Wir würden gerne Bettine Gibbs für ihre technische Hilfe zu bestätigen.

Jederzeit während der Durchführung aller Verfahren in diesem Protokoll tragen Sie ein Kittel, Handschuhe und Schutzbrille. Sicherstellen Sie, dass Container/Röhrchen mit Phenol und Guanidin Reagenz erfolgt nur in einem zertifizierten Haube und Phenol Abfälle in einem dafür vorgesehenen Behälter entsorgen geöffnet werden. DNAse/RNAse-freie sterilen Röhrchen, Tipps und Reagenzien zu verwenden.
(1) Zellkultur
<ol><li>Wachsen die HeLa-Zelllinie und zwei Aussetzung Mantel Zelle Lymphom Zelllinien, Granta-519 und Jeko-1, in DMEM mit 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C. Die Zellen 01:10 verdünnen und zählen mit einem Partikel Zähler14.</li>
	<li>Für RNA-Extraktion Platte 500.000 Zellen/Brunnen in einem 6-well-Platte (2 mL Medien pro Well). Nach der Inkubation für 24 h sammeln Sie RNA aus den Zellen.</li>
</ol>2. RNA-Extraktion
<ol><li>Ernte der Zellen Hinweis: Mit Ausnahme der Zentrifugationsschritt führen Sie die aufgeführten Schritte in einer Gewebekultur-Haube zu Sterilität.<ol>
<li>Für Aufhängung Zellen (Jeko-1 und Granta-519):<ol>
<li>Übertragen Sie die Zellen (zusammen mit 2 mL der Medien) auf eine 15 mL-Tube und Zentrifugieren bei 1.725 x g für 5 min. Aspirat Medien und verlassen die Zelle Pellet in den Boden des Röhrchens.</li>
			<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 50 µL 1 x Phosphat Buffered Saline (PBS). Jede Probe in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 500 µL monophasisch Phenol und Guanidin-Herstellung-Reagenz hinzufügen. Gut mischen und lassen bei Raumtemperatur (RT) für 5 min beim invertierenden Microcentrifuge Schlauch alle 1 Minuten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für anhaftende Zellen (HeLa):<ol>
<li>Aspirieren Sie Zellkulturmedien aus jedem Brunnen. Fügen Sie 1 mL PBS in jede Vertiefung Schmutz abwaschen.</li>
			<li>Entfernen der PBS und 500 µL monophasisch Phenol und Guanidin-Herstellung-Reagenz in jede Vertiefung.</li>
			<li>5 min mit sanftes Schaukeln bei RT inkubieren. Auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zell-Lyse<ol>
<li>Frieren Sie das Phenol und Guanidin erfolgt Zelle Gemisch bei-20 ° C für 1 h. Hinweis: Die Mischung kann bei-20 ° C über Nacht oder bis benötigt gelassen werden.</li>
		<li>Phenol und Guanidin erfolgt Zelle Masse auf Eis auftauen. Die Microcentrifuge Schlauch in einer PCR-Kapuze 100 µL Chloroform hinzufügen. Vortex ist die Probe für 10-15 s bis die Mischung, rosa und undurchsichtig. Inkubieren Sie die Probe auf dem Eis (bei 4 ° C) für 15 min.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe für 15 min bei 20.800 x g und 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig die obere farblose wässrige Phase (~ 200 µL) und die Übertragung zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA-Niederschlag<ol>
<li>Jede Probe ein gleiches Volumen von Isopropanol hinzufügen. Fügen Sie 1 µL des Coprecipitant (siehe Tabelle der Materialien), jeweils als Träger für die RNA zu handeln und helfen die RNA in den nachfolgenden Schritten zu visualisieren. Inkubation der Probe bei-80 ° C für mindestens 4 h. Für beste Ergebnisse Inkubation über Nacht bei-80 ° C.</li>
		<li>Übertragen Sie die Probe auf einer gekühlten Zentrifuge. Zentrifuge für 35 min bei 20.800 x g / 4 ° C; die RNA wird als ein blauer Fleck auf dem Boden des Röhrchens angezeigt. Entfernen Sie vorsichtig das Isopropanol aus der Probe. Fügen Sie 500 µL von 80 % Ethanol und Aufschwemmen der Pellets durch kurz aufschütteln für 3 s.</li>
		<li>Zentrifuge der Probe bei 20.800 x g bei RT 5 min das Ethanol aus der Probe entfernen Lassen Sie die Probe an der Luft trocknen für ca. 10 min. Aufschwemmen die Probe in 35 µL RNAse-freies Wasser. Legen Sie auf einem Heizblock (65 ° C) für 5 min um sicherzustellen, dass die RNA vollständig in Lösung ist, und sofort das Rohr auf dem Eis.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Konzentration des Gesamt-RNS mit einem Spektralphotometer, wie zuvor beschrieben, außer 1,5 µL der Probe RNA anstelle von 1 µL15verwenden. Optional laufen Sie 1 µg Gesamt-RNS auf einem 1 % Agarosegel zu bestimmen, die Integrität der RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) DNase-Behandlung
<ol><li>Führen Sie nach der Quantifizierung der RNA DNAse-Behandlung auf die Gesamt-RNS zu jeder genomischen DNA zu erniedrigen. Fügen Sie für jede Probe die folgenden Reagenzien aus dem RNAse-freie DNAse-Kit 20 µL Gesamt Reaktion in einem separaten Microcentrifuge Schlauch mischen zu machen hinzu:<ol>
<li>Mix 2 µL DNase 10 X Reaktion Puffer mit 4,4 µg Gesamt-RNA. Auf insgesamt 14 µL mit Wasser zu bringen.</li>
