Wir danken Rachael B. Chanin und Alejandro Llanos-Chea für technische Hilfe. Wir danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski und Bobby Cherayil für die Stämme, die in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy und ansteckende Krankheiten Grant K22AI104755 (C.S.F.) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

1. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>Gallensalze Medium: um tryptic Soy Bouillon (TSB) mit 0,4 % Gallensalze (Gewicht/Volumen) vorzubereiten, Aufschwemmen 200 mg der Gallensalze in 50 mL autoklaviert TSB. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Wöchentlich machen Sie frisches Medium. Anmerkungen: Die Salze der Gallensäure routinemäßig verwendet, ist eine 1:1 Mischung aus Natrium Cholate und Natrium-Deoxycholate von Schafen und Rindern Gallenblase isoliert. Wie zuvor4gezeigt hat, war die Anwesenheit von Glukose für Galle Salz-induzierte Biofilmbildung erforderlich. TSB hat Glukose im Vergleich zu Luria-Bertani (LB) Brühe hinzugefügt; und daher war ausreichend induzieren Biofilmbildung in Shigella und die anderen enterischen Krankheitserregern analysiert. Abhängig von den Bakterien analysiert werden könnten verschiedene Glukosekonzentration oder verschiedene Zucker Anforderungen erforderlich sein.</li>
	<li>0,5 % w/V Kristallviolett im Wasser: 2,5 g Kristallviolett in 500 mL destilliertem Wasser auflösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren.</li>
	<li>Concanavalin A (ConA) konjugiert zu Fluorescein erfolgt (FITC): rekonstruieren die Aktie mit 1 X PBS-Puffer. Die 10 mg konzentriert-Aktie mit 400 μl 1 X PBS, eine Endkonzentration von 25 µg/mL zu verdünnen und vor Licht schützen.</li>
	<li>PBS + Glukose: 0,2 g Glukose in 10 mL 1 X PBS (2 % w/V Glukose final) auflösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.</li>
	<li>PBS + Gallensalze: Auflösen 40 mg in 10 mL 1 X PBS (0,4 % w/V Gallensalze final). Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.</li>
	<li>PBS + Glukose und Gallensalze: 40 mg Gallensalze und 0,2 g Glukose in 10 mL 1 X PBS (0,4 % w/V Gallensalze und 2 % w/V Glukose final) aufzulösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.</li>
	<li>LB-Agar-Platten vorbereiten.</li>
	<li>Formaldehyd/Glutaraldehyd Fix: Hinzufügen 810 µL Formaldehyd (37 %-Stammlösung, 3 % Endkonzentration) und 125 µL Glutaraldehyd (25 % Stammlösung, 0,25 % Endkonzentration) 14 mL 1 X PBS. Gründlich mischen und Lagerung bei 4 ° C. Das Update sollte für den bestimmungsgemäßen Gebrauch kalt sein. Achtung: Das Update ist giftig und Sondermüll Beseitigung erfordert.</li>
	<li>Antifade Eindeckmedium Lösung: Verwenden Sie antifade Eindeckmedium Lösung mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Fleck, um Immunofluoreszenz immunofluorescent Mikroskopie Proben zu hemmen, während eindringmittel Färbung der DNS des Bakteriums.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Bakterien
<ol><li>Wachsen Sie über Nacht Kulturen der Bakterienstämme impfen 3 mL TSB mit einer einzigen, gut isolierten Kolonie in einem sterilen Kultur Rohr getestet werden. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 225 u/min für die Inkubation über Nacht (16-24 h). Hinweis: Stämme sollten aus Gefrierschrank Beständen alle 2 bis 4 Wochen und gepflegt auf Platten nicht mehr als 2 Wochen alt restreaked werden.</li>
</ol>3. Einhaltung der Festphasen-Assay
Hinweis: Dieser Assay quantifiziert anhaftende Bakterien mit einer 96-Well-Platte-Methode. Bakterien werden statisch in flachen Bodenplatten angebaut. Waschen wird durchgeführt, um nicht-anhaftende Bakterien entfernen und anhaftende Bakterien sind mit Kristallviolett gefärbt. KRISTALLVIOLETT Fleck Peptidoglycan in der bakteriellen Zellwand bindet und mit Ethanol solubilisiert werden kann. Die Zahl der anhaftenden Bakterien wird anhand von Kristallviolett Aufbewahrung bestimmt.
<ol><li>Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + Gallensalze (BS).</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.</li>
	<li>Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).</li>
	<li>Fügen Sie in eine sterile, klar, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp (TSB und TSB + BS) getestet werden.</li>
	<li>Fügen Sie 130 µL/Well des beimpften Kultur in drei Vertiefungen und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.</li>
	<li>Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Steuermedium klar ohne Anzeichen von Trübung. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normalisieren, gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium mit einem Vakuum durch leichtes Kippen der Plattenrandes und langsam Absaugen des Mediums am unteren Rand des Brunnens. Achten Sie darauf, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bakterienpopulation befindet sich auf der Kunststoffoberfläche. Wenn während der Inkubationszeit EPS Matrix produziert wurde, wird die Matrix als einen weißen Niederschlag visualisiert werden. Stören Sie die EPS-Matrix nicht.</li>
	<li>Vorsichtig waschen der Brunnen einmal mit 200 µL steriler PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.</li>
	<li>Invertieren Sie die Platte zum Trocknen. Lassen Sie ein Minimum von 20 min trocknen. Hinweis: Da der Biofilm vor Verschmutzung gründlich getrocknet werden muss, kann das Protokoll angehalten bei diesem Schritt für ein paar Stunden oder sogar über Nacht sein. Die zusätzliche Trocknungszeit wird das Färbeverfahren nicht verändern, während unvollständige Trocknung Quantifizierung der Ergebnisse und der Reproduzierbarkeit auswirkt.</li>
	<li>Gut 150 µL 0,5 % Kristallviolett bis jeweils experimentell und Steuerung hinzufügen.</li>
	<li>5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.</li>
	<li>Der Brunnen einmal mit 400 µL destilliertes Wasser zu waschen. Das zusätzliche Volumen hilft, um passives Kristallviolett Fleck von den Seiten der Brunnen zu entfernen. Entfernen Sie das Waschen mit der Vakuumleitung.</li>
	<li>Die Brunnen fünfmal mit 200 µL destilliertes Wasser zu waschen. Entfernen Sie das Waschen mit der Vakuumleitung. Hinweis: Gründliches Waschen ist wichtig für die Quantifizierung. Wenn die leere Brunnen aus destilliertem Wasser sind und keine verbleibenden Kristallviolett Fleck enthalten, fahren Sie fort mit dem nächsten Schritt fort.</li>
	<li>Invertieren Sie die Platte trocken, vor Licht geschützt werden. Stellen Sie sicher, vollständige Trocknung der Platte wie oben erwähnt.</li>
	<li>Destain Brunnen mit 200 µL von 95 % Ethanol. Inkubieren Sie die Platte auf den Shaker für 30 min. Zur Vermeidung von Verdampfung, besonders bei höheren Temperaturen führen Sie diesen Schritt bei 4 ° C.</li>
	<li>Mit einem Teller Reader, Aufzeichnen der OD-540. Hinweis: Die Wellenlänge für maximale Absorption von Kristallviolett ist in der Nähe von 590 nm. Die Literatur berichtet eine Reihe von OD540 - OD5954,13,14,15,16 für Kristallviolett Absorption; So wählen Sie eine Wellenlänge zur Verfügung basierend auf der Platte-Leser.</li>
</ol>4. EPS-Matrix-Erkennung
Hinweis: Diese kostenlose Proben zu quantifizieren und visualisieren die EPS. In beiden Fällen EPS-Erkennung erfolgt anhand einer Lektin Polysaccharide zu binden. Das eindringmittel konjugiert Protein ermöglicht die Quantifizierung (Schritt 4.1) oder Visualisierung (Schritt 4.2).
<ol><li>Semi-quantitativen Nachweis von EPS<ol>
<li>Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.</li>
		<li>Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (eine 01:50 Verdünnung).</li>
		<li>Fügen Sie in eine sterile, schwarz, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden. Die Brunnen 130 µL/Well des beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.</li>
		<li>Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.</li>
		<li>Übertragen Sie das Kulturmedium auf eine klare 96-Well-Platte mit einer Pipette, idealerweise ein Mehrkanal-Pipette. Seien Sie vorsichtig, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bevölkerung und/oder der EPS befindet sich auf der Kunststoffoberfläche. Beiseite stellen.</li>
		<li>Die schwarze Platte für 15 min bei RT mit 200 µL/Well von Formaldehyd/Glutaraldehyd in 1 X PBS zu beheben.</li>
		<li>Während die anhaftende Bevölkerung Befestigung ist, bewerten Sie die überstehende Fraktion aus Schritt 4.1.6. Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Steuermedium klar ohne Anzeichen von Trübung. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment.<ol>
<li>Alternativ kann der gesamte Test in eine schwarze klar Bodenplatte erfolgen. Unter diesen Umständen die OD600 Werte aufgezeichnet werden können und das Kulturmedium können anschließend vor 4.1.7 Schritt verworfen werden. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normieren im Fall gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Entfernen Sie das Update und in den Sondermüll zu entsorgen.</li>
		<li>Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die PBS waschen mit der Vakuumleitung durch leichtes Kippen der Plattenrandes und langsam Absaugen der Wäsche am unteren Rand des Brunnens.</li>
		<li>150 µL/Well von 25 µg/mL ConA-FITC hinzufügen und 15 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie vorsichtig zweimal mit 200 µL PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 150 µL PBS in jede Vertiefung. Aufzeichnen die Fluoreszenz bei 488 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konfokale Mikroskopie Visualisierung von EPS-Produktion und Berechnung der Biofilm Dicke<ol>
<li>Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.</li>
		<li>Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).</li>
		<li>Richten Sie eine sterile 24-Well-Platte mit 12 mm Runde Glasdeckgläser steril. Drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen fügen Sie 400 µL/Well nicht inokulierten Kontrolle Medien hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden.</li>
		<li>Brunnen in zweifacher Ausfertigung 400 µL der beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen überzogen sind.</li>
		<li>Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.</li>
		<li>Bestätigen Sie visuell Wachstum in der TSB Zustand, Wachstum und EPS Niederschlag in der TSB (weiß) + BS Zustand und kein Wachstum und/oder weißen Niederschlag in sterilen Kontroll-Vertiefungen. Entfernen Sie die Überstände.</li>
		<li>Fix für 15 min bei RT mit 200 µL/Well Formaldehyd/Glutaraldehyd Lösung mit 1 X PBS-Puffer.</li>
		<li>Entfernen Sie das Update und Sondermüll zu entsorgen.</li>
		<li>Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.</li>
		<li>150 µL/Well von 25 µg/mL ConA-FITC hinzufügen und 15 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie vorsichtig zweimal mit 200 µL/Well von PBS.</li>
		<li>Mit antifade Eindeckmedium Lösung mit DAPI montieren. Hinweis: Die Lösung ist eine fertige, Glycerin-basierte Montage-Lösung mit DAPI für Erhaltung der fluoreszierenden Labels während gleichzeitig Färbung der DNS in bakterielle Zellen für die Visualisierung als eine gegenfärbung. Folgen Sie des Kits Wegbeschreibungen und Empfehlungen für Inkubationszeiten vor imaging Proben. Das DAPI Färbeverfahren kann durchgeführt werden, vor der Anwendung antifade Eindeckmedium Lösung, die keine DAPI enthält.</li>
		<li>Bewerten von konfokalen Mikroskopie. Auf einem confocal Mikroskop legen des Lasers auf 495 nm/519 nm Anregung/Emission für FITC Visualisierung. Legen Sie einen zweiten Laser auf 360 nm/460 nm Anregung/Emission DAPI zu visualisieren. Suchen Sie den Biofilm durch die Konzentration auf das DAPI-Kanal. Das DAPI und FITC Kanäle verwenden, um die volle Dicke bestimmen und legen Sie die obere und untere Grenzen imaging. Volle Dicke Z-Stapel Bilder aufnehmen von Aufnahmen jeder 0,25 µm nach dem Festlegen der Umfänge auf der Ober- und Unterseite des Stapels Z. Finden Sie für weitere Informationen über konfokalen Mikroskopie in Publikationen von Paddock Et al. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>Die 3D-Bilder in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) zu visualisieren die volle Biofilmbildung und berechnen Sie die Dicke der Biofilm zu rekonstruieren. Die durchschnittliche Dicke erhielt für S. Flexneri Galle-Salz induzierte Biofilme war 14 µm4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Dispersion Assay
Hinweis: In diesem Test wird die Demontage der Biofilm durch bakterielle Streuung erkannt. Hier Reife Biofilme werden festgelegt und anschließend (in der Regel am nächsten Tag), die Medien werden durch PBS ersetzt oder ergänzt PBS. Überstand Komponente wird dann bewertet, um die Anzahl der Bakterien quantitate, die von den Biofilm getrennt haben.
<ol><li>Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.</li>
	<li>Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).</li>
	<li>Fügen Sie in eine sterile, klar, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden.</li>
	<li>Drei Brunnen 130 µL/Well des beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.</li>
	<li>Statisch inkubieren Sie Platte-für 4-24 h bei 37 ° C.</li>
	<li>Bevor Sie fortfahren, zu wärmen, PBS, PBS + Glukose, PBS + Salze der Gallensäure und PBS + Gallensalze + Glukose auf 37 ° c Diese Reagenzien täglich frisch zubereiten.</li>
	<li>Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Medium ohne Anzeichen von Trübung klar. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normalisieren, gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium mit einer Vakuumleitung. Achten Sie darauf, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bevölkerung befindet sich auf der Kunststoffoberfläche.</li>
	<li>Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Wäsche mit 130 µL/Well des folgenden in drei Brunnen: PBS, PBS + Glukose, PBS + Salze der Gallensäure und PBS + Gallensalze + Glukose. Diese Reagenzien müssen auf 37 ° c vorgewärmt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37 ° c</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Platte aus dem Inkubator 37 ° C. Übertragen Sie die Überstände auf eine frische, sterile 96-Well-Platte.</li>
	<li>Mit einer 96-Well Platte oder Verdünnung Block 10-fach vorbereiten (01:10) serielle Verdünnungen des Überstands in sterilen PBS. Hinweis: Die Verdünnungsreihe sollte von unverdünnt bis 10-6 je nach Bakterienstamm zu prüfenden Bereich. Pilotprojekten können durchgeführt werden, um den optimalen Verdünnung zu ermitteln.</li>
	<li>Platte 5 µL jeder Verdünnung auf LB-Agar mit einer Mehrkanal-Pipette zu erkennen. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Zählen Sie Kolonien auf den nächsten Tag und Konto für den Verdünnungsfaktor, bei der Festlegung der Wiederherstellung koloniebildenden Einheiten (KBE). Um die prozentuale Dispersion im Vergleich zu den 1 x PBS Steuerelementsatz (100 %) zu berechnen, teilen Sie die Wiederaufnahme KBE aus jeder Behandlung Zustand durch die Erholung KBE von 1 X PBS Kontrollprobe. Hinweis: Routine Medien Platten für die bakterielle Belastung von Interesse können auch verwendet werden. Beispielsweise können Shigella auf Kongo-rot Platten beschichtet werden. Stellen Sie sicher, dass die Platten trocken für geeignete Stelle-Plating-Techniken sind.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Angaben.

Analyse der Biofilmbildung ist schwierig wegen der dynamischen Natur von Biofilmen und die Variabilität zwischen Stämmen, Materialien, Labors und Tests. Hier sind mehrere Strategien vorgestellt, um Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern nach Gallensalze Exposition mit experimentellen Erkenntnisse zur Förderung der Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Es gibt weitere Überlegungen zur Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. In allererster Linie, empfehlen wir die Durchführung von mindestens drei unabhängigen Expe...

Biofilmbildung ist eine wichtige bakterielle Überlebensstrategie induziert bei rauen Umgebungsbedingungen. Exposition gegenüber bakterizide Verbindungen wie Antibiotika oder Änderungen an Nährstoff oder sauerstoffverfügbarkeit induziert einen gestressten Zustand in Bakterien, die durch Biofilmbildung gelindert werden können. Ein Biofilm zeichnet sich durch bakterielle Bindung an eine Oberfläche oder andere Bakterien und wird begleitet durch die Sekretion von einer EPS-Matrix bestehend aus hauptsächlich Polysaccharide1,2,3. Biofilmbildung ist ein dynamischer Prozess, in dem eine Kaskade von Ereignissen in Bildung eines ausgereiften anhaftende Bakteriengemeinschaft1,2,3gipfelt. Bakterien produzieren Adhesins um die frühe Bindung während der Verschiebung adhäsin gen expressionsprofile zur Stärkung der Anlage während der Reifung der Biofilm zu erleichtern. Gleichzeitig tritt die EPS-Produktion zu beschichten der Bakteriengemeinschaft in einer Matrix, die Zellen vor den ersten Stressor zu schützen. Der Biofilm enthaltene Bakterien sind langsam wachsend; und als solche die meisten Antibiotika unwirksam macht. Darüber hinaus spart das langsame Wachstum Energie, bis Bedingungen ändern, um bakterielles Wachstum1,2,3bevorzugen. Nach die harten Bedingungen bestanden haben, Bakterien den Biofilm zu zerstreuen und wieder planktonischen Lebensweise1,2,3. Traditionell, Biofilmen auf Oberflächen eingehalten werden und eine anhaltende klinische Herausforderung wegen Infektion Stauseen auf Katheter und in Wohnung Geräte1,2,3vorhanden.
Biofilmbildung wurde kürzlich für mehrere magensaftresistenten Krankheitserreger beschrieben; Bakterien, die den Dünndarm oder Dickdarm4infizieren. Shigella -Arten, tritt Infektion im menschlichen Dickdarm nach einer Durchreise durch die Mehrheit des Magen-Darm-Trakt. Während der Passage durch den Dünndarm ist Shigella Galle ausgesetzt; ein Lipid-abbauenden Waschmittel abgesondert in den Darm zur Verdauung von Lipiden während gleichzeitig töten die meisten Bakterien5zu erleichtern. Enterische Krankheitserregern haben die einzigartige Fähigkeit, die bakterizide Wirkung der Galle6widerstehen. Unsere jüngsten Analyse verwendet in-Vivo-wie Kombinationen aus Glukose und Gallensalze, robuste Biofilmbildung in S. Flexneri demonstrieren sowie anderen Arten von Shigellen, pathogene Escherichia coliund Salmonellen4. Zuvor, Salmonella Enterica Serovar Typhi gezeigt werden konnte, bilden einen Galle-induzierte Biofilm durch einzigartige Besiedlung der Gallenblase während der chronischen Infektion7,8,9, 10. Darüber hinaus vorherige Forschung mit Vibrio11und Campylobacter12 gezeigt Biofilmbildung auf Galle. Daher die Analysen erweitert die Galle-induzierte Biofilm Formation Beobachtungen auf andere Krankheitserreger und helfen, um Demonstration der konservierten magensaftresistenten Erreger Antwort auf Galle zu etablieren. Im Gegensatz zu chronischen Biofilme in der bakteriellen Gentranskription ist begrenzt und Zelle Seneszenz kann auftreten,1,2,3schlagen wir vor, dass der Magensaftresistente Galle-induzierte Biofilm in der Natur mehr vergänglich ist. Diese vorübergehende virulenten Biofilm ist geprägt durch eine schnelle Demontage (gesehen in der Dispersion-Assay) und verbesserte Virulenz Genexpression beobachtet in den Biofilm Bevölkerung4,6. 
Wie Biofilmbildung eine facettenreiche, dynamischer Prozess und die Verwendung von Gallensalzen wie ein auslösende Faktor für die meisten enterischen Krankheitserregern nur vor kurzem beschrieben ist, sind die Werkzeuge und Techniken, die einzigartige und kreative Anwendungen der traditionellen Methoden. So sind die hier vorgestellten drei kostenlose Strategien, mehrere wichtige Eigenschaften der Galle Salz-induzierte Biofilmbildung erwachsenden bakterielle, Produktion von EPS-Matrix und Dispersion von lebensfähigen Bakterien von den Biofilm zu quantifizieren. Diese Techniken wurden in erster Linie für die Forschung mit Shigellagenutzt; und Bewertung der anderen enterischen Krankheitserregern erfordern daher, Optimierung. Dennoch positive Daten aus allen drei Tests unterstützen Identifikation von Biofilmen und reproduzierbare Protokolle für die Galle Salz-induzierte Biofilmbildung einführen.

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bile Salts</td><td>Sigma</td><td>B8756-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 12mm, round</td><td>Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flourescent plate reader</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal or Fluorescent Microscope</td><td>Nikon A1 confocal microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Shaking Incubator</td><td>New Brunswick Scientific Excella E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Plate Incubator</td><td>Thermolyne Series 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Biofilmbildung ist ein dynamisches, mehrstufigen Prozess, der in Bakterien unter rauen Umgebungsbedingungen oder Stresssituationen auftritt. Für enterischen Krankheitserregern wird eine erheblichen Stress-Reaktion während des Magen-Darm-Transports und nach Galle Exposition, ein normaler Bestandteil des menschlichen Verdauung induziert. Um die bakterizide Wirkung der Galle zu überwinden, bilden viele Enterische Krankheitserregern einen Biofilm Hypothese um zu überleben zu ermöglichen, beim Transit durch den Dünndarm. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Biofilmbildung durch Einhaltung der Festphasen-Assays sowie extrazellulären Polymeren Substanz (EPS)-Matrix-Erkennung und Visualisierung zu definieren. Darüber hinaus ist Biofilm Dispersion Bewertung vorgelegt, um die Analyse der Ereignisse, die Freisetzung von Bakterien bei der Infektion auslösen zu imitieren. KRISTALLVIOLETT Färbung wird verwendet, um anhaftenden Bakterien in einem Hochdurchsatz-96-Well-Platte Einhaltung Assay zu erkennen. EPS Produktion Bewertung ergibt sich aus zwei Assays, nämlich Mikroskopie Färbung der EPS-Matrix und semi-quantitative Analyse mit einem eindringmittel konjugierte Polysaccharid bindende Lektin. Zu guter Letzt wird Biofilm Dispersion durch Kolonie zählt und Plattieren gemessen. Positive Daten aus mehreren Tests unterstützen die Charakterisierung von Biofilmen und können genutzt werden, um Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in andere Bakterienstämme zu identifizieren.

In Abbildung 1wird in den meisten der sechs magensaftresistenten Krankheitserreger getestet nach dem Wachstum in Medien, die Salze der Gallensäure Biofilmbildung induziert. Eine deutliche Zunahme der anhaftenden Bakterien nach Gallensalze Exposition in fast allen Stämmen beobachtet wird getestet. Die Ausnahme ist Enteroaggregative E. Coli (EAEC); beachten Sie jedoch die induzierte Beobachtung der Δaaf mutierten...

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Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Dieses Protokoll ermöglicht dem Leser, Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in magensaftresistenten Krankheitserreger mit einem vielschichtigen Ansatz, um die dynamische Natur der bakteriellen Biofilmen zu erfassen, durch die Beurteilung der Einhaltung der extrazellulären Polymeren Stoffes Matrixbildung zu analysieren, und Dispersion.

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital. Dieses Protokoll ermöglicht dem Leser, Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in magensaftresistenten Krankheitserreger mit einem vielschichtigen Ansatz, um die dynamische Natur der bakteriellen Biofilmen zu erfassen, durch die Beurteilung der Einhaltung der extrazellulären Polymeren Stoffes Matrixbildung zu analysieren, und Dispersion.

Serie: Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Ein analytisches Werkzeug-Box für umfassende biochemische, strukturelle und Transkriptom Evaluation of Oral Biofilme von Mutans Streptokokken Mediated

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Protokolle zur Analyse von Shigelleninfektionen in Dickdarmepithelzellen

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte beim Verständnis und der Bekämpfung von Shigellen-Infektionen

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.

Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

<meta charset="utf8"></head><body>Messung der Migration und Biofilmbildung verschiedener Bakterien

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

Messung der Migration und Biofilmbildung verschiedener Bakterien

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Ein analytisches Werkzeug-Box für umfassende biochemische, strukturelle und Transkriptom Evaluation of Oral Biofilme von Mutans Streptokokken Mediated

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Methodologien für das Studium

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen

Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen

Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen

Messung der Migration und Biofilmbildung verschiedener Bakterien

Messung der Migration und Biofilmbildung verschiedener Bakterien