Pool Design und Oligo Erholung <ol><li> Der erste Schritt ist, die pre-mRNA-Pool Design studiert werden. Dies kann mit Hilfe der UCSC Genome Browser und das Herunterladen bestimmter Gene, Spleißstellen oder anderen Bereichen von Interesse sein. </li><li> Sobald die Fenster von Interesse ausgewählt wurden, Fliesen über sie rechnerisch unter den folgenden Bedingungen: read Länge sollte 30 Nukleotiden mit einer 10 Nukleotid überlappen, so daß jeder Oligo ist 20 Nukleotide aus dem Stand eins verschoben werden. * Oligo überschneiden sollten in der Nähe Spleißstellen erhöht werden, um ausreichenden Versicherungsschutz zu sorgen; zunehmende Überlappung von 10 bis 20 Nukleotide können dies zu erreichen. </li><li> Flanke jedes 30-Nukleotid-Oligo mit Universal Primer-Sequenzen, mit denen in den Pool hinter verstärken wird. Tiled Oligo Aufträge sollten an Agilent, wo die Sequenzen auf einem benutzerdefinierten Oligonukleotid-Microarray gedruckt werden eingereicht werden. </li><li> Zur Wiederherstellung der DNA Oligos aus der Microarray-Oberfläche, indem Sie das Array Deckglas in einem Array Hybridisierung Kammer und sanft Pipettieren 500 &amp;mgr; l dH 2 O auf der Folie beginnen </li><li> Sandwich das Array auf der Oberseite des Deckels schieben und darauf achten, Luftblasen, die den Prozess stören können vermieden werden. Achten Sie darauf, um das Array Gesicht Platz nach unten, so dass die Seite mit den Oligos ist die Berührung der Oberfläche des Wassers. Eine gute Faustregel ist, &quot;Agilent Agilent berührt&quot; bedeutet, dass die Agilent-Label auf dem Array der Agilent-Label Gesichter auf dem Deckglas </li><li> Schließen Sie die Hybridisierung Kammer und drehen über Nacht bei 99 ° C in einem Hybridisierungsofen </li><li> Am folgenden Tag, entfernen Sie vorsichtig das Array aus der Kammer und ziehen Sie das Wasser, das nun die Oligos befreit von der Array-Oberfläche. Dies ist die Oligo-Pool </li><li> Setzen Sie den Pool in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und beschallen den Pool bei 50% Amplitude für 3-5 Sekunden-Takt </li><li> Next, verstärken den Pool von Low Cycle PCR, mit der Universal Primer mit einem T7-Tag am Ende angehängt. Für die erste Runde, denaturieren bei 94 ° C für 1 Minute bei 55 ° C tempern für 20 Sekunden, und längliche für 1 Minute bei 72 ° C. Für den folgenden Runden, do 10 Sekunden, 20 Sekunden und 10 Sekunden auf der jeweiligen Temperatur, mit einem letzten Elongationsschritt von 5 Minuten bei 72 ° C. Da die Anzahl der Zyklen notwendig, um den Pool zu verstärken, hängt von der Effizienz der Oligo Erholung, kann es notwendig sein, um mehrere Taktzahlen versuchen. Achten Sie darauf, nicht zu stark verstärken den Pool, die durch eine verschmierte Bande auf ein Acrylamid-Gel bezeichnet wird. PCR-Proben können bei 4 ° C gelagert werden, bis sie benötigt. </li><li> Der letzte Schritt in Oligo Vorbereitung ist, um RNA zu transkribieren über die MEGAshortscript ™ Kit von Ambion. * Das folgende Protokoll wurde von Ambion angepasst <ol class="lalpha"><li> Auftauen T7 10x Reaktionspuffer, vier Ribonukleotid Lösungen und Wasser bei Raumtemperatur unter Beibehaltung der T7-Enzym-Mix auf Eis </li><li> Montieren Sie die Reaktionsmischung in ein RNase-freies Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur. Komponenten der Reaktion Puffer kann Template-DNA zu fällen führen, wenn die Reaktion auf Eis vermischt wird. </li><li> In der folgenden Reihenfolge, Pipette 3 ul Nuklease-freies Wasser, 2 ul der 10x Reaktionspuffer, 2 &amp;mgr; l je 75 mM NTP-Lösung, 5 ul der Template-DNA (die PCR Oligo-Pool) und 2 ul T7-Enzym, für ein Endvolumen von 20 ul </li><li> Flick das Rohr vorsichtig, um die Reaktion dann kurz zentrifugieren der Mischung am Boden des Röhrchens zu sammeln mischen. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktion in einem Thermocycler bei 37 ° C für 2 Stunden. Inkubationszeit werden Template-abhängigen, daher kann es erforderlich sein, um eine Zeit-Gänge-Experiment zu verwenden, um die optimale Inkubationszeit für maximale Ausbeute zu bestimmen </li><li> Nach 2 Stunden, entfernen Sie die Template-DNA durch Zugabe von 1 ul der Turbo DNase, um die Reaktion und bei 37 ° C für weitere 15 Minuten </li><li> Beenden Sie die Reaktion und Wiederherstellung der RNA durch Phenol / Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. <ol class="lalpha"><li> Für einen 20 ul Reaktionsvolumen, fügen Sie 115 ul von dH 2 O und 15 ul 3 M Natriumacetat, um die Reaktion. </li><li> Gründlich mischen fügen Sie dann 75 ul saurem Phenol und 75 ul Chloroform. Mischen Sie die Lösung durch Vortexen, dann Mikrozentrifuge für eine Minute bei 13.000 rpm bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen und die Extraktion </li><li> Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen und fügen 150 ul Chloroform. Vortex die Mischung und Zentrifuge wie zuvor. Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen. </li></ol></li><li> Recover die RNA durch Zugabe von zwei Volumen 100% kaltem Ethanol zur wässrigen Schicht und gut mischen. Gefühlt die Mischung für mindestens 15 Minuten bei -20 ° C dann bei 4 ° C zentrifugieren für 15 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zu Pellets der RNA. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 105 ul von 0,1 x Tris-EDTA (TE) Buffer .. </li></ol></li><li> Es ist schwierig, alle freien Nukleotiden aus der T7 Kit Reaktion zu entfernen, so dass für die genauesten Ergebnisse, Quantifizierung der RNA mit RiboGreen. <ol class="lalpha"><li> Zu Beginn der Quantifizierung zunächst verdünnt genug 1x TE, 2.300 ul + 50μL/sample. </li><li> Als nächstes machen RiboGreen. Sie wird 1000 müssen ul + 50 ul / Probe. Für eine hohe Reichweite Proben (1 pg / ml bis 20 ng / mL) mischen RiboGreen 1:200 in 1x TE, für den niedrigen Bereich Proben (50 ng / ml bis 1 ng / ml) mischen RiboGreen 1:2000 mit 1x TE ; Je 50 ul der RiboGreen Lösung in jede Vertiefung eine undurchsichtige Platte, beginnend mit A1 und nach unten bewegen, nicht über </li><li> Verdünnen Sie eine RNA-Stammlösung zu 2 pg / mL für hohe Reichweite Proben oder 100 ng / ul für niedrige Bandbreite Proben </li><li> Mit der Stammlösungen, erstellen Sie eine Standard-Kurve von sechs nachfolgenden 01.02 Verdünnungen der ursprünglichen 2 pg / mL bzw. 100 ng / mL Lager Pipette 240 &amp;mgr; l der Brühe in eine PCR-Streifen-Rohr. In den verbleibenden 7 Röhren, Pipette 120 ul 1x TE. Nehmen Sie 120 ul aus der RNA Lager gut verrühren und mit Rohr 2. Nehmen Sie 120 ul von Rohr 2 und mischen sich mit Rohr 3. Wiederholen, bis das Rohr 7. Rohr 8 wird nur TE und wird Ihre blank sein. Je 50 ul der Standardkurve-Lösungen in die undurchsichtige Platte, A1: H2 (run die Kurve zweimal) </li><li> In ein neues Rohr, Mix 45 ul TE mit 5 ul der Oligo-Pool und fügen Sie alle 50 ul einer gut, dass 50 ul RiboGreen enthält. </li><li> Mit einem Platten-Lesegerät das Gerät so einstellen las-Fluoreszenz von der Spitze nach einer Minute mischen sich mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und Emissionswellenlänge von 530 nm und lesen Sie die Platte </li><li> Verwenden Sie die Standardkurve generiert, um das gewonnene RNA zu quantifizieren, die bei -20 ° C aufbewahrt werden sollte </li></ol></li></ol> Co-Immunpräzipitation der Oligo-Pool mit einer RNP von Interesse <ol><li> Vor Beginn der Co-Immunopräzipitation, bereiten die Protein A und Protein G Dynabeads von Invitrogen, indem man sie in einem Verhältnis von 1:1 bis zu einem Endvolumen von 50 ul pro Reaktion. Zum Beispiel für zwei Reaktionen würden Sie mit 50 ul jeder einzelnen Perle. </li><li> Verwenden Sie einen Magnetic Separation Stehen wie dieses von Novagen, um die Perlen in Position zu halten, während Sie den Überstand zu entfernen und waschen Sie die Perlen zweimal mit dem gleichen Volumen kalten 1x PBS </li><li> Nach dem zweiten Waschen, resuspendieren die Kügelchen in einem gleichen Volumen kalten 1x PBS und mit 2 ng des Antikörpers pro Reaktion. Dieser Betrag kann je nach den Antikörper, so Experimente notwendig, um die optimalen Bedingungen zu finden. </li><li> Inkubieren der Antikörper / Perlen Mischung über Nacht bei 4 ° C auf einer rotierenden Plattform </li><li> Am Morgen, fügen Sie 2 g pro Reaktion beschallt Hefe-Gesamt-RNA, um unspezifische Bindung zu blockieren, und drehen Sie für weitere 30 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Mit dem magnetischen Rack an die Perlen zu halten, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Perlen zweimal mit kaltem 1x PBS, so dass die PBS aus dem zweiten Waschen in die Röhre. </li><li> Nehmen Sie neue Rohre, eine für jede Reaktion und aliquote 50 ul der Raupe Mischung in jedes Röhrchen. Lassen Sie die Kugeln sitzen, während der Vorbereitung einen Master-Mix </li><li> Für jede Reaktion mit 200 ng des Oligo-Pool, einem äquimolaren Verhältnis von Primern, 2 ug beschallt Hefe-Gesamt-RNA, 20 uL HeLa Kernextrakt (dies ist die RNP-Quelle) und Puffer E, um die Lautstärke zu bringen bis zu 120 ul. Der Schutz Primer sind RNA-Versionen der universellen Primern. Auftrag Transkription Vorlagen der Universal-Primer mit einem T7-Tag am Ende angehängt, dann transkribieren RNA aus den Vorlagen mit dem MEGAshortscript ™ Kit. </li><li> Entfernen Sie den Überstand von der Perle Aliquots und resuspendieren Perlen in 120 ul des Master-Mix. Rock the Reaktionen bei 4 ° C für 1-2 Stunden. </li><li> Nach der Inkubation für jede Reaktion, entfernen Sie ein kleines Aliquot (einschließlich der Perlen) für eine &quot;totale&quot; RNA-Proben </li><li> Platzieren Sie den Rest der Reaktionen auf die magnetische Trennung stehen und entfernen Sie den Überstand. Es ist zwar nicht notwendig, diese Flow-Through-Probe Downstream zu analysieren, kann es nützlich sein, um zu sparen. </li><li> Waschen Sie die Kugeln 1-2 mal mit 50 ul kaltem 1x PBS. Die RNA gebunden an den Antikörper auf den Kügelchen ist die &quot;IP&quot;-Probe. </li><li> Resuspendieren &quot;total&quot; und der &quot;IP&quot; Perlen in 50 ul 1% SDS in 0,1 x TE-Puffer und Wärme die Proben bei 65 ° C für 15 Minuten, um die RNA zu eluieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, der jetzt enthält die RNA, die zuvor an die Kügelchen gebunden war und sauber durch Phenol / Chloroform-Extraktion durch eine Ethanolfällung folgte. Trocknen Sie die Pellet resuspendieren und in 50 ul 0,1 x TE-Puffer. </li></ol> Reverse Transkription und Amplifikation von Co-IP-Proben in Vorbereitung für aminoallyl Kennzeichnung <ol><li> Als nächstes muss der RNA-Proben werden revers transkribiert und mittels PCR amplifiziert. Für die Reaktion der reversen Transkription, verwenden Sie die reverse universelle Primer. </li><li> Für jede Probe durch Mischen 1 ul beginnenumgekehrt universelle Primer, mit 1 ul der Template-RNA (aus der Immunpräzipitation Reaktion) und 10 ul dH 2 O. Erhitzen Sie die Reaktionen bei 70 ° C für 5 Minuten auf Eis kühlen oder halten bei 4 ° C. </li><li> Während die Proben kühl, die folgenden Master-Mix. Für jede Reaktion kombinieren 4 ul 10 mM dNTPs, 2 ul 10x Arrayscript Puffer, 1 ul RNase-Inhibitor und 1 ul reverse Transkription Enzym. Gründlich mischen und fügen 8 &amp;mgr; l des Master-Mix für jede Reaktion der reversen Transkription. </li><li> Verwenden Sie eine PCR-Maschine, die Proben bei 42 ° C inkubieren für 2 Stunden, gefolgt von 95 ° C für 5 Minuten, dann 4 ° C, bis