		<li>Fügen Sie 2 µL RNase-freie DNAse. Inkubation bei 37 ° C für 30 min in Anwesenheit von 2 µL RNase-Inhibitor (aus dem Reverse Transcription Kit).</li>
		<li>Fügen Sie 2 µL Stopplösung und Wärme auf einem Heizblock für 10 min bei 70 ° C, das Enzym DNAse zu inaktivieren. Hinweis: DNAse-Behandlung ist optional.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) cDNA Synthese
Für eine endgültige Reaktionsvolumen von 50 µL:
<ol><li>Für eine endgültige Reaktionsvolumen von 50 µL: Transfer 22 µL der DNase RNA behandelt, um eine neue Röhre oder Transfer 4 µg von Gesamt-RNS mit Zusatz von Wasser auf ein Gesamtvolumen von 22 µL zu einem neuen Schlauch. Fügen Sie 2 µL der T7-Oligo-dT25 Primer von 10 µM Primer Lösung. Die Sequenz für die T7-Oligo-dT25 Grundierung ist 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ".</li>
	<li>Fügen Sie aus dem Reverse Transcription Kit 2 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL), 8 µL des Puffers Reaktion 5 X 4 µL 10 mM dNTPs und 2 µL Reverse Transkriptase (200 U/µL hinzu). Hinweis: Richten Sie eine Reaktion ohne Reverse Transkriptase als Negativkontrolle zu handeln.</li>
	<li>Inkubieren Sie bei 42 ° C für 1 h Transfer direkt zum Eis. Erhitzen Sie das Rohr bei 75 ° C für 5 min und das Rohr auf Eis.</li>
</ol>(5) Primer Suche nach Fusion gen Transcript
<ol><li>
Besser gekleideteres design
	<ol>
<li>Download der cDNA-Sequenz aus dem Ensemble Genom Browser (ENST00000360839.6/NM_017747), und eine Region innerhalb der ORF das Ziel Transkript (ANKHD1) stromaufwärts von der Stopp-Codon zu identifizieren. Kopieren und einfügen die gesamte Region (bis zu 700 Nukleotide) mit Sequenzen stromaufwärts von der Stopp-Codon in der Sequenz Eintrag Region die Primer-Design-Software (< Https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>Wählen Sie die Option Show kundenspezifisch anfertigen und 10 für die Anzahl der Zündkapseln, dass das System (Ergebnisse, die zurückgegeben) generieren soll und lassen Sie alle anderen Parameter auf den Standardwert zurückgesetzt.</li>
		<li>Wählen Sie fünf forward Primer und zwei umgekehrte Zündkapseln, die sich nicht überschneiden. Bestellen Sie Grundierungen und rekonstruieren mit RNAse/DNAse-freies Wasser, eine Endkonzentration von 10 µM. Weitere Informationen zu allgemeinen besser gekleideteres Design für PCR sind an anderer Stelle behandelt16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR, potenzielle Primer für den Einsatz in folgenden 3' Rennen zu identifizieren Hinweis: Um die endgültige vorwärts Primer zu verwenden, in der Reaktion zu bestimmen, testen Sie die gestalteten Primer indem Sie verschiedene Kombinationen von forward und reverse Primer für regelmäßige PCR in einer PCR-Haube einrichten.<ol>
<li>Übertragen Sie die cDNA (2 µL) auf ein frisches 0,5 mL PCR Rohr. Fügen Sie 1 µL der forward Primer und 1 µL der rückwärts-Primer (aus einer 10 mM-Grundierung-Lösung). Machen Sie bis zu 12,5 µL, indem 8,5 µL Nuklease-freies Wasser. 12,5 µL 2 x PCR-Gel Master Mix hinzufügen.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgenden PCR Radfahren Thermik: 95 ° C für 2 min gefolgt von 29 Zyklen von 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min. der letzte Zyklus bei 68 ° C 7 min eingestellt.</li>
		<li>Laufen Sie nach der PCR Produkte auf einem 1 % Agarose-Gel mit Interkalation Bromid befleckt. Details der Elektrophorese sind mit ein paar Modifikationen17wie zuvor beschrieben.<ol>
<li>Lösen Sie 1 g Agarose in 100 mL Puffer Tris-Acetat (TAE) in einen 250-mL-Kolben. Kochen Sie in der Mikrowelle.</li>
			<li>Abkühlen lassen für 1 min und 7,5 µL Interkalation Bromid-Lösung (10 mg/mL Brühe) in einer Dampfhaube hinzufügen. Mischen Sie gut durch Schütteln der Flasche und gießen Sie in eine horizontale Gel-Apparat. Lassen Sie bei RT in der Dunstabzugshaube für mindestens 30 min erlauben das Gel zu festigen.</li>
			<li>Decken Sie das Gel mit 1 X TAE-Puffer und laden Sie 10 µL des PCR-Produkts auf das Agarosegel zusammen mit 3 bis 5 µL DNA Molekulargewicht Leiter. Bei 175 V für 10 min. visualisieren die Produkte mit einem Imager laufen Sie, und ob weitere Trennung der Produkte erforderlich sind, führen Sie das Gel für eine weitere 5-10 min.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auswahl von verschachtelten Zündkapseln für 3' Rennen
	<ol>
<li>Analysieren Sie die Ergebnisse der Agarosegel PCR Primer auswählen, die eine ausgeprägte, starke, einzelne PCR-Band haben. Verwenden den 5'-die meisten Primer (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3 ") zusammen mit dem T7 OligodT25 Primer in der ersten PCR ausführen.</li>
		<li>Wählen Sie die verschachtelte Grundierung, die flussabwärts die erste Fibel befindet (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3 "), und verwenden Sie es mit dem T7-Primer (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3") im zweiten Satz der PCR-Reaktionen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Optimierung 3' Rennen der 3' UTR mit Hilfe von zwei verschiedenen Enzymen zuordnen
Hinweis: Gab es eine Zunahme der Vielfalt der DNA-Polymerasen für PCR verwendet; Daher wollten wir standard-Bedingungen zu bestimmen, die angewendet werden können, auch wenn verschiedene Enzyme für 3'-RACE-PCR-Reaktionen. Die reverse Primer für jede Abschrift sind konstant gehalten; die einzigen Änderungen sind in die verschachtelte forward Primer, die spezifisch für das Ziel-Protokoll sind.
<ol><li>
Protokoll 1:3 "Rennen mit einem veränderten DNA-Polymerase aus Pyrococcus Furiosus (Pfu)
	<ol>
<li>Erste PCR<ol>
<li>Übertragen Sie 1 µL cDNA zu einem PCR-Schlauch zu, und fügen Sie 5 µL 10 X Pfu Reaktion Puffer. Fügen Sie 1 µL der erste verschachtelte forward Primer, 1 µL T7 OligodT25 Grundierung und 1 µL von dNTPs (aus einer 10 mM-Lösung).</li>
			<li>Machen Sie bis zu 49 µL Gesamtvolumen von 40 µL Wasser hinzufügen. 1 µL der Pfu DNA Polymerase hinzufügen und gut verrühren. Führen Sie die PCR mit dem PCR-Profil in Tabelle 1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zweite PCR<ol>
<li>Übertragen Sie 2 µL der Produkte aus der ersten PCR zu einem neuen PCR-Schlauch und vermischen Sie sich mit 5 µL 10 X PfuUltra II Reaktion Puffer. Fügen Sie 1 µL der zweiten verschachtelten PCR-Primer, 1 µL der T7 Grundierung und 1 µL von dNTPs (10 mM-Lösung).</li>
			<li>Machen Sie bis zu 49 insgesamt µL Reaktionsvolumen durch 39 µL Wasser hinzufügen. Fügen Sie 1 µL der Pfu DNA Polymerase. Führen Sie die PCR mit dem gleichen PCR-Profil als das erste PCR Setup (Tabelle 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protokoll 2:3 "Rennen mit einem chimeric DNA-Polymerase bestehend aus einem DNA-bindende Domäne verschmolzen zu einem Pyrococcus-wie Korrekturlesen Polymerase PCR-master-Mix
	<ol>
<li>Erste PCR<ol>
<li>Übertragen Sie 1 µL cDNA auf ein PCR-Rohr. Fügen Sie 1 µL der erste verschachtelte forward Primer und 1 µL T7 OligodT25 Grundierung. Machen Sie bis zu 25 µL, indem 22 µL Wasser.</li>
			<li>25 µL 2 x PCR Master Mix hinzufügen und gut verrühren. Nutzungsbedingungen der PCR Radfahren in Tabelle 2beschrieben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zweite PCR<ol>
<li>Übertragen Sie 2 µL der Produkte aus der ersten PCR auf eine neue PCR-Rohr. Fügen Sie 1 µL der zweiten verschachtelten PCR-Primer zusammen mit 1 µL der T7-rückwärts-Primer.</li>
			<li>Machen Sie bis zu 25 µL, indem 22 µL Wasser. 25 µL 2 X PCR Master Mix hinzufügen. Führen Sie die PCR mit dem gleichen PCR-Profil als das erste PCR Setup (Tabelle 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Überprüfen Sie die zweite PCR-Produkt von 3' Rennen.
<ol><li>Nehmen Sie 5 bis 10 µL der zweiten PCR-Produkt (sowie Produkt aus der ersten Runde der PCRs sofern das Transkript reichlich bemessen ist) und laufen auf einem Agarosegel. Richten Sie das Gel und führen Sie die Elektrophorese wie oben beschrieben (Schritte 5.2.3.1., 5.2.3.3). Visualisieren Sie die Ergebnisse auf ein Imager.</li>
</ol>8. Produkt Reinigung und Sequenzierung
<ol><li>Reinigen Sie die Gel-PCR-Produkte von der zweiten PCR mit dem Gel und PCR-Fragment DNA-Clean-Up System entsprechend des Herstellers Protokoll.</li>
	<li>Führen Sie Sanger Sequenzierung (Alternativ senden Sie das Gel gereinigt, PCR-Produkt-Proben und entsprechende Sequenzierung Primer zur Sequenzierung Labor). Analysieren Sie die Sequenzierungsdaten nach Sanger Sequenzierung.</li>
	<li>Sequenz-Analyse Software herunterladen (siehe Tabelle der Materialien) und die Trace-Dateien in die Software importieren. Verwendung der einzelnen reine Basis QVs (Werte), die Basis zu erhalten rufen Sie Informationen18. Das Chromatogramm mit hochwertigen Spuren zur Ansicht herunterladen. Optional: Das Gel gereinigtes Produkt kann geklont werden mit einer entsprechenden Klonen Kit und isolierten Klone für Sanger geschickt Sequenzierung.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Trotz des Aufkommens der massiven parallelen Sequenziertechnologien auf Basis gen von gen bleibt 3' Rennen immer noch die einfachste und wirtschaftlichste Methode zur Identifizierung der PAS und Nukleotide angrenzend an das Poly-Heck. Die hier beschriebene Anpassung erweitert mit 3' Rennen sowohl verstärken als auch Karte Sequenzen, die einen Teil des ORF, das Stopp-Codon und die gesamte 3' UTR der ANKHD1 mRNA Abschrift enthalten. Ein großer Vorteil von 3' RACE ist, dass Produkte von 3' Rennen mit ein paar kle...

Die Bildung von 3'-Ende ist ein entscheidender Schritt in mRNA-Reifung, die besteht aus der Spaltung der Pre-mRNA flussabwärts ein Pas, gefolgt von dem Zusatz von ~ 250 Untemplated Adenines, die Poly Tail1,2ausmachen. Poly-Bindeprotein (PABP) bindet an das Poly-Heck, und das schützt die mRNA-Transkript vor Abbau und erleichtert die Übersetzung1.
Aktuelle Schätzungen gehen davon aus, dass 70 % der menschlichen Gene mehrere PASs haben und somit alternative Polyadenylation, wodurch mehrere 3' Enden3zu unterziehen. So ist es wichtig zu erkennen, wo die Poly-Rute für den Rest der 3' UTR legt, sowie identifizieren die PAS von jeder gegebenen Protokoll verwendet. Das Aufkommen der Sequenzierung der nächsten Generation führte die gleichzeitige Identifikation von 3' wo und den PASs von tausend Genen. Dieser Anstieg der Sequenzierung Fähigkeit erforderte die Entwicklung von der bioinformatische Algorithmen für die Datenanalyse mit alternative Polyadenylation vom 3'-Ende. Für die de-Novo -Erkennung oder Validierung des PAS und damit des 3' Endes einzelner Gene von großflächigen Sequenzierungsdaten mapping bleibt 3' Rennen die Methode der Wahl4,5. Die Sequenzen in cDNA-Produkte von 3' Rennen enthalten normalerweise enthalten nur einen Teil der 3' UTR, die Poly-Tail, die Spaltstelle, PAS und die Sequenzen stromaufwärts des PAS enthält. Im Gegensatz zu PCR, wonach die Gestaltung und Nutzung von Gen spezifische forward und reverse Primer benötigt 3' Rennen nur zwei Gen spezifische verschachtelte forward Primer. PCR erfordert daher eine genauere Kenntnis der Nukleotidsequenz einer großen Region des Gens wird verstärkt4,6. Da 3' Rennen verwendet umgekehrt das gleiche Grundierung, dass Ziele der poly(A) tail für alle Polyadenylated RNA-Transkripte, nur die forward Primer gen spezifische, müssen somit nur erfordern Kenntnisse über eine deutlich kleinere Region der mRNA. Dies ermöglicht die Verstärkung der Regionen, deren Sequenzen nicht vollständig charakterisiert4,7. Dadurch konnten 3' Rennen verwendet werden, nicht nur um festzustellen, das 3'-Ende eines Gens, sondern um auch zu bestimmen und zu charakterisieren, große Regionen oberhalb des PAS, die einen erheblichen Teil der 3' UTR bilden. Durch die Kombination von 5' Rennen mit der modifizierten 3' Rennen, die größere Teile der 3' UTR und flankierenden Regionen umfasst, ist es möglich, vollständig sequenzieren oder Klonen eine gesamte mRNA-Transkript von 5'-Ende, deren Ende 3'8.
Ein Beispiel für die Anwendung der geänderten 3' RACE ist die jüngste Identifizierung eines Romans CCND1-MRCK Fusion gen Abschrift von Mantel-Zell-Lymphom-Zell-Linien und Krebspatienten. Die 3' UTR bestand aus Sequenzen aus der CCND1 und MRCK Gene und widerspenstigen MiRNA Verordnung9war. Die zwei verschachtelte CCND1 spezifische vorwärts Primer wurden ergänzend zu der Region unmittelbar neben und hinter der CCND1 -Stopp-Codon. Obwohl ganze Transkriptom Sequenzierung zusammen mit spezifischen Bioinformatic Hilfsmittel verwendet werden kann, um gen Fusionen innerhalb der 3' UTR-10zu erkennen, können viele Labore fehlen die finanziellen Mittel oder Bioinformatic Know-how, um diese Technologie nutzen. Daher ist 3' Rennen eine Alternative zur de-Novo -Identifizierung und Validierung von Roman Fusionsgene mit der 3' UTR. In Anbetracht der drastische Anstieg der Zahl der gemeldeten Fusionsgene sowie die Transkripte durchlesen, 3' Rennen ein mächtiges Werkzeug bei der Charakterisierung von Gen-Sequenzen11,12geworden. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass diese verschiedenen Sequenzen innerhalb der 3' UTR sowie die Länge der 3' UTR mRNA-Transkript Stabilität, Lokalisierung, Übersetzbarkeit und Funktion13beeinflussen kann. Zum Teil auf ein verstärktes Interesse bei der Zuordnung des Transkriptoms, gab es eine Zunahme der Anzahl der verschiedenen DNA-Polymerasen für den Einsatz im Labor entwickelt. Es ist wichtig, festzustellen, was Arten von Änderungen an die 3' Rennen Protokoll in bestellen, nutzen Sie die verfügbaren Repertoire von DNA-Polymerasen erfolgen können.
Diese Arbeit Berichte Anpassung 3' Rennen die gesamte 3' UTR zuordnen, die PAS und die 3' Ende Spaltstelle der ANKHD1 Abschrift mit Primer im Abschnitt ANKHD1 die Abschrift und zwei verschiedene DNA-Polymerasen verschachtelt.

<table><tbody><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Cervical cancer cell line.</td></tr><tr><td>Jeko-1 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Granta-519 cells</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal bovine serum for cell culture.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>Antibiotic and antimycotic.</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>Coprecipitant.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.</td></tr><tr><td>Nuclease Free-Water</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Solution</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma&amp;nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&amp;nbsp; containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase treatment kit.</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>Used for&amp;nbsp; reverse transcription of mRNA into&amp;nbsp; cDNA synthesis. Kit includes&amp;nbsp; Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.</td></tr><tr><td>Pefect size 1Kb ladder</td><td>5 Prime</td><td>2500360</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.</td></tr><tr><td>Low Molecular Weight Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spectrophotometer.</td></tr><tr><td>Wide Mini-Sub&amp;nbsp;Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Power supply for gel electrophoresis.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR thermocycler.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot&amp;nbsp; TOP10 Chemically Competent E. coli cells</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>MyPCR Preparation Station Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>Hood dedicated to PCR work.</td></tr><tr><td>Hamilton SafeAire II fume hood</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Fume hood.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Z1&amp;nbsp;Particle&amp;nbsp;Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>Particle counter. For counting cells before plating&amp;nbsp; for RNA extraction.</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td><td>Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>Software to analyze Sanger sequencing data.</td></tr></tbody></table>

adapting 3' rapid amplification of cdna ends to map transcripts in cancer

Reifung der eukaryontischen mRNAs beinhaltet 3' Ende Bildung, beinhaltet die Zugabe eines Poly-Schwanzes. Um die 3'-Ende eines Gens abbilden zu können, ist die traditionelle Methode der Wahl 3' schnelle Verstärkung der cDNA enden (3' Rennen). Protokolle für 3' Rennen erfordern sorgfältige Planung und Auswahl der verschachtelten Primer innerhalb der 3' untranslatierten Region (3' UTR) des Zielgens von Interesse. Mit ein paar Modifikationen kann jedoch das Protokoll verwendet werden, um die gesamte 3' UTR und Sequenzen innerhalb der offenen Leserahmen (ORF), bietet ein noch umfassenderes Bild der Beziehung zwischen dem ORF und der 3' UTR. Dies ist neben der Kennzeichnung Polyadenylation Signal (PAS), sowie der Spaltung und Polyadenylation Website von herkömmlichen 3' Rennen zur Verfügung gestellt. Erweiterte 3' Rennen erkennt ungewöhnlichen 3' wo, einschließlich gen Fusionen innerhalb der 3' UTR, und die Sequenzinformation kann verwendet werden, um vorherzusagen, potenzielle MiRNA Bindungsstellen sowie AU reichen destabilisierende Elemente, die die Stabilität der Abschrift beeinträchtigen können.

Verschachtelte Forward Primer suchen:
Das Agarosegel von Abbildung 1 zeigt zwei unterschiedliche PCR-Gelprodukte (Bahnen 1 und 2), welche das gleiche Grundierung aber verschiedene reverse Primer weiterleiten. Bahn 3 hat ein eindeutig identifizierbares PCR-Produkt und hat eine ausgeprägte vorwärts- und Grundierung. Die ideale Primer für die PCR-basierten Reaktion zu verwenden sind di...

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Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Die zwei verschiedenen 3' schnelle Verstärkung der cDNA enden (3' Rennen) Protokolle beschrieben hier machen Verwendung von zwei verschiedene DNA-Polymerasen Sequenzen zuordnen, die ein Segment der offenen Leserahmen (ORF), das Stopp-Codon und die gesamte 3' UTR eine Niederschrift mit RNA enthalten aus verschiedenen Krebszelllinien gewonnen.

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

adapting-3-rapid-amplification-cdna-ends-to-map-transcripts

Research

JoVE Journal

Genetics

12.2K Aufrufe.  Butler University. Die zwei verschiedenen 3' schnelle Verstärkung der cDNA enden (3' Rennen) Protokolle beschrieben hier machen Verwendung von zwei verschiedene DNA-Polymerasen Sequenzen zuordnen, die ein Segment der offenen Leserahmen (ORF), das Stopp-Codon und die gesamte 3' UTR eine Niederschrift mit RNA enthalten aus verschiedenen Krebszelllinien gewonnen.

Serie: Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Forschung

Krebsforschung

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

Transkriptom-Analyse von Einzelzellen

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Neurowissenschaften

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

Kartierung der Struktur-Funktions-Beziehungen ungeordneter onkogener Transkriptionsfaktoren mittels Transkriptomanalyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biologie

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Medizin

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3' Ende Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung mit A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Rapid Amplification of cDNA Ends

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3 
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research 
2Department of Cell and Tissue Biology,&#160; 
3Cardiovascular Research Institute, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USA&#160; &#160;&#160;
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a technique that allows amplification of full-length cDNA from mRNA by extending to the 3&#8217; or 5&#8217; end, even without prior knowledge of the sequence (Frohman et al., 1988). In contrast to regular PCR, it uses only one specific PCR primer and a second non-specific primer that will indiscriminately bind to most mRNAs. Depending on whether the area to be amplified is on the 3&#8217; or 5&#8217; end of the mRNA, the second primer is chosen to bind the polyA tail (3&#8217; end) or a synthetic linker added to all transcripts (5&#8217; end). These primer combinations are known to yield &#8220;one-sided&#8221; or &#8220;anchored&#8221; PCR due to PCR amplification using the known sequence of one side- 3&#8217; or 5&#8217;(Ohara et al., 1989). The approach allows the capture of gene-specific rare mRNAs that otherwise would be hard to detect, e.g. because of their relatively low expression or unknown complete sequence (Frohman et al., 1988).
RACE is initiated with a reverse transcription step (RT) to synthetize single stranded complimentary DNA (cDNA) from mRNA. This is followed by two consecutive PCRs that amplify the cDNA fragments from a gene of interest. To perform RACE, the sequence of the gene of interest must be at least partially known, as it is needed to design the gene-specific primers (GSPs; Frohman, 1994; Liu and Gorovsky, 1993). As the second primer pair is a generic primer that will anneal to all transcripts present in the sample, the specificity of the PCR reactions is reduced. RACE is therefore ideally performed with two nested PCRs to lower the chances of amplifying non-specific transcripts (Figure 1). Depending on the direction of amplification relative to the GSP, the technique is categorized as 5&#8217; or 3&#8217; RACE (Figure 1).&#160;
3&#8217; RACE (Figure 1A) takes advantage of the poly(A) tail present in mRNAs as a generic binding site for the non-specific primer. This simplifies the technique, as one can synthetize cDNA by using oligo (dT) primers. GSPs are located in the 5&#8217; region of the transcripts. This RACE variant allows the detection of transcript variants and different 3&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007a). In 5&#8217; RACE (Figure 1B), GSPs are located in the 3&#8217; region of the gene. To be able to use a non-specific primer that binds to all transcripts, an adapter that serves as generic primer binding site is attached to the 5&#8217; RNA ends. To attach the adapter to the mRNA, the 5&#8217; cap that protects mRNAs against exonucleases and promotes translation must be removed (Bird et al., 2016). Opposed to 3&#8217; RACE, 5&#8217; RACE helps finding differential 5&#8217; splice variants and alternative 5&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007b).
Here we will perform 3&#8217; RACE to identify and isolate different transcript variants using the known 5&#8217; sequence (Figure 2A) encoded by the Drosophila dSmad2 (Smox) gene. dSmad2, a fly Smad protein, is an important transducer of Activin-&#946; signaling, a pathway of the TGF-&#946; superfamily. dSmad2 regulates multiple cellular processes, such as cell proliferation, apoptosis and differentiation (Upadhyay et al., 2017). As differentially spliced transcripts of dSmad2 may have different functions in the adult fly, a first step in exploring these potential functions is to assess all transcript variants of dSmad2 at this developmental stage.

Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
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Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Zusammenfassung

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Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

Transkriptom-Analyse von Einzelzellen

Kartierung der Struktur-Funktions-Beziehungen ungeordneter onkogener Transkriptionsfaktoren mittels Transkriptomanalyse

ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

3' Ende Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung mit A-seq2

Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden

Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Zusammenfassung

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Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

Transkriptom-Analyse von Einzelzellen

Kartierung der Struktur-Funktions-Beziehungen ungeordneter onkogener Transkriptionsfaktoren mittels Transkriptomanalyse

ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

3' Ende Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung mit A-seq2

Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA