, wo ein Dendrit aus dem Zellkörper entsteht.
Klicken Sie dann auf die Spitze dieses Dendriten. Wenn die blaue Linie, die die beiden Punkte verbindet, die Länge des Neuriten verläuft, drücken Sie Y für ja. Wenn diese Zeile dann zum vollständigen Pfad des Neuriten passt, klicken Sie auf Vollständiger Pfad.
Wenn die Linie nicht in den Pfad passt, klicken Sie auf Punkte weiter entlang dieses Neuriten, um den Pfad in mehrere Liniensegmente zu biegen, die der Länge des Neurites entsprechen. Klicken Sie dann auf Pfad abschließen, und fahren Sie mit der Markierung des Pfads für das nächste Neuritit fort. Nachdem Sie alle Ablaufverfolgungspfade abgeschlossen haben, wählen Sie die Option Analyse, Pfade messen aus, um die Pfade in eine CSV-Datei zu exportieren.
Verwenden Sie diese Daten, um den Wert der Pfadlängen für die Analyse zu berechnen und zu durchschnittlich. Als Nächstes berechnen Sie die Oberfläche des Neurons. Wählen Sie zunächst das Werkzeug zum kostenlosen Zeichnen aus dem Fidschi ImageJ-Fenster aus.
Verbinden Sie dann die Endpunkte des Neurons von Interesse. Wählen Sie dann im Fenster Analysieren die Option Messen aus. Das Ergebnis wird in einem neuen Feld mit dem Wert für den ausgewählten Bereich angezeigt.
Kopieren Sie diesen Wert in die Datenanalysesoftware. Berechnen Sie schließlich die Gesamtzahl der Verzweigungen mit dem Plugin Skelettierte Pfade analysieren. Die Dendriten von DA-Neuronen wurden durch Ko-Überexexzieren von GFP in ihrem Soma und Dendritenarboren für GFP-Blütenszenz-Bildgebungsanalyse gekennzeichnet.
Die Morphologie der Dendriten wurde mit einem invertierten konfokalen Mikroskop abgebildet. Die Dendriten von DA-Neuronen wurden wie beschrieben zurückverfolgt. Die Datei wurde verwendet, um die Dendritenlänge zu schätzen.
Die Silencierung von Sox102F in DA-Neuronen in der dritten Instar-Larve führte zu einer signifikanten Verringerung der Gesamtzahl der Dendriten mit etwa der Hälfte der Astlänge und mit einer einfacheren Struktur, die nur die Hälfte der Zweige anzeigte. Logischerweise führte dies zu einer Verkleinerung der Laubenoberfläche. Dieses Protokoll bietet eine schnelle Methode, um die Entwicklung von DA-Sensorneuronen zu bewerten.
Während Sie dieses Verfahren versuchen, achten Sie darauf, eine große Anzahl von Bildern von jeder Gruppe von DA-Neuronen zu nehmen, um eine gute Abdeckung zu erhalten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie dendritanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Dendritenentwicklung zu beantworten. Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften geholfen, Rückschlüsse auf neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer mit Modellsystemen zu ziehen.