die Proben sind für eine Verstärkung benötigt. </li><li> Nach reverse Transkription der RNA-Proben, verstärken PCR sie mit dem Universal-Primer, mit einer der Primer mit einem T7-Tag. Die Anzahl der Zyklen erforderlich, um den Pool verstärken wird auf die Effizienz der Zusammenarbeit IP hängen so kann es notwendig sein, um mehrere Zyklen zu versuchen. Jede Reaktion erfordert 5 ul 10x Taq Reaktionspuffer, 0,2 ul von jedem Primer (100 mM), 1 ul der cDNA-Template (aus der Reaktion der reversen Transkription), 1 ul 10 mM dNTPs, 42,2 ul dH 2 O, und 0,4 ul der Taq-Enzym. Beginnen Sie mit der PCR durch Inkubation der Proben bei 94 ° C für 3 Minuten. Als nächstes für jeden Zyklus, Denaturierung bei 94 ° C für 45 Sekunden, bei 55 ° C tempern für 30 Sekunden, und längliche bei 72 ° C für 1 Minute, mit einer abschließenden Elongation bei 72 ° C für 10 Minuten. </li><li> Als nächstes transkribieren die Proben erneut mit dem MEGAshortscript ™ Kit jedoch, fügen Sie diese Zeit 2 ul der aminoallyl UTP, anstelle des T7 UTP. Die aminoallyl UTP wird verwendet, um die RNA mit dem Cy-Farbstoffe zu kennzeichnen. </li><li> Phenol / Chloroform und Ethanol Fällung der Proben. Verwenden Sie KEINE Glycoblue oder Ammoniumacetat, können beide mit Hybridisierung der Proben auf das Array stören. Trocknen Sie die Pellet resuspendieren und in 4,5 &amp;mgr; l 0,1 M Natriumcarbonat. </li></ol> Amino-allyl Markierung von RNA mit Cy Dyes <ol><li> Zu Beginn der Kennzeichnung Protokoll löst jede der Fluoreszenzfarbstoffe, Cy3 und Cy5, in 45 ul DMSO. Um zu vermeiden, Licht, wickeln Sie die Rohre in Alu-Folie und bei -20 ° C im Dunkeln </li><li> Add 2,5 ul Nuklease-freies Wasser, um Proben RNA und gründlich mischen </li><li> Als Nächstes fügen Sie 3 ul der Cy3 die &quot;total&quot;-Probe, und 3 ul Cy5 die &quot;IP&quot;-Probe. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln für 1 Stunde bei Raumtemperatur; Die Cy-3 Probe wird rot oder rosa, während die Cy-5 wird blau. </li><li> Zur Beendigung der Reaktion, man 6 ul 4 M Hydroxylamin-HCl zu jeder Probe, mischen und Spin kurz. Inkubieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Purify der markierten Proben durch Phenol / Chloroform-Extraktion durch Ethanolfällung und Pellet in 50 ul 0,1 x TE gefolgt </li></ol> Hybridisieren Proben, die Microarray mit dem Agilent Array Hybridisierung Kit <ol><li> Beginnen Sie mit der Hybridisierung durch vorsichtiges Mischen 50 ul 10x Blockierungspuffer, 140 ul von Nuklease-freiem H2 O, 25 ul der Cy3-markierten &quot;total&quot; Pool, 25 ul der Cy5-markierten &quot;IP&quot;-Pool, 10 ul der 25x Fragmentierung Puffer und 250 ul der 2x Hybridisierungspuffer, wobei darauf zu achten Einführung Blasen. Microfuge die Probe kurz auf die Lösung in den Boden des Röhrchens zu sammeln und zu Blasen zu reduzieren. </li><li> Setzen Sie den O-Ring Deckglas in der Hybridisierung Kammer und sorgfältig Pipette die Lösung auf die Folie. </li><li> Legen Sie die Erkennung Array auf dem Deckglas zu &quot;Sandwich&quot;-Lösung. Denken Sie daran zu orientieren Array schieben, so dass die Agilent-Label auf dem Array steht die Agilent-Label auf dem Cover schieben. </li><li> Spannen Sie die Folie / array Sandwich in der Hybridisierung Kammer und drehen bei 50 ° C für 3 Stunden. </li><li> Während die Array rotiert, nehmen Sie die folgenden 50 mL Lösungen in 50-ml konische Röhrchen: eine konische gefüllt mit 50 ml dH 2 O, zwei 1x SCC Pufferlösungen, jeweils in einem separaten Röhrchen und ein 2x SCC-Puffer. </li><li> Nach der dreistündigen Inkubation sorgfältig ausspannen Array / Dia-Sandwich und legen Sie es in der 50 ml-Erlenmeyerkolben mit den 2x SCC-Puffer. Mit einer Pinzette vorsichtig trennen das Array aus dem Deckel schieben und ziehen Sie den Deckel schieben. Achten Sie darauf, das Array als die Folie herausgezogen berühren. Schließen Sie die konische und schonend für 60 Sekunden umdrehen. </li><li> Mit der Pinzette, übertragen Sie die Array auf die 1x SCC-Lösung, Kappe der Röhre, und sanft für 1 Minute dann invertieren Transfer des Arrays auf den zweiten 1x SCC-Lösung und wieder sanft für eine weitere Minute umzukehren. </li><li> Schließlich übertragen das Array in die Röhre dH 2 O und schonend für 30 Sekunden umdrehen. </li><li> Dry das Array, indem die Ränder der Folie auf einem Kimwipe. Fahren Sie mit dem Array auf drehen Sie das Tuch und achten Sie darauf nicht stören die Seite mit den Oligos. </li><li> Setzen Sie den trockenen Array inein leeres 50-ml konischen Rohr-und Scan mit einem Microarray-Scanner </li></ol> Die Interpretation der Microarray <ol><li> Die Microarray-Scanner wird ein TIF-Bild des Arrays. Führen Sie dieses Image durch die Agilent Feature Extraction Software, mit der Grid-Datei (im Lieferumfang von Agilent), die einzigartig auf Ihre speziellen Pool ist. </li><li> Die Agilent-Software wird das Signal an jedes Feature zu interpretieren, um eine Datei, die mit einem Perl-Skript analysiert wird erstellt. Das Signal an die einzelnen Funktionen, um die gesamte Intensität bei diesem Kanal zu normalisieren. Zum Beispiel bei einer bestimmten Funktion in den grünen Kanal, ist die Intensität der grünen Kanal für die einzelnen Leistungsstufen durch die gesamte Intensität des grünen Kanals über alle Funktionen unterteilt. Die endgültige Ausgabe wird das Protokoll Verhältnis der Rot-Kanal über den grünen Kanal in jede Funktion auf dem Array. </li><li> Die Oligo-Pool-Daten aus der Microarray kann wieder auf das Genom re-mapped sich ein Bild von dem zu bekommen, und wie stark, wird die gebundene RNP von Interesse. </li></ol> Abbildung 1. Experimentelle schematische <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" /> A. Kachelschemas. Nach Auswahl und Download pre-mRNA-Sequenzen von Interesse, ist die Auswahl Bereich durch in 30 Nukleotid-Fenster, die Verschiebung in 10 Nukleotid-Schritten gefliest. Universal-Primer-Bindungsstellen Flanke jeder Seite des Fensters. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1b.jpg" alt="Abbildung 1b" /> B. Synthese Array. Tiled Oligo Aufträge sollten an Agilent, wo die Sequenzen auf einem benutzerdefinierten Oligonukleotid-Microarray gedruckt werden eingereicht werden. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1c.jpg" alt="Abbildung 1c" /> C. Co-Immunpräzipitation. Nach dem Kochen die Oligos aus dem Array, inkubieren in HeLa Kernextrakt, fügen Sie dann den Extrakt auf magnetische Kügelchen, die mit einem Antikörper gegen das RNP von Interesse bereit sind. Beschriften Sie die Start-Oligo-Pool mit Cy3 und die gebundene IP-Pool mit Cy5 und gelten für den Nachweis Array und scannen. Abbildung 2. Anmerkungen des Genoms mit und Analyse von Daten Bereicherung. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> A. Konvertieren Sie die durchschnittliche Punktzahl bei jedem genomische Koordinate aus der Array-Daten zur Basis-ten anmelden und Karte, die Gäste zu den angegebenen Koordinaten. Eine Darstellung dieser Mittelung Schritt ist für 3 überlappenden 30-nt Oligos mit Noten von 2, 4 und 0,5, wo die durchschnittliche Anreicherung Punktzahl für jede 10-nt-Fenster oben graphisch gegeben. Die ausgewählten genomischen Regionen wird über einen benutzerdefinierten Track in der USCS Genome Browser. Das Beispiel Browser-Fenster gegeben ist in der CLTA Gen, wo Gen-Funktionen (Exons / Introns / alternative Spleißen etc.) entlang der unteren und mittleren log Bereicherung Partituren aus dem PTB-gebundenen Oligos gegeben sind, werden durch dunkle rote senkrechte Balken dargestellt. PTB stark bindet kurz vor Exon 2 in der Polypyrimidintrakt.

Wenn Sie dieses Verfahren ihr wichtig, dass die Schöpfung des Pools erinnere, ist flexibel und offen für Veränderungen entweder an der RNA-oder Protein-Ebene. Bei der RNA-Ebene orthologen Regionen, Krankheit Mutationen, Polymorphismen oder Mutationen können in der Oligonukleotid-Sequenz eingeführt werden. Bei der Protein-Ebene der RNA-Bindung Faktor kann durch Phosphorylierung oder andere post-translationale Modifikationen verändert werden. Darüber hinaus kann die Bindung Umfeld manipuliert werden, um entweder er...

a rapid high-throughput method for mapping ribonucleoproteins (rnps) on human pre-mrna

Sequencing RNAs, dass die Zusammenarbeit Immunopräzipitat (Co-IP) mit RNA-bindende Proteine ​​hat unser Verständnis von Spleißen durch den Nachweis, dass die Bindung Standort erhöht oft Einflüsse Funktion eines Spleißfaktor. Doch wie bei jeder Strategie der Probenahme ist die Chance, eines RNA gebunden an eine Spleißfaktor ist proportional zu seiner zellulären Hülle und Fülle. Wir haben ein neues in vitro-Ansatz für die Vermessung Bindungsspezifität auf sonst vorübergehende pre-mRNA entwickelt. Dieser Ansatz nutzt eine speziell Oligonukleotid-Pool, Fliesen in Introns, Exons, Spleißstellen oder anderen pre-mRNA. Der Pool ist eine Art molekulare Selektion unterzogen. Hier zeigen wir die Methode durch die Trennung der Oligonukleotid in einen gebundenen und ungebundenen Fraktion und nutzen zwei Farb-Array-Strategie, um die Anreicherung von jedem Oligonukleotid in der gebundenen Fraktion aufzunehmen. Die Array-Daten erzeugt hochauflösende Karten mit der Fähigkeit zu identifizieren Sequenz-spezifische und strukturelle Bestimmtheiten der ribonucleoprotein (RNP) verbindlich pre-mRNA. Ein einzigartiger Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Fähigkeit, die Probenahme Ausrichtung auf mRNA mit aktuellen IP und SELEX Techniken verbunden zu vermeiden, da der Pool speziell entwickelt wurde, und von prä-mRNA-Sequenz synthetisiert. Die Flexibilität der Oligonukleotid-Pool ist ein weiterer Vorteil, da der Experimentator wählt, welche Regionen zu studieren und Fliesen auf, Schneiderei am Pool auf ihre individuellen Bedürfnisse. Mit dieser Technik kann man Assay die Auswirkungen von Polymorphismen oder Mutationen auf die Bindung im großen Maßstab oder Klon der Bibliothek in einen funktionalen Spleißen Reporter und identifizieren Oligonukleotide, sind im Lieferumfang enthalten Fraktion angereichert. Dieser Roman in vitro hochauflösenden Kartierung Programm bietet die einzigartige Möglichkeit, RNP Interaktionen mit transienten pre-mRNA-Spezies, deren geringer Menge macht es schwer, sich mit aktuellen In-vivo-Techniken zu studieren.

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A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu studieren<em&gt; In vivo</em&gt;. Hier präsentieren wir eine neuartige<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ansatz zur RNA-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines synthetischen Oligo-Pool zu untersuchen, die Fliesen in ausgewählten Regionen der pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

11.7K Aufrufe.  Brown University. Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu studieren In vivo. Hier präsentieren wir eine neuartige In-vitro- Ansatz zur RNA-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines synthetischen Oligo-Pool zu untersuchen, die Fliesen in ausgewählten Regionen der pre-mRNA.

Serie: A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Forschung

Biologie

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Ein Verfahren zur Auswahl Struktur-Schalt Aptamere zu einem Farbmetrik Gold-Nanopartikeln Assay angewandt

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA